MTODOS DE ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS

Debido al tamao diminuto de los microorganismos, los mtodos de estudio de la microbiologa son
caractersticos: Se necesitan:
Instrumentos para observarlos con aumento
Preparaciones especiales para observarlos al microscopio
Conocimiento de sus requerimientos de vida
Medios para cultivarlos
Tcnicas para caracterizarlos, aislarlos y conservarlos.

EL MICROSCOPIO
El microscopio es el instrumento que ms se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos.
Es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo, mediante un sistema de lentes y
fuentes de iluminacin se puede aumentar el tamao original. y hacer visible un objeto microscpico.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico.
En el microscopio ptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que
modifica el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos

El microscopio electrnico

utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magntico

EL MICROSCOPIO OPTICO
Los microscopios de este tipo generalmente alcanzan un aumento de 1000 veces del tamao original,
aunque pueden alcanzar hasta 2000 veces, pero la resolucin no es tan buena.
Las lentes de un microscopio ptico son el condensador, el objetivo y el ocular.
El
condensador se utiliza para enfocar la luz sobre la preparacin. Elevando o bajando el
condensador puede alterarse el plano del foco de luz hasta conseguir el foco preciso.
El objetivo es el lente ms cercano al objeto observado y con ella se logra el aumento primario del
objeto. Los microscopios que se usan normalmente en microbiologa estn equipados con tres
objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersin. Estos objetivos estn montados sobre una
pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.
El ocular es el lente ms cercano al observador, donde la imagen formada por el objetivo es
finalmente aumentada.
El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular.
El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el
microscopio construido con una sola lente, llamado microscopio simple, que se usa como lupa.
Resolucin. En un microscopio, adems del aumento, hay que considerar su poder resolutivo que es la
capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. A mayor poder resolutivo, mayor
ser la definicin de un objeto. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud
de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como apertura numrica. Como los
microscopios pticos utilizan luz visible, la longitud de onda est fijada, por lo que la resolucin de un
objeto es funcin de la apertura numrica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto ser ms
pequeo.
0.5 l
d: poder resolutivo; l: longitud de onda; a: mitad del ngulo de la lente objetivo
d = ----------N: ndice de refraccin del medio
N sen a
N sen a: apertura numrica
Aceites de inmersin. El medio a travs del cual pasa la luz es un factor que afecta la resolucin. .
Cuando el objetivo est separado del objeto por el aire, su apertura numrica nunca ser mayor de 1,0.

Para conseguir aperturas numricas mayores, el objetivo debe estar inmerso en un lquido de mayor
ndice de refraccin que el aire. A estos lquidos se les denomina aceites de inmersin que utilizados con
los objetivos de inmersin elevan la apertura numrica entre 1,2 y 1,4. An as, con luz visible, las
partculas con un tamao ms pequeo de 0,25 m no pueden distinguirse unas de otras.
Existen varios tipos de microscopios:
Microscopio de campo claro:

Usa como fuente luz directa una bombilla o la luz solar. Como los
microorganismos suelen ser transparentes, es difcil distinguirlos
con este tipo de microscopio , por lo que se tien para mejorar su
visibilidad.

Microscopio de campo oscuro:

Usa un microscopio ptico dotado con un condensador y un objetivo

especial. Con este microscopio, los microorganismos vivos sin teir
se ven iluminados contrastando con un fondo oscuro.

Microscopio de fluorescencia:

La muestra se tie con una sustancia fluorescente que absorbe la

energa de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de
longitudes de ondas ms largas (verde). Se utiliza una sustancia
fluorescente
que se une al microorganismo, el cual emite
fluorescencia y se puede identificar. Esta tcnica se usa en clnica.

