ASPECTOS ANATOMICOS y FISIOLOGICOS

DE CULTIVOS IN VlTRO DE
Tropaeolum tuberosum (Ruiz & Pavn)
Orlando Torres Fernndez (1)
Tito J. Fandio Garca (1)
Margarita Perea Dallos (2)
RESUMEN
Se cultivaron explantes de peciolo de T. tuberosum en medio Murashge
& Skoog suplementado con auxinas y citoquininas. Se describe la formacin

de callo y la regeneracin de organodes semejantes a races obtenidos a

partir del subcultivo. Vstagos obtenidos mediante micropropagacin, se
incubaron a temperaturas de 18e y 22e, en medio MS para enraizamiento, observndose diferencias notorias en la morfologa de las ..aces.
SUMMARY
Petiole explants of T. tuberosum were cultivated in Murashge & Skoog
medium suplemented with auxins and ctoknns. Callus formation and
abnormal morphogeness obtained from subcuItures are described. Shoots
obtained by micropropagation were incubated at 18e and 22e in medium
MS for rooting. Notorius differences in root morphology were observed.
INTRODUCCION
El cultivo de tejidos vegetales, adems de ser un recurso de la biotecnologa que ha permitido avances significativos en la solucin de problemas
de propagacin y mejoramiento de plantas de importancia econmtca.
constituye un medio que facilita la investigacin bsica en diferentes reas
de la morfologa, fisiologa y gentica vegetal. En este trabajo se presenta la
segunda parte de un estudio de cultivo de tejidos de la especie Tropaeolum
tuberosun ("navio", "cubo", "a").

(1) Departamento de Biologia. Universidad Nacional Apdo. Arcro No. 23227

(2) Profesora asistente. Departamento de Biologia. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de
Colombia. Apartado Areo 23227, Bogot.

72

ACTA B10LOGICA COLOMBIANA.

VOL. l. No. 5

T. tuberosum es una planta herbcea originaria de los Andes. en donde

se cultiva para alimentacin desde antes de la llegada de los espaoles
(Prez. 1956). El principal producto aprovechable es su tubrculo. llamado
popularmente "cubo" en la Sabana de Bogot. en donde el mercado para
el ao de 1980 se calcul en unas 500 toneladas/mes (Gonzalez y Obando,
1980)
Los anlisis de la composicin qumica del tubrculo de T. tuberosum
demuestran que posee buenas cualidades como alimento; su proteina
contiene todos los aminocidos esenciales. excepto la histidina; pose alto
contenido de vitamina C y se le considera mejor alimento que la yuca y
similar a la papa. Igualmente se cree que el tubrculo es apropiado para la
industria de la galleteria (Gonzlez y Obando, 1980).
Un estudio detallado de la historia del cultivo y de la importancia
socioeconmica de T. tuberosum lo presenta Villamizar (1985).
Teniendo en cuenta las deficiencias nutricionales existentes en grandes
ncleos de la poblacin colombiana. es urgente llevar a cabo estudios de
aquellos productos que. como el cubio, pueden constituirse en alternativas
para la alimentacin. Mediante el cultivo de tejidos vegetales es posible
mejorar la productividad e inducir variaciones genticas que permitan
obtener productos de mayor calidad. Para T. tuberosum no se han reportado
trabajos en Cultivo de Tejidos. excepto el ya publicado por los autores
(Fandio et al., 1987).
El presente artculo
del desarrollo de los
mismos. Igualmente
temperatura sobre el

trata de diferentes aspectos de la anatoma y fisiologa

callos. as como de la rnorfonness
a partir de los
se describe el efecto provocado por la diferencia de
proceso de enraizamiento "in vtro".
MATERIALES Y METOnOS

