EXTRACCIN DE RNA

Mantener siempre todo en hielo, usar guantes y material preparado especialmente para RNA.
1.- Inocular precultivos de las cepas toda la noche.
2.- Inocular 25mL de medio fresco con estos precultivos para que quede a D.O600 = 0,18 y crezca hasta
D.O600 0,6.
3.- Centrifugar a 4C, 5 minutos a 3500rpm, los 100mL del cultivo en cornings de 50mL.
4.- Lavar con H2O de RNA. (unos 10mL)
5.- Congelar el pellet a -80C toda la noche. (opcional)
6.- Se descongelan las muestras en hielo.
7.- Preparar eppendorfs de 2mL con perlas de vidrio.
8.- Poner las celulas y aadir 500L de LETS y 500L de fenol para RNA.
9.- Romper las clulas en el aparato fast-prep, 6 agitaciones de 30 segundos con periodos de 30
segundos en hielo entre los distintos pases.
10.- Centrifugar a 4C durante 5 minutos a 13000rpm.
11.- Recoger el sobrenadante en eppendorfs de RNA y extraer con fenol-cloroformo de RNA. Vortex.
12.- Centrifugar a 4C durante 5 min a 13000rpm.
13.- Recoger el sobrenadante y extraer con cloroformo.Vortex.
14.- Centrifugar a 4C durante 5 min a 13000rpm.
15.- Recoger el sobrenadante y precipitar con 1volumen de LiCl 5M.
16.- Guardar a 20C durante 3 horas (preferentemente toda la noche).
17.- Centrifugar a 4C durante 15 minutos a 13000rpm.
18.- Lavar con EtOH al 70%. (unos 500L)
19.- Dejar secar el pellet.
20.- Resuspender en 500L de H2O de RNA.
21.- Precipitar con 1/10 del volumen AcNa 3M de RNA y 2 volumenes de EtOH absoluto.
22.- Guardar a 20C hasta su utilizacin (toda la noche).
23.- Centrifugar a 4C durante 15 minutos a 13000rpm.
24.- Lavar con EtOH al 70%.
25.- Secar 1-2 minutos en speed-back.
26.- Resuspender en un volumen pequeo i cuantificar una dilucin 1/50 en el espectrofotmetro.
LETS: LiCl 0,1M; EDTA 10mM; SDS 0,2%, Tris.HCl 10mM pH=7,4.