Qumica combinatoria en biomedicina: una nueva

estrategia en el desarrollo de antibiticos

M. Vilar, T. Carbonell y E. Prez-Pay Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular,
Universidad de Valencia, c/ Dr. Moliner no 50, 46100 Burjassot (Valencia).
Tras varias dcadas de uso abusivo e indiscriminado de los antibiticos se ha llegado a
una situacin en la que se han seleccionado cepas bacterianas resistentes y que, por
tanto, tienen incrementada la virulencia del patgeno en su mecanismo de infeccin. La
propagacin de estas cepas resistentes a los antibiticos hoy conocidos (unos 160
compuestos) (1) es un grave problema y se apunta como una de las principales causas de
muerte en el prximo milenio. Basta con mencionar que enfermedades como la
tuberculosis, la fiebre tifoidea, la meningitis, la neumona y las septicemias son cada vez
ms frecuentes en zonas donde se pensaba que ya estaban erradicadas; las mismas
bacterias que durante mucho tiempo haban sido controladas con antibiticos, son ahora
invulnerables. Es por esta situacin de alarma por lo que surge la necesidad de
desarrollar urgentemente nuevos compuestos activos. Un ejemplo de esta situacin lo
tenemos en Streptococcus pneumoniae, que en los aos 1940 era sensible a la penicilina;
concentraciones tan bajas como 0,01 g/ml no slo inhiban su crecimiento sino que,
adems, provocaban su lisis. En cambio, tras varios aos de tratamiento con penicilina, la
concentracin mnima inhibitoria (CMI) pasaba a ser mayor de 4-8 g/ml (ya en la dcada
de 1970). Estas cepas de S. pneumoniae no sensibles a la penicilina se han distribuido
por todo el mundo y, ms an, la mayora de ellas han desarrollado tambin resistencia a
otros antibiticos como la eritromicina, la tetraciclina, la asociacin trimetoprimasulfametoxazol y el cloranfenicol (2-6). Por todo esto, actualmente es uno de los
patgenos ms peligrosos y temidos.
Tambin se han descrito cepas de enterococos resistentes a las penicilinas, los
aminoglucsidos y las ampicilinas, y ms recientemente a la vancomicina (7). Por otra
parte, alrededor del 90% de las cepas clnicas de Staphylococcus aureus son capaces de
sintetizar una betalactamasa (penicilinasa) que les confiere resistencia a varios
betalactmicos (particularmente a las penicilinas) (8, 9).
En el caso de S. aureus, para controlar su infeccin se utilizaban sulfonamidas (en los
aos 1930) y bencilpenicilina (en los aos 1940), pero el problema de la resistencia
comenz a ponerse de manifiesto a finales de la dcada de 1950 porque el uso
continuado de bencilpenicilina haba actuado como factor de seleccin de cepas
resistentes que sintetizaban penicilinasa. Y fue en 1959 cuando se introdujo la meticilina,
una penicilina semisinttica que no es inactivada por la penicilinasa; sin embargo, tan
pronto como en 1961 ya se aisl en Europa la primera cepa de S. aureus resistente a este
antibitico (SARM, S. aureus resistente a meticilina). Con el uso extensivo de ste y otros
antimicrobianos durante muchos aos, diferentes cepas de SARM han desarrollado
resistencia a casi todas las clases de antibiticos, excepto a los glucopptidos, que
parecan ser los nicos compuestos capaces de actuar frente a todas las cepas de SARM.
Pero la voz de alarma se dispar cuando se describi la primera de estas cepas resistente
a la vancomicina (glucopptido), aunque el mecanismo de resistencia todava no est bien
descrito (10) puesto que las bacterias cuentan con multitud de estrategias que les
permiten desarrollar resistencia, como por ejemplo mutaciones de los genes que codifican

