EL CONTEXTO HISTORICO Y LAS CONTRIBUCIONES FUNDAMENTALES; DE GREGOR MENDEL ALA INGENIERIA GENETICA. EL GENE COMO 1A UNIDAD. FUNDAMENTAL EN LA HERENCIA, En los Giltimos 150 afios hemos sido testigos de contribuciones fundamentales en Ia genética las cuales a su vez han permitido desarrollar la capacidad para manipular el material genético de las células y recientemente determinar la secuencia del genoma humano, Ciertamente la primera etapa de la genética se inicia con los experimentos del monje austriaco Gregor Mendel (figura 1), quien trabajando con plantas de chicharo demostré, en 1860, que las variaciones fenotipicas, es decir, las diferencias morfol6gicas entre los miembros de familias y especies, son el resultado de dife- rencias en elementos genéticos discretos, a las que més adelante se les Ilam6 “genes” y que se transmiten de padres a hijos conforme a ciertas reglas (1). Hoy sabemos que estos caracteres hereditarios, 0 ‘genes, se encuentran localizados en los cromosomas de todas las células de un organismo. ‘A principios de este siglo, los experimentos y las leyes de Men- del fueron redescubiertas entre otros, por Johnson y Morgan (2). Los trabajos de Morgan con la mosca Drosophila melanogaster, fueron cruciales para el establecimiento de la genética como una disciplina biol6gica. Con este organismo fue posible establecer, en ‘unos pocos afios, el primer arreglo de algunos genes en los cromo- somas, utilizando mutantes de este organismo y explicando el fe- némeno fundamental del “entrecruzamiento genético”, que implica el intercambio de informaci6n genética, es decir la recombinacion molecular del material genético a nivel de los cromosomas, que se a4 FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA, Figura t GREGOR MENDEL EL mone hotinioo Gregor Mendel (1822-1894) fue el primero en demostar los principios Désicos de las leyes de la herencia y, gracias @ su esfuerzn, nace la genética como una isciplina cientfica. Sus trabajos con guisantes y flores en el jarcin del monastetto cn ‘Moravia (aemualmente Repdblica Checa), le permiseron fomnular estos findamentes, que ‘Pemmanecieron ene! olvido hasta principios del siglo xx. localizan en el niicleo de las células (3). Durante esta ctapa de la genética, se establecieron los primeros mapas genéticos de algunos de los primeros organismos que hoy todavia se utilizan como modelos biol6gicos, De estos trabajos, queda claramente demos- trado que, en todos los seres vivos, los genes estén organizados de una manera lineal en Jos cromosomas, andlogamente al arreglo de os segmentos de una cinta que codifican para canciones en un cassette musical (figura 2), donde cada gene corresponde al segmento de la cinta que codifica para una “cancién bioldgica’, en este caso una proteina,TAGENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS ¥ HORIZONTES Figura TOMPOSICION Y¥ ORGANIZACION DE LOS GENES EN LOS CKOMOSOMAS Los crommomas son esruciras oelulafes que se encuentn locaizados en el wilco 16 see tine y esti formados por proicinas ¥ Acido desaxiibonuclciog (ON). 18 sae ernie genia reside en ef xa y los genes son sepmentos especiios de ss A rca Imada oss, Es importante reafcar que ccs ser vivo ene on nme SPS Sracoy eferente de czomenoms, con relacin a fos dems rganianaes vo [La INFORMAGION GENETICA RESIDE EN EL DNA DE LOS SERES VIVOS Ta siguiente etapa de la genética se centré en la identificacion del tipo de substancia quimica donde resicia ta informacion genética yen la identificacién de la estructura a nivel molecular de este ute” 1 Al Esta fase se inicia con los experimentos de Griffith en 1928 (0, quien descubri6é que utilizando material biol6gico rico &h cidos Aicleicos de un cierto tipo de célula, era capaz de transformar 0 transferis algunas caracteristicas de esta célula a otra que previa- tnente fuera tratada con este material y que originalmente no tenfa alguna de las caracteristicas de la célula original. Ast, logre transfor- mar células no virulentas de la bacteria Pneumococo pneumoniae, cacélulas virulentas capaces de causar enfermedad, mediante el tratamiento de éstas con material rico en dcidos nucleicos prove” niente de células virulentas. Quince afios después, en 1944, los in~6 FRANCISCO ROLIVAR ZAPATA vestigadores ingleses Avery, McLeod y Mac Carty (5), siguiendo los. pasos de Griffith, realizan una contribucion fundamental para la biologia, demostrando conclusivamente que la capacidad