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2004 2005 Edu 08 Tema
2004 2005 Edu 08 Tema
INTRODUCCIN
La cromatografa es una antigua tcnica
instrumental (Milhail Tswett, 1906) que ha
evolucionado enormemente en los ltimos aos,
principalmente a partir de la dcada de los
setenta, con lo que, inicialmente concebida como
mtodo de separacin, ha llegado a convertirse en
una fuente inagotable de mtodos de anlisis.
Pocos mtodos de anlisis qumico son tan
especficos para un analito en particular, ya que
tanto las fases previas de extraccin como los
procedimientos cromatogrficos son llevados a
cabo en funcin del tipo de molcula.
El
proceso
cromatogrfico
contempla
la
separacin de los componentes de una mezcla,
para ello, una muestra de la mezcla (o el extracto
de una muestra) ser disuelta en una fase mvil
(en este caso un lquido). La fase mvil es
impulsada a travs de una fase inmvil, que debe
ser inmiscible con ella, a la que se conoce como
fase estacionaria, y que puede ser slida o
lquida
(cromatografa
lquido-slido
o
cromatografa lquido-lquido el lquido puede
estar embebido o unido a partculas slidas-). Las
fases son escogidas de tal forma que los
componentes de las muestras presenten
diferencias en cuanto a sus propiedades fsicoqumicas (solubilidad, tamao, fuerza inica,
polaridad, afinidad, etc.) para cada fase. Las
interacciones qumicas entre la fase mvil y la
muestra, y entre la muestra y la fase estacionaria,
determinan el grado de migracin y separacin de
los compuestos contenidos en la muestra. Un
componente que interacte ms con la fase
estacionaria realizar un "viaje" ms largo a travs
de ella que otro componente que tenga ms
interaccin con la fase mvil. Como resultado de
estas diferencias en la movilidad de los
componentes de una muestra estos se separarn
uno de otro.
En la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC,
High Performance Liquid Chromatography) la
muestra es inyectada en el seno de la fase mvil,
donde es soluble, y es transportada a travs de
una columna por el flujo continuo de fase mvil a
alta presin. La fase estacionaria est formada por
partculas de pequeo dimetro, por tanto, con
una gran superficie de interaccin, contenidas en
la columna. Este proceso cintico es conocido con
Aplicaciones
La HPLC se puede utilizar como tcnica
preparativa y como tcnica analtica, permitiendo
la purificacin, identificacin y cuantificacin del
analito deseado. La eleccin de la fase
estacionaria y la fase mvil, del flujo al que se va a
impulsar la fase mvil a travs de la fase
estacionaria e incluso de la temperatura a la que
se va a realizar la cromatografa, permitirn una
correcta separacin del analito de otros
compuestos.
Cada componente de una solucin tiene unas
caractersticas
determinadas
bajo
ciertas
condiciones cromatogrficas, y debe conseguirse
que la migracin del componente y de los
contaminantes a travs de la columna sea lo
suficientemente distinta para que dicho compuesto
sea separado de los dems del extracto, para
permitir su posterior identificacin y cuantificacin.
A este proceso se le denomina purificacin.
La identificacin de compuestos es la parte ms
importante de muchos trabajos en HPLC. Para
identificar compuestos se debe seleccionar un
sistema de deteccin que mida diferentes
propiedades fsico-qumicas de la molcula. Entra
en juego el tipo de separacin y la naturaleza de
la deteccin, sea absorbancia, conductividad,
fluorescencia, relacin masa/carga, etc.
En la cromatografa lquida, la fase mvil eluye de
la columna durante un tiempo determinado
conteniendo cantidades muy diferentes de solutos
que pasan a travs de un sistema de deteccin. El
instrumento detecta la presencia del soluto que es
convertida en una seal elctrica y sta puede ser
tratada por un procesador de datos. Se representa
la seal obtenida frente al tiempo o al volumen de
elucin, y al grfico obtenido se le conoce como
cromatograma. Los solutos se representan
grficamente como una serie de picos que pueden
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CONCEPTOS CROMATOGRFICOS
Dentro del proceso de elucin se pueden distinguir
procesos termodinmicos, relacionados con la
capacidad de retencin o la diferente migracin de
los componentes de la mezcla, y procesos
cinticos, relacionados con la anchura de banda
cromatogrfica
y,
por
tanto,
de
pico
cromatogrfico producido por el sistema de
procesamiento del detector.
Factor de retencin
Considerando un solo analito que se encuentra en
equilibrio entre la fase estacionaria y la fase mvil,
se define el llamado coeficiente de reparto o
constante de distribucin (KD) como la
concentracin molar de analito en la fase
estacionaria (Cs) dividida por la concentracin
molar del analito en la fase mvil (Cm):
KD =
Cs
Cm
KD =
Ns Vm
Nm Vs
KD = k
k=
KD
k' =
t R t 0 VR V0
=
t0
V0
V R = Vm (1 + k)
Cuando el factor de retencin del analito es
inferior a 1, la elucin es tan rpida que la
determinacin del tiempo de retencin es muy
difcil. Factores de retencin muy grandes
(superiores a 20) significan que la elucin
transcurre durante mucho tiempo. Se considera
que un factor de retencin ideal est entre 2 y 6.