para las protenas diana, conjugacin con cepas resistentes, genes que confieren
resistencia codificados por transposones, intercambio de material gentico exgeno, etc.
Con todo ello, si la resistencia a la vancomicina se propagase no sera descabellado
pensar en una vuelta a la era preantibitica, cuando las infecciones por S. aureus y S.
pneumoniae eran mortales. Aunque las infecciones por SARM se producen
mayoritariamente en ambientes hospitalarios, no estn restringidas nicamente a stos
sino que parecen extenderse a otros entornos.
Finalmente, y por mencionar otras bacterias significativas que tambin han desarrollado
resistencia a los antibiticos, se han descrito cepas de Haemophilus influenzae
resistentes a la ampicilina, el cloranfenicol y la asociacin trimetoprima-sulfametoxazol (7),
de Neisseria meningitidis resistentes a la penicilina (7), de Moraxella catarrhalis
resistentes a la ampicilina y la amoxicilina (11), y de Salmonella typhy resistentes al
cloranfenicol, la ampicilina y trimetoprima-sulfametoxazol (12, 13). Adems, tambin
habra que mencionar las bacterias gramnegativas multirresistentes, como son los
gneros Klebsiella, Serratia, Proteus, Enterobacter y Escherichia (12), y Pseudomonas
aeruginosa (14).
Por desgracia, el desarrollo de nuevos antibiticos est siendo un proceso mucho ms
lento que el de la propagacin de estas cepas, que se ve favorecido, a su vez, por la
masificacin, la higiene deficiente y los escasos controles de infeccin en muchos
hospitales (15). Con todo ello se hace patente que el problema de la resistencia a los
antibiticos es una realidad y que est naciendo una nueva "era de los antibiticos"; las
infecciones bacterianas, uno de los campos donde la qumica farmacolgica ms xitos
ha obtenido, y que pareca ya agotado, est en pleno renacimiento. En paralelo con esta
revitalizacin han aparecido nuevas tcnicas de sntesis, ensayo e identificacin de
compuestos con posible actividad antibitica, a partir de millones de molculas diferentes
que, sin duda, agilizar y facilitar el proceso de identificacin de nuevos antibiticos y
posiblemente sea la nica va para encontrar las "penicilinas" del siglo xxi. Esta nueva
tcnica es la qumica combinatoria y posibilita la sntesis de quimiotecas, tanto de
pptidos como de molculas orgnicas no peptdicas, consiguiendo una diversidad
qumica elevada y la realizacin del ensayo biolgico en un tiempo rcord.
QUIMIOTECAS COMBINATORIAS
Una quimioteca se define como una coleccin de compuestos, desde decenas hasta
millones, que se preparan simultneamente por medio de sntesis mltiple. Estas
quimiotecas destacan por contener todas las combinaciones posibles de una misma clase
de compuestos. En 1991, la introduccin de las quimiotecas permiti un importante
avance prctico en la investigacin farmacutica (16). Estas quimiotecas se han utilizado
para la identificacin de agonistas y antagonistas de receptores opiceos y de inhibidores
de enzimas, para estudios de unin entre ligando y protena y de interaccin de antgeno
y anticuerpo, y ms recientemente para la identificacin de antimicrobianos (17-20). En la
actualidad se han puesto a punto diferentes estrategias sintticas para preparar conjuntos
de molculas de alta diversidad qumica en condiciones que permitan su utilizacin en
ensayos biolgicos. Todas las quimiotecas elaboradas hasta ahora se basan en la sntesis
de pptidos en fase slida y se pueden dividir en tres categoras. La primera utiliza las
tcnicas de biologa molecular, donde secuencias de pptidos son "presentadas" en la
superficie de las protenas de cubierta de fagos filamentosos, tcnica denominada phage