para trans- formar las bacterias no patogenas en patdgenas, reside en un solo tipo de molécula: el écido desoxinribonucleico o DNA (figura 3). ot Foote anit eerie, Sta cons xtraciode DNA Suro qne presi ‘pet! + tipo Sioacivade + tmcchuae de, ——— pe Coteins ts uaacodeDNA Sacre que presi Tel! + Sincoty + Evan de” + RA Pe Coloias ms panei setae caren men se ~QS-— ea ae is Pree eee tS a ae Figura 3 FHL DNA ESA SUBSTANCIA DONDE RESIDE LA INFORMACION GENETICA Avery y colaboradores, demesraron que el psa es la molécula doncle reside la informa «én genetic Eta demostracin la lograron al comprobar que el bxa dene la capacidad ‘de “transforma” un tipo de célula en oo. En este expemniento se log la transformacin de ‘tlulas de la bacteria Pneumococo del tipo IIR no vieulento I, en hacterias del tipo TS ‘irulento, mediante la utlzacion de oN purificado a parts de céllas tipo MHS, asf como ‘éhulas tipo HS inactivadas por calor. HI DNA de oélulas virulentas se puso en contacto ‘on células tipo TTR no virulento las cuales se traneformaron en vinulentas del tipo IS. {a prueba de que ef componente activo era DNA y no RX& o protenas se logré mediante el {uatamiento del ox Cy también del extracto celula), con enzimas como owas, vasa yk Droteasatripsina, que especficamente degradan Ds, RNA y proteinas, respectivamente. Mientras que los atamientos con masa y proteasa no tuvicron ningéin efecto en la hab lik de la preparacion del pw (y del extracto celular), para transformar las eéulas del tipo TR en el tipo Ili, el tratamiento con nasa, al degradar al ov, suprimié la actividad {e transformacion de la preparacin que contenia el xa de céfulas vinlentas, ste ex- Perimenio demostré conclusivamente que la informacién genética en las céllas resid, nel Dxay no en otto tipo de molécula biolégica como protelnas 0 wxIA GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS Y HORIZONTES. 7 La ESTRUCTURA DEL DNA La contribucién extraordinaria de Avery y colaboradores, que por cierto no ha recibido todo el crédito que merece, dio pie a que un importante esfuerzo cientifico se enfocara a mediados del siglo pasado, a determinar la composici6n y la estructura quimica de la molécula del DNA. Asi pues, en Inglaterra en 1951, el quimico Dekker y colaboradores (6), establecieron la estructura covalente del “es- queleto” de la macromolécula del DNa que claramente definié la unién regular 3-5! fosfodiester en el esqueleto de esta molécu: Igualmente importante fue el trabajo de Chargaff, el cual permit determinar las cantidades relativas de adenina, timina, guanina y citosina, las cuatro letras del alfabeto genético de todo ser vivo (figura 4), y demostrar que en cualquier pxa la cantidad molar de Ro Re Nk aon — nxn comin) | VAS CChosina (€) Figura [ESTRUCTURA DEL DNA: LAS BASES O LETRAS GENETICAS as bases presentes en fs cidos nuctecos, Tas bases guanina, adenina y citosina existen en el pxa y el axa. La timina sélo se encuentra en el ova yes substitida por el raciloen ela Estas bases, o letras genéticas, ‘estin unidas covalenremente al aziear desoximibosa, para formar asf los nucledkidos 0 -mondmeros del Dxa (ver figuas 5 y 7.8 [FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA adenina es siempre igual a la de timina y también que la cantidad de citosina es la misma que de guanina (7) (figura 5). El reporte de Avery y colaboradores indudablemente fue también el estimulo para que Franklin y Wilkins (8, 9), en Inglaterra, iniciaran a principi 1950, estudios sobre las propiedades fisicas del DNa, que les permitieron hacer la observacién fundamental de que el DNA purificado y cristalizado era capaz de generar patrones de di- fraccion de rayos X del tipo de un cristal donde claramente apa- recfan ciertos elementos significativos que indicaban caracteristicas de simetria en la estructura de esta molécula (figura 6). Figura ESTRUCTURA DEL DNA: APAREAMIENTO ENTRE BASES COMPLEMENTARIAS 1 px esti formado por dos hebras © cadenas complementarias (ver figura 7, Las dos hhebras permanecen unkdas entre sta través de las uniones quiimicas débiles (ipo puente de hidiogen), que se esablecen entre cada dos nucleéeclos complementatios. Lo ante= rior significa queen una molcula de DNs, siempre habré lamisma carcidad de adenina que de timina y la misma de ctosina que de guanina, tal y como fue demostrado por Chargafl, En la figura se muestran las uniones tipo puente de hidrSgeno que se forman entre