Para llegar a una separacin ptima entre
compuestos, deben obtenerse picos agudos y
simtricos. En general, picos con bajo factor de
retencin son mejores porque se evita su
ensanchamiento
cumpliendo
mejor
las
caractersticas deseables (Figura 1).
Si se observa la Figura 2, puede verse que para
un pico perfectamente simtrico, los segmentos A
y B medidos al 10 % de la altura del pico son
iguales, por tanto el valor de asimetra (Af) segn
la frmula sera de 1:
Af =
B(10%h )
A(10%h )
Tf
(10%h )
A+ B
2A
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Eficiencia
El modelo del plato terico supone que la columna
cromatogrfica contiene gran nmero de capas
separadas, llamadas platos tericos. Los
equilibrios para la separacin de la muestra entre
la fase estacionaria y la fase mvil tienen lugar en
estos supuestos platos. El analito se mueve en la
mvil
52
HEPT = L / N
N=
t R2
s2
5,54 t R2
N=
w12/ 2
donde (w1/2) es la anchura del pico a la mitad de
su altura.
Hay una serie de mtodos usados para la medida
y el clculo de la eficiencia de una columna
mediante la medida de la anchura y la simetra del
pico a diferentes niveles. Referimos en orden de
sensibilidad son (Figura 3):
-
H = ( A + B) /(u + Cu )
h=
2 1/ 3 v
+v +
10
v
Selectividad y resolucin
Se define como selectividad () a la capacidad de
separacin de dos analitos en la columna,
considerando el tiempo de retencin (o volumen
de retencin) de los mximos de los picos para
cada analito.
k2 t 2 t 0 V2 V0
=
=
k1 t1 t 0 V1 V0
53
RS =
V2 V1
1 2(W1 + W2 )
N 1 k'
RS =
4 1+ k'
En general, es recomendable intentar maximizar
estos tres parmetros, existiendo varias
estrategias para ello:
-
54
Figura 4. Representacin de Van Deemter para establecer el flujo ptimo de la fase mvil.
TIPOS DE CROMATOGRAFA
El tipo de cromatografa en HPLC viene
determinado
por
la
fase
mvil
y,
fundamentalmente, por la fase estacionaria.
Existen diferentes tipos de fase estacionaria
disponibles en forma de soportes de distintos
materiales (polmeros, carbn, hidroxiapatita,
agarosa o slica) contenidos en una columna.
Pueden ser de diferentes tamaos, dimetros,
tamaos de poro, o que tengan unidos diferentes
anticuerpos,
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ELUCIN
Fase reversa, tambin se basa en la hidrofilia y la
lipofilia. La fase estacionaria consiste en una
matriz de slica empacada que lleva unida
covalentemente una cadena alqulica de ncarbonos (por ejemplo, C-8 significa que se
incorpora una cadena octil y C-18 una octadecil).
La ms hidrofbica es, en este caso, la fase
estacionaria, eluyendo los compuestos hidroflicos
ms rpidamente que los hidrofbicos, que
interaccionan con la fase estacionaria. Tambin
hay empaquetamientos polimricos alternativos a
la slice que ofrecen similares caractersticas con
mayor resistencia dinmica y ms amplio rango de
estabilidad de pH. Existen dos variantes de la
cromatografa en fase reversa:
-
Elucin isocrtica
Los compuestos eluyen usando una fase mvil de
composicin
constante
durante
toda
la
cromatografa. Todos los compuestos acaban
migrando a travs de la columna hasta el final. Sin
embargo, cada uno migra con una velocidad
diferente, resultando en una relacin de elucin
ms rpida o ms lenta. Este tipo de elucin es
bastante simple y barato, pero la resolucin de
algunos compuestos es cuestionable y el eluido
puede no ser obtenido en un plazo de tiempo
adecuado.
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t R = t 0 k '+t 0
k ' = (t R t 0 ) / t 0
Elucin en gradiente
Los
diferentes
compuestos
son
eluidos
modificando gradualmente la composicin de la
fase mvil durante el transcurso de la
cromatografa (aumentando la fuerza inica,
modificando la polaridad, etc.). El resultado sobre
la elucin es un acortamiento de los tiempos de
retencin, el factor de retencin disminuye
conforme aumenta la variacin de flujo del
gradiente y el compuesto eluye. Este gradiente
puede llevarse a cabo de forma lineal o
escalonada o linealmente escalonada.