display (17, 18, 21). El principal inconveniente es que como se basa en un sistema
biolgico no se pueden incorporar a las secuencias D-aminocidos ni aminocidos no
naturales, que aumentaran la diversidad y la versatilidad de las tcnicas combinatorias.
La segunda categora de quimiotecas implica el uso de sntesis qumica y ensayo
biolgico posterior sobre soportes slidos: la sntesis de los compuestos se realiza
acoplada a un soporte slido y, al finalizar la sntesis, las molculas quedan unidas a ste;
as, los ensayos se realizan con las molculas inmovilizadas en el soporte (22, 23), lo que
limita el tipo y la calidad del ensayo. La tercera categora, que opinamos es la ms
interesante para su aplicacin en el campo antimicrobiano, se basa en quimiotecas
sintticas solubles, donde los compuestos sintetizados sobre el soporte slido son
posteriormente escindidos por mtodos qumicos (16, 24). Una vez en disolucin se
pueden aplicar a cualquier tipo de ensayo biolgico que se disee convenientemente y la
informacin obtenida es mucho ms representativa. Adems, por ser esta categora la
ms utilizada en la obtencin de quimiotecas de compuestos orgnicos y con la que
mejores resultados se han obtenido en la identificacin de antibiticos, describiremos con
cierto detalle el procedimiento sinttico y sus posibilidades de aplicacin.
Quimiotecas sintticas solubles
Las quimiotecas sintticas solubles se preparan mediante sntesis mltiple en fase slida
(25). La primera unidad que se incorpora quedara covalentemente unida a un soporte
slido, que es un polmero en forma de perla (llamado resina) que contiene grupos
reactivos donde puede crecer el pptido. Posteriormente las molculas son escindidas del
soporte y el pptido (o molcula orgnica) as liberado queda en disolucin. Existen dos
tipos de descodificacin para la identificacin de compuestos activos: a) un proceso
iterativo que incluye sucesivos pasos de sntesis, rastreo, seleccin de los compuestos
ms activos y con los seleccionados repeticin de los mismos pasos hasta encontrar la
secuencia ms activa (Fig. 1), y b) un proceso de rastreo posicional, donde se pueden
encontrar las secuencias activas en un solo ensayo (Fig. 2).

Figure 1. Rastreo de una quimioteca mediante formato iterativo. 1 (flechas negras):

sntesis; 2 (flechas blancas): rastreo y seleccin de las secuencias ms activas. Ac: acetil;
O: aminocido definido; X: mezcla equimolar de los 20 L-aminocidos.
Proceso iterativo
En este proceso se identifica, en cada paso de descodificacin, un aminocido para una
posicin definida de la secuencia activa. Las primeras quimiotecas que se crearon
consistan en secuencias de seis aminocidos (16, 24). Un ejemplo sera la frmula AcO1O2XXXX-NH2, donde O1O2 son las dos primeras posiciones que se definen con un
aminocido determinado: AA, AC, AD... hasta VY, WY, YY (utilizando el cdigo de una letra
para cada aminocido), para un total de 400 combinaciones (20 2). En cada una de estas
400 combinaciones las X hacen referencia a una mezcla equimolar de 19 de los 20 Laminocidos naturales (la cistena se omite en las X, pero no as en las posiciones
definidas, representadas como O), lo que hace un total de 130.321 posibles
combinaciones (194). As, cada una de las 400 mezclas se compone de 130.321 (19 4)
pptidos y, en total, en la quimioteca tendramos 52.321.400 (400 x 19 4) pptidos. Cada
una de estas 400 mezclas se somete, por separado, al ensayo biolgico de inters para
identificar los aminocidos ms activos en las posiciones O 1O2, que corresponden a RR
en el ejemplo de la Fig. 1. Seguidamente se procede a la sntesis de ya slo 20 nuevas
mezclas, Ac-RRO3XXX-NH2, y al ensayo e identificacin del aminocido ms activo en la
posicin O3, que resulta ser W (Fig. 1); y as sucesivamente hasta encontrar las secuencia
ms activa, que en este caso, a modo de ejemplo, sera Ac-RRWCKR-NH2.
La naturaleza de la secuencia activa viene definida por el ensayo biolgico, es decir, con
la misma quimioteca podemos encontrar otras secuencias activas para diferentes ensayos
biolgicos que se planteen. Utilizando esta aproximacin iterativa se requieren de 6 a 12
semanas para obtener secuencias peptdicas activas.