tos, pares de bases complementarios T=A y OG.TO TA GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS ¥ HORIZONTES 9 Figura 6 [ESTRUCTURA DEL DNA: DIAGRAGAMA DE UN PATRON DE DIFRACCION DERAYOSX DE UN CRISTAL DNA Fl patrén de rayos X de un cristal de DNA fue clemento esencial para determinar la «estructura de doble hélice de esta molécula propuesta por Watson y Crick. A través de ba ‘técnica de cristalografia de rayos X, fue posible reconacer el patron central de simetta, en forma de ens, como un indicador de la estructura de doble hélice. La estructura tipo doble helice del pra genera patrones repetides en las regiones superior e inferioe que indican que ls bases se encuentran orientadas perpendicularmente al ee de la molecule ‘con uma pesiowlccad de 3.4 Angstroms (AD. Considerando toda esta informaci6n, James Watson y Francis Crick realizaron en 1953 (10, 11), una de las contribuciones funda ‘mentales, si no la mas, en la biologfa moderna: el descubrimiento 0 desciframiento de la estructura molecular del pva (figura 7). Indudablemente, es la estructura complementaria de la doble hélice del pna y el descubrimiento de Avery y colaboradores, los elementos que fundamentalmente demostraron que el DNA es en si mismo el material genético de la célula viva10 FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA Figua7 [ESTRUCTURA DE LA MOLECULA DEL DNA -HLpna es una doble héice donde cada tna de elas es un polimero integrado por nucleo tidos que son los mondmeros del polimero. Cada nucledtido est formato por una mole ‘cla de azar lamada desoxiibosa una base pica o pirimidica y un grupo fosfto, Las dos cadenas de Dia son antiparalelas y se unen entre sia través de enlaces tipo "puentes {de hidrégeno" que se forman entre ls bases complementarss (AT y G-C) entre las dos hebmas del ona (ver figura 5) De esta manera se obtiene una estructura po doble heli, onde ls bases nitrogenadas de los niclectidos se encuentran orieaadas hacia el interior Ue la doble helice y los grapos fosfato,y las azticares desoxitibosas, hada su exterior, for- mando los esqueletos fosfodiester de cada hélice. Los nucledtides se encuentran ‘Sepaiddos entre i por 3.4 y cada diez pares de nuclestidos (34 ), se alcanza una vue dela hélice. Hoy podemos decir, por lo que conocemos sobre el DNA, que el descubrimiento de su estructura quimica, ha venido a ser uno de Jos elementos unificadores en la biologia moderna ya que no s6lo J estructura del DNA ¢s la misma en todos los seres vivos, sino que ademis, la organizacion y regulacién de los genes, que son fragmentos 0 segmentos especificos de esta hélice doble, también tiene en lo general, cardcter universal en todos los organismos vivos. Esta caracteristica es lo que posteriormente en 1973 permitié el nacimiento de la ingenieria genética, metodologia mediante la cual es posible “la edici6n, a nivel molecular’, de este material tal yLA GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS Y HORIZONTES, cr como lo veremos en detalle en el capitulo siguiente, Podriamos decir como analogia con las cintas de videocassette, que el material genético de todos los seres vivos tiene e! mismo “formato”, y que por ello se pueden “editar molecularmente” en un tubo de ensayo nas de diferentes origenes. Es relevante insistir en que la estructu- ra general del pNa es exactamente la misma en todos los seres. vivos, desde las bacterias hasta nosotros, es decir, el va es una do- ble hélice formada por dos polimeros antiparalelos y complemen- tarios. Cada una de estas dos hélices o polimeros est4, a su vez, integrada por mon6meros que son como las cuentas (monémeros) en un collar (polimero). Hay s6lo cuatro tipos de monémeros 0 letras genéticas en el DNA de todos los seres vivos, los cuales son llamados nuclestidos y éstos estin localizados a 3.4 A del siguiente monémero en el polimero que forma cada una de las dos hélices. ‘Ademis, en todo tipo de pxa, a un nucle6tido con la base adenina le corresponde siempre, en el nucledtido de la hebra o hélice complementaria, uno con la base timina y a todo nucledtido con la base guanina comesponde un nucleétido con la base citosina en la hebra complementaria (figura 7). Estas son reglas universales para todos los pas en todos los seres vivos. La diferencia funda- ‘mental entre todas las moléculas de pNa que forman los diferentes cromosomas de los seres vivos, es la secuencia de los millones de estos cuatro tipos de