i Métodos de obtencién y purificacion de ADN humano para su aplicacion en Genética Molecular nn RADA T., Ana ‘TTABOADA L., Gonzalo Insituto de Genética Facultad de Medicina Universidad Mayor de San Andrés ‘Av. Saavedra N® 2246 PALABRAS CLAVES: Obtoncién de ADN, Purikeacion de ADN, Fingerprinting. PCR. VOL VE Dice 1898 RESUMEN Es de gran importancia la obtencion de acido desoxirribonucleico (ADN) humano de alta pureza a partir de ilobulos blancos, para su aplicacion en estudios de Genética Molecular utilizando téenicas de hibridizacion y amplificacion por reacelam en cadena de la polimerasa (PCR) Existen secuencias de ADN altamente repetitivas llamadas minisatélites que por hibridacién con sondas permiten la {dentificacion genética de las personas, refiriéndose como Impresiones Digitales de ADN (Fingerprinting). La amplificacion. del segmento Apo E mediante la técnica de PCR. es utilizada como marcador genético en estudios de Genética de poblaciones. Se realizaron tres métodos de obtencién y purificacion de ADN, dos fueron extracciénes organicas (Metodos A y B). y tuno extraccién no organica (Método C), Solo las muestras de ‘ADN obtenidas por el método B y C resultaron tener alta concentracion y pureza, por lo tanto respectivamente utilizadas para hibridizacion con sonda en la técnica de Impresiones Digitales de ADN y en amplificacion por PCR del segmento Apo E, respectivamente. En este trabajo, se han logrado desarrollar dos métodos de obtencion y purificacién de ADN humano para ser empleados fen trabajos de Genética Molecular. INTRODUCCION En todos los organismos, a célula es la unidad de origen, estructural y funcional bésica, todos poseen esencialmente la misma maguinaria bioquimica y tienen, en comin el mismo cédigo genético. (f), Toda la informacin genética de un organismo vivo se encuentra lacumulada en la secuencia lineal de los cuatro nucleétidos que ‘conforman la molécula de ADN. (2,1) LLaimportancia del proceso de obtencién y purticacién del material genético es tecobrar el producto maximo de ADN de alto peso molecular libre de proteinas, fenol e inhibidores de las enzimas de restriccién (3) y dela Taq polimerasa. EI ADN de alta calidad es un prerequisite para su uso en técnicas de biclogia molecular como {mpresiones Digitales de ADN o Fingerprinting (utlizando secuencias altamente repetitivas denominadas minisatélites que permite la ‘dentificacion genética de las personas) y PCR (para la identiicacién de las secuencias especticas de ADN mediante el uso de cebadores), no asi el ADN degradado que no sustenta la integridad de los {ragmentos de restiocin para producir bandas defiidas, nilos sitios blanco para los cebadares, Consecuentemente, los métodos ‘apropiados de conservacion de muestras en el campo son de extrema BIOFARBO- (63)RADA, TABOADA ————— Importancia, y pueden afectar grandemente la calidad de! ADN extraido. (4, 5, 6) Et arincipal objetivo de este trabajo es desarrollar rmétodos de obtencién y purificacién de ADN humano a partir de células humanas para su aplicacién en Genética Molecular, bajo el modelo de hibridizacién con sonda y ampitizacién del segmento Apo E, para verificarla calidad de ADN obtenido. Los objetivos especiticos son: Desarrollar métodos de obtencién y purficacién de ADN humano a partir de linfocitos de sangre periférica. Comprobar la calidad de! ADN obtenido para implementar la técnica de Fingerprinting, usando la sonda F-10. Verificar la calidad {del ADI humano para ia ampificacén del segmento Apo E. MATERIAL Y METODOS La nanipulacién de las muestras para su almacenaje ‘oparalaextraccién