Aunque era un mtodo novedoso y relativamente rpido (puesto que se ensayan ms de

50 millones de molculas diferentes), el ensayo de 400 muestras todava pareca
optimizable en tiempo y por ello se idearon las quimiotecas combinatorias en formato de
rastreo posicional.

Figure 2. Rastreo de una quimioteca mediante formato de rastreo posicional. 2 (flechas

blancas): rastreo y seleccin de las secuencias ms activas. Ac: acetil; O: aminocido
definido; X: mezcla equimolar de los 20 L-aminocidos.
Rastreo posicional
El uso del procedimiento de rastreo posicional no requiere la repeticin de los pasos de
ensayo, seleccin y sntesis, sino que en un solo ensayo y en una sola semana, en
funcin de la bondad del ensayo, se pueden identificar secuencias peptdicas con
actividad biolgica.
En las quimiotecas combinatorias en formato de rastreo posicional lo que se trata es de
sintetizar tantas subquimiotecas como aminocidos contenga la secuencia y, en cada una
de ellas, definir una posicin, y las restantes son mezclas equimolares de los aminocidos
(26). Por ejemplo, en el caso de una secuencia de seis aminocidos tendremos seis
subquimiotecas posicionales diferentes, cada una de las cuales tendra la siguiente forma:
Ac-O1XXXXX-NH2, Ac-XO2 XXXX-NH2, Ac-XXO3XXX-NH2, Ac-XXXO4XX-NH2, AcXXXXO5X-NH2, Ac-XXXXXO6-NH2 (donde O1, O2... O6 vendran ocupadas por los 20
aminocidos) (Fig. 2). En total hay 120 mezclas (6 posiciones definidas 20 aminocidos
posibles para ocuparlas) y cada una de ellas cuenta con 2,5 millones de combinaciones
posibles (195); as, cada una de las seis subquimiotecas contiene unos 50 millones (20 x
195) de hexmeros diferentes.

La ventaja de las quimiotecas en formato de rastreo posicional reside en que cada una de
las posiciones se ensaya independientemente del resto, por lo que ya no se precisan los
procesos iterativos de seleccin y sntesis requeridos en las quimiotecas anteriormente
descritas. En la Fig. 2 se muestra un ejemplo de una quimioteca en formato de rastreo
posicional. Una vez sintetizada la quimioteca se realiza el ensayo biolgico y
obtendramos, a partir de la lectura de los resultados, los aminocidos ms activos en
cada una de las posiciones. nicamente restara sintetizar las molculas de secuencia
totalmente definida y ensayarlas de nuevo para validar la quimioteca y comprobar que
tienen las caractersticas biolgicas exigidas por el ensayo.
DESARROLLO DE NUEVOS ANTIMICROBIANOS UTILIZANDO QUIMIOTECAS
SOLUBLES
Quimiotecas de L-aminocidos
Las quimiotecas de pptidos fueron las primeras en sintetizarse, debido a que los
mtodos de sntesis peptdica son los mejor desarrollados. Adems, aunque
tradicionalmente no se han utilizado como agentes teraputicos por su baja
biodisponibilidad oral y su alta degradabilidad enzimtica, tanto los insectos como los
mamferos y las plantas liberan pptidos de bajo peso molecular como uno de sus
primeros sistemas defensivos para luchar contra las infecciones bacterianas (27). Debido
a que poseen un mecanismo de accin diferente al de los antibiticos clsicos (los
pptidos generalmente ejercen su accin alterando las propiedades de permeabilidad de
las membranas bacterianas) (28), los pptidos pueden desempear un importante papel
como nuevos agentes en la lucha contra las cepas bacterianas resistentes que van
apareciendo y, de hecho, hay pptidos que se vienen utilizando como antibiticos, por
ejemplo la polimixina y la bacitracina (29, 30). De ah que varias de estas quimiotecas se
hayan utilizado para la identificacin de compuestos con actividad antimicrobiana.
El laboratorio liderado por Richard Houghten (Torrey Pines Institute for Molecular Studies,
San Diego, California, EE.UU.) fue el primero en utilizar las quimiotecas solubles para
este fin. A partir de una quimioteca de hexapptidos encontraron secuencias peptdicas
que tenan una alta actividad bactericida a concentracin micromolar frente a bacterias
grampositivas y gramnegativas y frente a la levadura Candida albicans, mientras que eran
inocuas para los eritrocitos (16, 24, 31). Sus actividades antimicrobianas frente a cepas
resistentes de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa y C. albicans las podemos ver en la Tabla
1. Aunque estos pptidos presentan la mitad de actividad que los antibiticos comerciales
existentes, sus actividades son del orden, o incluso mayores, que las de otros pptidos
antimicrobianos de origen natural, como la cecropina o la magainina.
Otra estrategia es, a partir de pptidos con actividad antimicrobiana conocida y mediante
sntesis qumica combinatoria, introducir en algunas posiciones mezclas equimolares de
los 20 L-aminocidos con el fin de encontrar nuevas secuencias con una mayor actividad;
a esto se le llama "combinatorializar" las posiciones. Este tipo de quimiotecas se
denominan quimiotecas definidas conformacionalmente, debido a que la estructura de
todos los pptidos que componen la quimioteca deriva de un pptido con estructura y
conformacin definidas. Esta "combinatorializacin" no slo permite el descubrimiento de
nuevos anlogos ms activos en comparacin con la secuencia original, sino que
posibilita realizar valiosos estudios relacionados con la estructura y la actividad de los
pptidos. Blondelle y cols. (32) utilizaron esta estrategia y, basndose en el pptido AcLKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2, de conocida actividad antimicrobiana, sintetizaron dos