nuclestidos con sus bases, A, T, G, C en cada molécula de DNA, de la misma manera en que solo existen 28 letras en el alfabeto para formar todas las palabras y es la secuencia diferente de estas letras en las palabras lo que da un significado distinto para cada una de elas. EL DNA; SU REPLIGACION Y TA SINTESIS DE PROTEINAS Habiéndose descifrado la estructura del pva en 1953, los esfuer- zos se concentran entonces, en determinar los mecanismos mo- leculares que tiene la célula para contender con tres aspectos biolégicos fundamentales: a) la replicacién de su material genético y su transferencia a las siguientes generaciones; b) la sintesis de12 FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA proteinas a partir de la informaci6n genética que reside en el DNA ¥ ©) la expresion de los genes en los cromosomas. La comprensi6n de estos mecanismos moleculares se alcanza, en términos gene- rales, en las siguientes dos décadas. Para 1975, se tenfa claro que el DNA, gracias a su estructura de doble hélice, era capaz de dar lugar; mediante el fenémeno llama- do de replicacién propuesto también por Watson y Crick, a dos dobles hélices idénticas a partir de la doble hélice original. En este fenémeno, cada una de las cadenas de la hélice doble original sirve de molde para la sintesis de una nueva cadena complementaria, tal y como fue demostrado por Meselson y Stahl, generandose asi dos dobles hélices iguales, una de las cuales se transfiere a la progenie y la otra permanece en el organismo original (12, 13), (figura 8). Asimismo, gracias al trabajo pionero de Crick, Brenner, Nirem- berg y Ochoa entre otros (14, 15, 16, 17, 18, 19), fue posible des- ctibir los mecanismos generales celulares involucrados en la decodificaci6n de la informacién genética por la célula para dar lugar a la sintesis de proteinas, mediante la propuesta y com- probacién de los mecanismos de transcripcién del DNA en RNA ‘mensajero y traducci6n de este RNs en proteina (figura 9). El primer paso en la sintesis de proteinas es la sintesis 0 forma- cién de una molécula de ena, denominada kNA mensajero (Nam), usando como molde una de las dos cadenas del pxa (figura 10). El RNA es una molécula quimicamente muy parecida a una de las hebras del xa ya que también esta formado por cadenas lineales de nucledtidos, por lo que la informacion genética contenida en el NA, es decir, el orden de deoxirribonuclestidos de una de las héli- ces del na, se transfiere uno a uno, a una secuencia de ribonucled- tidos complementaria durante la sintesis del rvam, La transcripcion © sintesis del xa es un proceso enzimatico mediado por la enzima RNA polimerasa que siempre ocurre, al igual que la replicacion del DNA, en la direcci6n 5'a 3’, y normalmente, s6lo una de las cadenas del pxa es transcrita en una molécula de RNA mensajero (Figura 10). as protefnas son las moléculas biologicas que realizan la mayor parte de las funciones celulares y la funcién de cada proteina esta determinada por su estructura, tal y como veremos mas adelante. ElLA GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS ¥ HORIZONTES 3 1 2a, cuplicacin, PHO Wenn ta aaa —~..99000000u ROCHON SF ance br sited en 1 62 dati TIATGETCGAATTO PACGAGCTEEARS Figura 8 REPLICACION DEL DNA, 1a replicaci6n del pa es el fenémeno que permite el copiado de una doble helice de DNA, _generando dos dobles hélicesidénticas a a onginal 1a informacion genética contenida en las moléculas de DNA es perpetuada mediante la replicaciGn. Durante la replicacion, las dos cadenas se separan y cada uns sirve para sintetizar una nueva cadena complementaria. Fste proceso tiene dos caracteristicas intrinsecas: 1) €s *semiconservado", ya que una de las dos cadenas de la molécula original pasa intacta 2 cada una de las moléculas hia, mientras que la otea se sintetiza de noe, yy ID sieinpre procede en direcciin 51a 3.14 PRANCISCO BOLIVAR ZAPATA PROTEINA Figura 9 ELDOGMA CENTRAL DELA BIOLOGIA El dogma central de Ia biologis molecular indica el flujo de la informacion genética En el ‘ka se encuentran los genes, en todas las células de los onganismos vives. A part de la {nformaci6n loealizada en esta molécula de doble hice, una cella sineaiza todas sus broteinas, Esto se lleva a cabo mediante dos mecanismos: la transcripcion, que es la sitesi de moléculas de ma mensajero usando regiones especificas o genes del Oka como templado o molde, y la taduccin, que es la sintesis de