Microscopio de contraste de Es un microscopio ptico modificado mediante un condensador y un

fases:
objetivo especial que controlan la iluminacin de tal manera que
permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. El
resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.
Con este mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que
las partes de la clula que tienen una densidad cercana al H 2O
(citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras
celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
Microscopio de luz polarizada

Tiene una lmina polarizadora que se ubica por debajo de la platina,

para polarizar la luz proveniente de la fuente. El microscopio
polarizante se emplea en la interpretacin de textura y relaciones de
las sustancias naturales o artificiales tal como aparecen en las
secciones delgadas y para determinar algunas propiedades pticas
de los minerales

EL MICROSCOPIO ELECTRONICO
Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de luz. La longitud de onda de los
rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750nm;
violeta - rojo), lo que les permite tener un poder de resolucin muy elevado. Los aumentos pueden llegar
a ser de un milln de veces. Es posible con el microscopio electrnico resolver objetos separados por una
distancia de 0,003 m, comparado con los 0,25 m de uno ptico.
En este microsacopio slo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es
demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo tanto, es necesario preparar muestras
mediante tcnicas especiales de cortes ultrafinos.
Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Despus de la
deshidratacin, la muestra se incluye en una resina, a la cual se le realizan cortes finos con un
ultramicrotomo (generalmente con , cuchilla de diamante). Una sola clula bacteriana puede cortarse en
cinco o seis secciones muy finas.
Si slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que
se montan clulas enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de
electrones es dirigido sobre la preparacin y los electrones dispersados por el metal pesado activan una

pantalla de observacin produciendo una imagen.

A la primera tcnica se la denomina Microscopa Electrnica de Transmisin (MET) y a la segunda
Microscopa Electrnica de Barrido (MEB).El microscopio electrnico de barrido -SEM- es el mejor
mtodo adaptado al estudio de la morfologa de las superficies, la imagen se genera por interaccin de un
haz de electrones que "barre" un rea.

TECNICAS PARA LA OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS

Todos los microorganismos, excepto los acelulares (virus, viriones) pueden ser observados mediante
microscopios pticos, a los cuales vamos a limitar la descripcin de las tcnicas ms usadas para realizar
preparaciones de las muestras a observar .

Preparacin en fresco:
Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y
cubrindola, sin formar burbujas de aire, con un cubreobjetos. Se observa al microscopio de contraste de
fases o de campo claro los microorganismos vivos, para que semuevan es preciso que no est fijados.
Para poder observar mejor la movilidad de un microorganismo se utiliza la tcnica de la gota pendiente.

Tcnicas de tincin:
Para teir los microorganismos de una muestra se siguen, en general, los siguientes pasos:
Extensin: Sobre un portaobjetos limpio se extiende con el asa la muestra que contiene los
microorganismos. Si la muestra es lquida se hace directamente y, si es slida, hay que
suspenderla previamente en una gota de H 2O. El extendido no debe ser muy denso porque
obstaculizara el paso de la luz del microscopio y porque los microorganismos quedaran
aglomerados.
Fijacin:
Para adherir la muestra al portaobjetos y para desnaturalizar las protenas de manera que
el colorante entre fcilmente, se pasa la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del
mechero, cuidando que el caentamiento logre secar la muestra pero no quemarla.
Tincin:
Se aaden los colorantes sobre los microorganismos sometidos al proceso anterior.
Existen varios tipos de tinciones:
Negativa:
Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo
su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina o tinta
china), cuyos pigmentos no penetran a la clula. La preparacin se ve como un
negativo de fotografa en blanco y negro.
Simple:
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tincin
negativa, slo nos permite observar la forma, el tamao y el tipo de agrupacin de las
clulas.
Diferencial:
Intervienen dos o ms colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante
que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominndose
colorante de contraste.
La Tincin de Gram Es la tcnica de tincin ms utilizada en bacterias. El primero en
describirla fue el dans Christian Gram. El procedimeinteo es el siguiente:
Se tie la muestra con cristal (colorante azul)
Se le agrega Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la accin de un
colorante)
Se lava con Etanol 96 (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias,
las dems permanecen de color violeta
Se aade Safranina (colorante de contraste, rojo, que tie las clulas que quedaron
decoloradas en el paso anterior)
Esta tincin distingue entre dos amplios grupos de bacterias segn la composicin de
la pared celular; las Gram (-) que no retienen el complejo cristal violeta-lugol despus
de la decoloracin con alcohol y aparecen teidas de rojo, y las Gram (+) que s lo
retienen y aparecen teidas de azul oscuro.