Se trabaj con plantas cultivadas en predios de la Universidad Nacional

de Colombia. sede Bogot. Se tomaron hojas jvenes. las cuales se transladaron al laboratorio. en donde se lavaron con agua y Teepol. Para
induccin de callo. se separaron explantes de peciolo de aproximadamente
0.5 cm. de longitud. Se desinfectaron sumergindolos en Etanol 70%
durante un minuto y luego en hpoclorto de sodio 1% durante dos minutos.
Despus de enjuagarlos con agua destilada esteril, se colocaron en el medio
de cultivo dentro de frascos de vidrio de 40 mI. Las "siembras" de los
explantes se hicieron en un ambiente asptico dentro de una cmara de
fluido laminar. Para la rmcropopagacn,
se separaron yemas axilares. las
cuales se llevaron al medio del cultivo siguiendo un procedimiento similar.

En todos los cultivos se utiliz un medio bsico conformado por macronutrientes. micronutrientes.
vitaminas y sacarosa segn Murashge y
Skoog (I962). el cual se ajust a un PH inicial de 5.8 y se solidific con
Agar-Agar 7g/litro. Finalmente se esteriliz en autoclave a una temperatura
de 121C y 15 atmsferas de presin durante 20 minutos.
El medio bsico se suplement con reguladores de crecimiento vegetal.
de acuerdo con el propsito de los diferentes cultivos.
Para induccin de callo se emplearon combinaciones de Kinetina (6-furfurilaminopurina) en un rango de 0.1 a 5 ppm con cada una de 1.Issiguientes
auxinas: 2.4-D (Acido 2,4-diclorofenoxiactico) 0.5 a 10ppm; AlA (Acido
Indolactico) 0.01 a 2ppm y ANA (Acido Naftalenactico) 0.5 a 2 ppm. Los

TORRES

O., FANDIO

P., PEREA M.: CULTIVOS

73

IN VlTRO

cultivos se incubaron en condtctonesde luz u oscuridad a una temperatura

de 22C-25C.
El subcultivo de callos para morfognests, se efecto en medio bsico con
combinaciones de ANA0.5-2 ppm y BAP (6-bencilamino purina) 0.5~3 ppm,
a la misma temperatura y con fotoperiodo controlado de 16 horas dartas a
2.000lux.
En el cultivo de yemas. para la mtcropropagacn, se utiliz medio bsico
suplementado con la citoquininas BAP y Kinetina (6-furfurtlaminopulina).
en concentraciones de 0-5 ppm, fotoperodo de 16 horas/da a 2.000 luxo
y se ensayaron tres temperaturas diferentes: 18C. 22C Y 26C.
El enraizamiento de vstagos obtenidos por propagacin "in vitro", se llev
a cabo en medio bsico al cual se le adicion ANA(1-2 ppm). Se mantuvo
el mismo fotoperodo y se ensayaron temperaturas de 18C y 22C.
Los resultados prelimianres de estos experimentos
publicacin anterior (Fandio et al., 1987)

se presentaron

en

Los callos seleccionados para este estudio se mantuvieron en cultivo

prolongado (90-100 das) en oscurdad, en medio bsico con concentracones relativamente altas de 2,4-D (5-10 ppml ry Kinetina (3~5 ppm). a
temperatura constante de 25C.
Para los estudios anatmicos durante la formacin del callo. se observ
prmero la organizacin inicial de los tejidos del peciolo y se tomaron
explantes, cada 5 das. para analizar los cambios histolgicos ocurrtdos.
Igualmente se estudi la anatoma de los organodes regenerados a partir
de los callos.
Las muestras se fijaron en FM durante 12 horas y se sometieron a los
procedimientos corrientes de deshidratacin con Etanol e imbibicin en
parafina para obtener secciones de 7-10 micras. Estas se colorearon con
Fast-Oreen y Hematoxilina. Tambin se hicieron cortes de material fresco
a mano alzada. utilizando Safranina como colorante.
Este trabajo se llev a cabo en el Iaboratoro de cultivo de Tejidos
Vegetales. Departamento de Biologa. Universidad Nacional de Colombia.
Bogot.
RESULTADOS