protcinas a través de la “ieetura™ de las moléculas del va mensajero en los ribosomas. Ademis el ons, como ya se ha ‘mencionado, tiene la funcién de autoreplicase. DNA es una molécula, que es el resultado de polimerizar (unir en forma de cadena), varios millones de los cuatro diferentes nuclcoti- dos (A, G, C y 1D; las proteinas también son polimeros biologicos que estén constituidos por decenas o centenas de veinte diferentes tipos de monémeros llamados aminodcidos. Por esta raz6n, no puede haber correspondencia de un aminosicido por cada uno de los nucle6tidos que integran los genes y la consecuencia es que ‘cada uno de los aminodcidos de una proteina debe estar “codifica- do” por un grupo de nucleétidos. Al descifrar el cédigo genético se comprobé, de facto, que cada aminoicido esté codificado por un15 1A GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS ¥ HORIZONTES ‘und upPeamoa ¥| ap au 1s A sepyp| uos sep eA $2 ovafesuaut wi ap YN>9I0U! Up fp th ‘offany 4 ‘Sawoweona seINBD seraunod vor wu | sox! Seppmpasd 0 ‘OmsVSNIY VN TAC SISHLNJS V1 ALU NODARDSNVAL V1-AC ONANONG EL a1gop euapes ap VNC ‘seogpaciso seurioxd sees 0 Bun sen aIIS uo ensont 25) afoot Wt 2p SEROMA SE] or emg16 [FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA grupo de tres nucleétidos, al que se le denomina triplete o cod6n, Se determiné también que en varios casos, mas de un triplete codifica para un mismo aminoacido y que algunos tripletes codifican para seftales de terminaci6n o iniciacin para Ia sintesis proteica. Este cédigo genético es universal ya que es el mismo para todos los seres vivos y se muestra en la figura 11. Ta informacién genética contenida en cada molécula de eam, que es copia fiel del pa, es traducida en moléculas de proteinas en un proceso enzimatico que se realiza en los organelos celulares lamados ribosomas. En este mecanismo biosintético participan principalmente tres tipos distintos de Rwa: el na ribosomal (knar), que junto con varias proteinas forman los ribosomas; el RNAm, que acarrea la informacién genética contenida en el pna y finalmente, los na de transferencia (kvat), que sirven como adaptadores especificos para cada aminoacido, durante el ordenamiento lineal de éstos en la sintesis de proteinas, conforme la secuencia del rwam (figura 12). La sintesis de proteinas, que de facto, es la traduccion del mensaje del nna, se lleva cabo también en direccion 5' a 3', mediante la polimerizaci6n de aminodcidos en protefnas, a nivel de los ribosomas. Este proceso es similar al que ocurre al pasar una cinta de un cassette musical por una grabadora, en donde la infor- maci6n para cada canci6n, que est contenida en un segmento de cesta cinta, es traducida en melodia cuando esta secci6n de la cinta del cassette pasa a través de las cabezas lectoras de la grabadora. En el caso de la célula viva, la cinta corresponde al rN mensajero que lleva la informaci6n y los ribosomas corresponden a las cabe- zas de la grabadora que len la cinta y transforma (traduce) la infor- macién en proteinas, las cuales serian en analogia, las melodias 0 “canciones biolégicas” (figura 13).IA GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS ¥ HORIZONTE, biz, teenie [Stee 213 ole (sla te ra 3/8 Figura 11 ELCODIGO GENETICO ES UNIVERSAI. EL codigo genético es universal, es decir, €8 utizado de la misma manera por tos los seres vivos. Este cédigo es el que permite a la célula de cualquier organismo, traducie en proteinas la informacion genética almacenada en los genes que se localizan en el DNS. Las proteinas son polimeros o grancles collares hiolégicae en los cuales cada aminoacido (© cuenta det colla) es un mondmero (ver Ngura 16) Son veinte diferentes aminoacids con los que cuenta la célula para integrar las més de cuarenta mil proteinas del cuerpo hhumano, Se puede hacer una analogia entre letras del alfabeto que serian los aminosci- dos, y las palabras que serian las proteinas; el orden de las letras es responsable del signi- ficado de las palabras, de lx misma manera que el orden de los aminodcidas en la proteina es responsible de su significado © funcion biolgica. Cada uno de los veinte dlferentes aminoscidos, a su vez, esti coeificado por un triplete 0 codén, de tres nuclest= dos, nivel del ava mensajero (0 del gene que dio origen a és), En un cédigo de cuntro ltrs genéticas (AGC) organizado en tripltes, puede haber 64 ciferentes tripletes. 