quimiotecas definidas conformacionalmente para tratar de identificar pptidos con

actividad antimicrobiana. Despus de rastrear las quimiotecas se identificaron algunas
secuencias que presentaban una mayor actividad que la original.
Recientemente Hong y cols. (33), utilizando la misma estrategia, han identificado
decapptidos con actividad antimicrobiana frente a varias bacterias, entre
ellas Staphylococcus epidermidis, P. aeruginosa, E. coli y la levadura C. albicans, y que
presentan baja actividad hemoltica.
Pptidos con D-aminocidos y con aminocidos no naturales
Como se ha comentado anteriormente, el principal problema de los pptidos constituidos
por L-aminocidos naturales es su baja estabilidad (por ejemplo frente a las proteasas),
con lo que se dificulta su utilizacin como agentes teraputicos. Una forma de prolongar la
vida media de los pptidos antibacterianos en el organismo es incorporar en las
quimiotecas D-aminocidos u otros aminocidos no naturales que, al no ser reconocidos
por las proteasas, son mucho ms resistentes a su degradacin y resultan ms
interesantes como agentes teraputicos.
En un primer intento se sintetiz una quimioteca de tetrapptidos a partir de mezclas de
aminocidos L, D o no naturales (34). La primera posicin de la quimioteca consista en
un aminocido definido, que poda ser uno de los 58 aminocidos diferentes de que
disponan los autores (posicin U). Las tres posiciones restantes (Z) consistan en
mezclas equimolares de 56 de los mismos aminocidos (L- y D-cistena se omitieron). Por
tanto, la quimioteca era de la forma Ac-UZZZ-NH 2. Se obtuvieron as 58 subquimiotecas
con 175.616 (562) tetrapptidos individuales cada una, en total 10.185.728 tetrapptidos
diferentes. Despus del rastreo mediante el mtodo iterativo se obtuvo una serie de
compuestos con una gran actividad antimicrobiana. A diferencia de los pptidos
comentados anteriormente, estos antibiticos parecen ser bacteriostticos y adems
tienen una actividad hemoltica menor que los pptidos con L-aminocidos.
Compuestos peptidomimticosy molculas orgnicas
Con el fin de aumentar el repertorio de la diversidad qumica ms all del uso de
aminocidos no proteognicos, se han desarrollado quimiotecas de peptidomimticos o
de pequeas molculas orgnicas. A los inconvenientes que presentan los pptidos como
frmacos, ya comentados, tenemos que aadir su baja selectividad de accin, resultado
de la alta flexibilidad conformacional que poseen, lo que posibilita la unin a varios
receptores y, en algunos casos, la aparicin de reacciones inmunitarias descritas tras la
administracin de frmacos peptdicos. Con el fin de subsanar estos inconvenientes y a la
vez aprovechar el amplio potencial que ofrecen los pptidos para el desarrollo de nuevos
compuestos bioactivos, surge el concepto de "peptidomimtico" para definir aquellas
estructuras no peptdicas capaces de mimetizar o bloquear el efecto biolgico de algunos
pptidos. Un ejemplo de un peptidomimtico sera la morfina, que con una estructura muy
alejada de la peptdica es capaz de unirse a receptores peptdicos y mimetizar la accin
de pptidos naturales como son las encefalinas. Se espera que estos compuestos sean
mejores como medicamentos orales que los pptidos (por las caractersticas ya
mencionadas).