La prediccin mediante ecuaciones que describan
la separacin de componentes por elucin en
gradiente es muy compleja, por lo que se parte de
las ecuaciones empleadas para la isocrtica y se
adaptan casi empricamente. La relacin del
cambio de la composicin de la fase mvil durante
el transcurso de la elucin en gradiente puede ser
G=
t 0 .S
tG
tg = t 0 k log 2,3 k 0 / k
][ (
Resolucin R = (1 / 4) ( 1) ( ) N 1 / 2 k / 1 + k
)]
INSTRUMENTACIN
En la Figura 6 se representan los elementos
esenciales que forman parte de un equipo de
HPLC.
Columna
En HPLC se usan diversos tipos de columnas
secundarias que se asocian a la columna de
separacin con otros fines especficos:
-
57
58
Dimetro
(mm)
Relacin de
flujo (L/min)
Capacidad de
muestra (g)
Mxima carga de
muestra (mg)
0,075
0,25
0,05
0,15
1,0
0,2
0,30
5,0
1,0
0,50
10
2,0
Microcalibre
1,0
25 - 50
0,05 - 10
Calibre estrecho
2,1
100 - 300
0,2 - 50
Analtica
4,6
500 - 1.500
1 - 200
10
Semi-preparativa
10
2.500 - 7.500
1.000
50
Preparativa
22
10.000 - 30.000
5.000
200
Tipo
Capilar
Inyector
El inyector para HPLC consiste normalmente en
una vlvula de inyeccin y un bucle. Un pequeo
volumen de muestra (previamente disuelta) se
carga en una jeringa y es inyectada en el bucle
por la vlvula de inyeccin. Un giro del rotor de la
vlvula cierra la vlvula y pone en comunicacin el
bucle que contiene la muestra con la corriente de
fase mvil que va de la bomba a la columna. El
volumen del bucle determina la cantidad inyectada
y puede ir desde 5 L hasta 500 L.
La inyeccin a flujo parado es un mtodo especial
por el cual la bomba se detiene para realizar la
inyeccin a presin atmosfrica, este sistema se
utiliza cuando se trabaja a muy alta presin.
Bomba
Bombas de pistn recproco: constan de un pistn
conducido por una leva unida a un pequeo motor
que se mueve rpidamente atrs y adelante en
una cmara hidrulica variando su volumen entre
35-400 L. En la carrera atrs, la vlvula de
59
Detector
Los detectores utilizados para HPLC siempre
trabajan bajo condiciones de flujo continuo, la
muestra disuelta en la fase mvil atraviesa una
celda de flujo en la que es detectada.
Normalmente, las muestras llegan en cantidades
de ng al detector, pero en anlisis de trazas, esta
cantidad puede llegar a ser de fg e incluso de muy
pocas molculas.
La respuesta del detector al paso de la sustancia
est basada en un amplio rango de caractersticas
fsicas y qumicas de las sustancias. Es por esto
que no existe un detector universal, sino que cada
sustancia, en principio, debe analizarse con el
detector ms adecuado dependiendo de su
naturaleza fsico-qumica, del tipo de anlisis que
se lleve a cabo y del tipo de instrumentacin de la
que se disponga. Los detectores ms
ampliamente utilizados se basan en:
-
R=
hw
sM
60
R=
h w F
sM
61
Regulador de contrapresin
El regulador de contrapresin se sita
inmediatamente despus del detector. Se disea
para aplicar una presin constante a la salida del
detector que previene la formacin de burbujas de
aire en el sistema. Esto mejora la estabilidad de la
lnea de base cromatogrfica. Se proyecta para
operar sin tener en cuenta el flujo, la fase mvil o
la viscosidad.
Colector de fracciones
El colector de fracciones es un dispositivo
automtico que recoge uniformemente los eludos
a la salida del HPLC. Los viales o tubos son
colocados en un carrusel o en una gradilla y el
usuario programa el intervalo de tiempo en el que
se recolecta cada fraccin. Cada vial contiene
fase mvil y fracciones de la muestra en el
correspondiente tiempo de elucin.
APLICACIONES
CLNICO
EN
EL
LABORATORIO
Antirretrovirales
(aciclovir,
delfinavir,
saquinavir).
Barbitricos (fenobarbital, butabarbital,
butabital, secobarbital).
Broncodilatadores (albuterol, teofilina,
teobromina, paraxantina, cafena).
Frmacos glucocorticoides (prednisolona,
betametasona).
Hormonas (dosificacin de testosteronas:
acetato, propionato y benzoato de
testosterona).
Pptidos
teraputicos
(oxitocina,
angiotensinas I y II).
Queratolticos (cido saliclico, cido
benzico).
Sedativos (nordiazepam, clordiacepxido,
oxacepam,
norclordiacepxido)
y
opiceos (morfina y sus glucornidos,
metadona).
BIBLIOGRAFA
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