14 figura muesira estas 64 posibles combinaciones; como puede verse hay aminofcidos que estin codificados hasta por seis cliferentestripletes, como Jeucina (lew), y hay aminodcidos como triptofano, (up) que s6lo est coxificado por un solo triplete (en este caso TGG). Existen tes codones TGA, TAA y TAG, que son tripletes due al Ieerse en Jos ribosomas son responsables de que se termine el proceso de trans- cripeidn;o sea se termina en este punto la sitesis de una molecula de proteinas y ésta se libera de los ribosomas para ser utilizada por la célula de acuerdo con su funcién Diol6gica (ver figuras 12 y 13).18 FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA, 7@.0n Sitio de unin de © —Ananades E Cadin IO Codénd Codéin8 Colin? Codin6 CodinS Coins Codéas Figura 12 SINTESIS DE PROTEINAS: EL RNA DE TRANSFERENCIA Bl segundo tipo de componente en la sintesis de proteinas son los Ilamados eva de transferencia (vat). Estas moléculas de axa, de no mas de 120 nucleétidos, estan altamente estructuradas y sven como adaptadores de cada un de Ios vein diferentes aminoacids que son los monémeros que integran Ine proteinas. De facto, los mA de ttansferencia son Jos “lectores-traiuctores" del na mersajero, y existe al menos tin INA de transferencia para cada uno de los veinteciferentes aminodcidos, El trplete en el asa oyOMOAd ou #6 wstaousyed var ease | $9 Ty UgpIsOd HUD EPRUT COYNE 3p ss sopeumiowsp soaunfucy sop aun [Pp woos so ‘rouapyp msm ooo mmcucoas ap zed epg 01- wo Jou e] ap sissIe ep 28 jap souranx soy 9p >PPZIPOO| VNC ap Ueas uN $9 109 Porpfesuow ya jp stso1u bj watuiad & ue;n¥as anb Snap $9 ‘oud woLowona 1AGENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS Y HORIZONTES, 29 regiones cercanas (o traslapadas) al promotor, Estas proteinas ‘moduladoras estén, a su vez, codificadas por genes reguladores. En el caso de la represion, la proteina moduladora llamada srepresor” se une a la regién regulatoria, llamada “operador”, que es normalmente una regi6n del pNa que incluye parte del promotor (igura 18), En el operador se ejerce el control negativo, ya que la interaccién de una molécula del represor con el operador, bloquea la transcripci6n del gene al impedir que la na polimerasa se una al promotor. En contraste, mediante un gene activador y su producto, se ejerce el control positivo, ya que a través de la interaccion de una molécula reguladora, llamada “activador”, con cierta regi6n del Na, se propicia que inicie el fenémeno de la transcripci6n. El represor activo esti constituido por una proteina, codificada por un gene regulador, a la que se le une una molécula receptors, Dicha proteina, que no despliega actividad de represor por sf misma, recibe el nombre de “aporrepresor’, y la molécula recep- tora se denomina “correpresor”. La funci6n del correpresor consiste en incrementar la afinidad del aporrepresor por los sitios de interacci6n con el DNA (operadores), y su concentraci6n refleja ademés, las condiciones metabélicas prevalentes. Con este tipo de ‘estrategias y elementos, un organismo puede “apagar” o “prender” Ja transcripci6n o expresion de un gene u oper6n, como respuesta a cambios en su medio ambiente. El efecto contrario a la represion de la transcripci6n es la induc- Gi6n, Este proceso es mediado por otras moléculas pequefas, los inductores, que su vez se unen al represor disminuyendo su afinidad por el operador, De esta forma, la célula puede volver a iniciar la expresion de un sistema genético. a represion y la induccién son mecanismos mediante los cuales se modula la expresion de los genes y las moléculas efectoras (contepresores ¢ inductores), estin cercanamente relacionadas son productos de las vias metabélicas que regulan algunos ‘operones y genes que estén naturalmente reprimidos y s6lo son inducidos cuando las condiciones metabélicas asi lo demandan. Estos sistemas, denominados “sistemas inducibles”, suelen ser de caricter catabélico y confieren al organismo la habilidad de adap-30 [FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA, Gen reguador PromotorOperador Gen estructural 1 Gen estructural | ‘i Seales lle } B ! pe hea eter | | ‘Suindeate Mom tatecomediaien me Prt at ~ lorraine Figura 18 |MECANISMOS DE REGULACION GENETICA. Los mecanismos de regulaciéa de la ranscrpcion mus frecuente utlizados en las calas ‘de microorganismos procariontes son les siguientes: A) regulacién postiva; B) regulacion, ‘negativa; © regulacién mulivalete y D) regulacién