directa de ADN, es uno de los aspectos mas iriportantes en la realizacién del procedimiento, Existe in amplio rango de fuentes para el aislamiento de AON. 10s tejidos frescos usualmente incluyen sangre total (tejdo escogido para el presente trabajo), foliculs pilosos, Célula epitliales. células de fluido amnitico, muestras de vellocidad coriénica, y cultivo de tejido de fibroblastos. Las muestras secas, usualmente incluyen manchas de semen y sangre, pulpa dentaria y médula ésea. (7). Entre otras vosibles fuentes de ADN podemos mencionar muestras preservadas 0 no, de autopsias humanas. Se recolectaron 8 muestras de sangre total de dlitoren es incividuos. Cori estas muestras se realizaron tres métodos (A, 8, YC) de extraccin y purificacién de ADN, Loe métodos A y B fueron realizados en base al Protocolo de extraccién organica desarrollado por L. Madisen y sus colaboradores en 1987. (8). El método C de obtencién de ADN humano, se basa en la metodologia { tipo no organica de Turck (9) ‘Todas ias soluciones se prepararon con material y reactives (pureza para biologia molecular SIGMA). ME"ODOS AY B. La inuestra seleccionada para la extraccién de ADN fue san ye total en una cantidad de 2mlo mas, con EDTA como articoagulante, MErODO A Lisis de glébulos rojos Se colocé la sangre en un tubo con 15 mi de butter lisador de glébulos rojos (NACI 0, 55M, Tris-HCI 0,17M, pH7.651, so contritugé a 2000 rpm por 10 min, sedescarté el sobrenadante, Posteriormente se aadié al sedimento 10 mi de solucién salina (CINa 0.86%), se homogenizé y smn Esquema N= Pain de ena por mpresones Bigtales Go ADN ‘tia muestra (naa 2) ona nea tel marcador do eso macula, sn rapments ol lage Ages ssencillos de obtencién y puriicacién de ADN humano a partir de glébulos blancos de sangre periérica, ‘compardndose luego su eficiencia para emplearios en ‘écnicas de biologla molecular. {Laextraccién de ADN por el método A, no es adecuada ‘ya que se obtuvo muy poco material en el preciptado, con bastante contaminacién de proteinas, por lo tanto con un ‘grado de pureza muy bajo y no apto para su utlizacién en técnicas de biologia molecular. EIADN extraido por el método B, cuenta con una buena cconcentracién y pureza, asi como también probé ser bastante adecuado para realizar técnicas de Impresiones Grética N82 ESTIMACION DE LA PUREZA DE ADN METODOS B y FOTOGRAFIAN® 1 PRODUCTO DE AMPLIFICACION FOTOGRAFIAN? 2 FRAGMENTOS DE RESTRICCION DEL PRODUCTO DE AMPLIFICACION (88) BOER v0. W- Diciembre de 1098_METODOS DE OBTENCION ¥ PURIFICACION DE ADN HUMANO ee eT es Digitales de ADN (Fingerprinting). No asi para realizar PCR, probablemente debido a la presencia de fenol. EI AON obtenido por ef método C, es bastante ‘adecuado para realizar extracciones de ADN a partir de ‘lébulos blancos humanos, debido a su faciidad, no utiliza ssolventes orgénicos, se obtiene un Buen rendimiento en ‘cuanto a su concentracion y por lo tanto de buena utiidad para realizar amplificacién de ADN por técnicas de PCR. ‘Aqui radica la importancia de la obtencién del ADN, en. la forma mas pura posible, para la identiicacién de los diferentes genes mediante ol uso de sondas y cebadores, asi como secuencias altamente repetitvas, minisatéites, ue permiten la identiicacién genética de las personas. BIBLIOGRAFIA 1. De Roberts EDP, De Roberts EMF. Biologia colar y Molecular. Undécima edicén. Editorial el Ateneo, Argentina, 1986. 2. Walson JD, Crick FHC. Molecular structure ‘acids. Nature 1953. 171.737 3. Sambrook J Fritsch EF, Maniatis. Molecular cloning: A laboratory Manual. 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