Actualmente, con el desarrollo de las quimiotecas combinatorias, la bsqueda de

compuestos peptidomimticos se ha incrementado enormemente. Sin embargo, el
desarrollo de quimiotecas de molculas orgnicas no ha sido posible hasta fechas muy
recientes debido a que la qumica orgnica en fase slida, verdadero motor de las
tcnicas combinatorias, an est en pleno crecimiento. As, no fue hasta 1992 cuando
Bunin y Ellman describieron la primera quimioteca combinatoria en qumica orgnica: una
quimioteca de 1,4-benzodiacepinas (35). Hasta ese ao el campo de la qumica
combinatoria haba sido de dominio exclusivo de pptidos y oligonucletidos. A partir de
ese momento la sntesis de quimiotecas orgnicas ha crecido casi exponencialmente
gracias al desarrollo de nuevas resinas, reactivos de acoplamiento, puesta a punto de
reacciones, etc. As, por ejemplo, se han descrito quimiotecas combinatorias de
poliaminas, poliglicinas (36), oligocarbamatos (37), hidantonas (38), -mercaptocetonas
(39), derivados de cubanos (40) y triazinas (41). Hasta ahora slo la quimioteca de
triazinas se ha ensayado en la identificacin de compuestos con actividad antibitica. Los
autores sintetizaron una quimioteca de triazinas con 46.000 (36 3) compuestos diferentes,
y aunque las actividades obtenidas an estn lejos de los antibiticos comerciales (una
CMI de 4 g/ml para Bacteroides subtilis y S. aureus) se pone de manifiesto que el uso de
quimiotecas orgnicas puede ser una muy buena va para el desarrollo de antibiticos.
CONCLUSIONES
La aparicin de cepas de bacterias resistentes a los antibiticos en uso, mediante
seleccin natural o forzada por su empleo incontrolado, se plantea como un problema de
inters sanitario general. Las nuevas y revolucionarias tecnologas de sntesis qumica y
la automatizacin de los ensayos estn poniendo millones de molculas a disposicin de
los procesos de identificacin de nuevos antibiticos.
La aplicacin de la qumica combinatoria al desarrollo de frmacos permitir el
descubrimiento de compuestos qumicos que contribuirn a la identificacin de nuevos
frmacos cabeza de serie. Ser despus de la optimizacin farmacolgica de los mismos
cuando estemos en condiciones de proporcionar a la comunidad mdica en general
nuevas molculas que, con mucho, sean ms eficaces en el tratamiento de las
infecciones; molculas que podran escapar a los mecanismos enzimticos de defensa
que posee el husped y que, por lo tanto, ejerceran su funcin sin ningn tipo de
interferencia, o molculas que mejoraran las propiedades antibiticas de algunas ya
existentes.
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