auygena. Una explcacion detalles {de estos mecanismos se presenta en ol text.1A GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS Y HORIZONTES 31 c Gen regulador PromotorOperador Gen estructural Gen estructural 2 Pent ee aap es awhw pone anions =< \ | Sutetrate Eten, Intermenin LD, =H, Avecrpresoe D PremotanOperadar tetire!! Gox rata? 10000000000000000000000000000% eee regi a?32. FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA tarse a cambios en la disponibilidad de nutrientes. Por lo general, Jas moléculas pequefias que actitan como receptores de las protet- nas regulatorias, son substratos de las vias metabélicas. En la figura 18-A se esquematiza este mecanismo. El caso inverso son los operones o genes que se encuentran naturalmente inducidos y que sOlo se reprimen en caso de que sus productos no sean necesarios. Estos sistemas, que se denominan “sistemas represibles’ son de cariicter generalmente biosintético, y capacitan al organismo para utilizar productos presentes en el medio ambiente en vez de tener que sintetizarlos de novo. Las moléculas receptoras en estos sistemas suelen ser los productos, finales de las vias biosintéticas. Este mecanismo se ejemplifica en la figura 18-B, En algunos casos las vias biosintéticas estin ramificadas, es decir, las enzimas codificadas por un operén catalizan la sintesis de mas de un producto. En tales circunstancias opera un mecanismo de regulacién conocido como ‘represién multivalente”. En este caso, el aporepresor no puede ser activado exclusivamente por ninguno de los productos finales de las vias biosintéticas y solamente se activa cuando todos los correpresores correspondientes se unen al aporrepresor. En la figura 18-C se esquematiza este mecanismo. Los ejemplos presentados en la figura 18-A, B y C, representan sistemas de represi6n-inducci6n mediados por moléculas que forman parte de las vias metabélicas. Sin embargo, en ciertos casos, el aporrepresor es el producto directo de un gene estructural y entonces, se encarga de su propia regulaci6n. Este mecanismo se denomina “regulacion aut6gena” y en muchos casos el gene que ejerce dicha regulacién desempefta una funci6n dual, ya que ademas de ser el aporrepresor, puede actuar también como una enzima. En la figura 18-D se ilustra este mecanismo. Ademés de los mecanismos en que intervienen operones 0 genes individuales, los sistemas procariontes tienen la capacidad de regular simultineamente varios genes u operones a través de algu- nas moléculas comunes. Los mecanismos individuales capacitan al ‘organismo para responder con un elevado grado de especificidad, a las condiciones del ambiente. Los mecanismos de regulaci6n si-LA GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS Y HORIZONTES, 33 multinea, por su parte, permiten al organismo coordinar grupos de respuestas. ‘Una vez que la enzima Kwa polimerasa se une al promotor de un gene, se inicia la transcripcién, sintetizandose RNam, el cual es elongado con la adicién de nuclestidos complementarios corres- pondientes a la secuencia del pva. Una vez sintetizado este nvm, como fuera seftalado, es posteriormente traducido en los riboso- mas para sintetizar proteinas. Es relevante sefalar que existen mecanismos adicionales que permiten modular la transcripcion del kNAm., Entre estos mecanismos vale la pena seftalar el llamado “efecto de atenuaci6n’” el cual es un mecanismo que permite, a tra- vés de modular la estructura del RNAm, atenuar su lectura a nivel de los ribosomas (21, 22, 23, 24, 25, 26). ii) Control a nivel de la traducci6n del RNA mensajero Se ha seftalado que los niveles de expresién de un gene estén determinados por la transcripci6n de su ram y por la traduccion de éste en los ribosomas. La regulaci6n a nivel de la traducci6n del RNA mensajero explica el porqué en muchos casos las enzimas codificadas por un mismo operén son sintetizadas en concen- traciones diferentes. Lo anterior se debe a que la traduccion de ciertos nNam poligénicos puede comenzar no sdlo en el extremo 5! del mismo, sino ademis en sitios internos del mensajero. La iniciacion de la traduccion del ram depende de la existencia de un grupo de nucleétidos en el RNam localizados en la region anterior al cod6n de iniciaci6n. Esta secuencia se denomina “sitio de unin ribosomal!” y su secuencia es complementaria al extremo 3) del RNA que constituye la subunidad pequefta del ribosoma. En este punto las bases del ena ribosomal y del eam se asocian, inickindose asi la traduccion del mensajero (27, 28). Existen pro- teinas que modulan Ia union del rvs mensajero a la subunidad pequefta del ribosoma y por ello puede darse el efecto de una traducci6n diferencial.‘FRANCISCO BOLIVAR ZAPATA b) Regulacion genética en eucariontes Indudablemente las células de organismos superiores tienen me- canismos de regulacion genética que comparten elementos generales con las bacterias. Sin embargo, entre las células de organismos unicelulares y pluricelulares hay una diferencia im- portante: la diferenciacién morfologica y funcional inherente a las células de organismos pluricelulares. Ello requiere de mecanismos de control preciso de la expresion genética en las diferentes células del organismo, de modo que las células diferenciadas realicen sus funciones de manera adecuada. Contrariamente con Jo que sucede a los procariontes, en el caso de los eucariontes la regulacién de la expresién genética es bas- tante mas complicada y se sabe menos de ella, Por ejemplo, en las Células de los eucariontes hay varios sistemas genéticos encargados de transcribir la informaci6n del DNA en copias del evam,; es decir, hay varios sistemas de nna polimerasa. Ademis, el DNA se encuentra no sdlo en el nticleo sino también en mitocondrias y cloroplastos, ‘Sin embargo, se han descrito varios tipos de secuencias regula- torias en los organismos eucariontes en donde algunas de ellas guardan similitudes importantes con las regiones de regulacion de Jos procariontes, aunque también se han descrito otras que tienen caracteristicas diferentes, Hoy en dia, gracias al Proyecto del Geno- ma Humano, y a otros proyectos que han permitido determinar la secuencia de todos los genes en varios genomas de diferentes onganismos, como se verd en capitulos posteriores, se tiene ya una gran colecci6n de genes de animales superiores, incluyendo a los de la raza humana, que han permitido empezar a tener una idea mis clara de la manera en que se regula la expresiOn de los genes en plantas y animales incluyendo la especie humana (CARACTERIZACION DE 10S PROCESOS ¥ DE LAS HERRAMIENTAS CELULARES Regresando a mediados de los 70, a escasos veinte afios después del descubrimiento de Watson y Crick que demostré que el DNA eraTA GENETICA MODERNA: FUNDAMENTOS Y HORIZONTES 35 Ja substancia donde residia la informaci6n genética y del descifra- miento de su estructura, la raza humana habia descubierto los mecanismos fundamentales de emo es que la informacion gené- tica es capaz de ser utilizada por la célula para sintetizar las prote nas, de como los genes estaban estructurados en el DNs, de manera aniloga a los segmentos que codifican para las canciones en una cinta musical, y de c6mo, en términos generales, se transcriben 0 se expresan y se regulan los genes. Un producto adicional de todo este avance y conocimiento fue que la humanidad empezaba a entender cudles eran las proteinas en el interior de la célula responsables de manejar i7 vivo su mat rial genético; es decir qué proteinas, con qué actividades enzi ticas, podian modificar y regular, in vivo, la expresion del DNA. Asi, en 1970, Arber, Smith y Hamilton (29, 30, 31), descubren, como parte de este esfuerzo encaminado a entender mas detalla- damente las funciones de regulacin y organizacion genética, las llamadas enzimas de restriccin, que son proteinas que cortan el DNA en sitios especificos, como “tijeras moleculares” y que reco- nocen secuencias especificas de bases en el DNA. En ese tiempo también Berg y Jackson (32), descubren el uso de la enzima ligasa de DNa que es utilizada por la célula para formar uniones covalen- tes entre moléculas de DNA. ‘Asi, todo el escenario estaba preparado para que en 1973, Cohen y Boyer (33), realizaran su experimento histérico en donde por primera vez se demostré que usando in vitro, es decir en un tubo, de ensayo en el laboratorio, estas herramientas celulares, fue posi- ble insertar el pNa de una rana en el DNA cromosomal de la bacteria Escherichia coli. Con este experimento se construye el primer onganismo transgénico y se da inicio la era del manejo in vitro de la informaci6n genética, o la edicién molecular del material genético, mediante la metodologia llamada ingenieria genética 0 de DNA recombinante, En el proximo capitulo se describen estas herra- mientas y métodos y se detalla su uso para aislar, caracterizar y manipular el va.