Y DISCUSION

Formacin del Callo

El peciolo de T. tuberosum presenta un lumen central hacia la parte basal.
el cual va siendo ocupado por tejido parenquimtico a medida que se acerca
a la lamina foliar. Los haces vasculares en nmero de 8;" l O estn
dstrbudos hacia la pertferia rodeados por tejido parenquimtico.
A los 5 das los explantes comienzan a ensancharse a manera de huso.
El examen histolgico demuestra pequeas agrupaciones de clulas indiferenciadas dentro de parnquima. A los lO das de cultivo haygran proliferacin de estos ncleos meristemticos. A los 20 das an se conserva la
forma alargada del explante. El examen histolgico (Fig1) muestra que ha
desaparecido toda evidencia de tejido organizado. y los constituyentes
celulares presentan una composicin heterognea. Se observan zonas con
clulas grandes y vacuoladas de forma irregular y zonas con pequeas
clulas tsodamtrcas de tipo meristemtico.

74

ACTA BIOLOGICA

COLOMI3IANA.

VOL.

l. No. 5

Fi,. l. Seccin

transversal de un explante de peciolo de T. tuberoswn a los 20 das

de cultivado. Obsrvese que ha desparecido la organizacin de los tejidos.
(1) Clulas Indlferencladas. (D) Clulas diferenciadas. 32X.

Esta estructura interna del callo corresponde a la descripcin hecha por

otros autores (Butcher e Ingram, 1876). Los callos consistentes de parnquima uniforme son muy raros; ej: Agave y Rosa (Narayanaswamy. 1977).
Nuestras observaciones permitieron establecer que las clulas parenqumticas son las reponsables de la formacin de callo a partir de explantes
de peciolo de T. tuberosum. Nassuth et. al. (1980), encontraron que la
formacin del callo en explantes de tallo de Coffea canephora se inicia a
partir de todo el tejido parenquimtico localizado entre la epidermis y el
cilindro central. No observaron actividad del cambium vascular. ElIis y
Borman (1971) determinaron que las clulas del cambium vascular dieron
origen al callo en explantes de tallo de nicotiana Tabacum. Raju y Mann
(1970) demostraron para Echeveria eleqans. mejor respuesta de induccin
y formacin de callo. en hojas jvenes sin tejidos vasculares diferenciados.
que en hojas con tejido vascular .dferenctado.
Es posible obtener callos en cultivos "in vttro" de diferentes tejidos tales
como epidermis. parnquima cortical y medular de tubrculos. cotiledones.
endospermo. ovoclulas y otros (Narayanaswamy. 1977). La nultpotencalidad o totipotencialidad varia de una especie a otra y de un tejdo a otro.
de acuerdo con la condiciones de cultivo. origen del explante y edad de la
planta (Tran Thanh Van. 1981).
MORFOGENESIS
Callos de 90-100 das subcultivados para morfogness (fig. 2) dieron
origen. despus de 20-30 das. a unos organodes de color blanco-amarillento. de forma cnica o cilndrica. los cuales crecieron preferencialmente
por encima del medio de cultivo (lIg. 3). De acuerdo con Esau (1965). estos

TORRES

O., FANDIO

P., PEREA M.: CULTIVOS

IN VITRO

75

Fig. 2. Callo de 90 das obtenido a partir del cultivo de un explantc de peciolo.

Fi,.

3. Organodes regenerados despus de 30 das a partir del subeultivo de callos.

76

ACTA BIOLOGICA

COLOMBIANA,

VOL. 1, No. 5

organodes revelan una estructura Interna con caractersticas similares a

las de muchas races. (fig.4 ). Se destaca el cilindro central con sistema
xilemtlco del tipo diarco y unas clulas con paredes engrosadas semejantes
a la endodermis de races de monocotiledneas y dicotiledneas que no
presentan creclmlc;:nto secundara.

Fi,.

4. Seccin transversal de los organodes regenerados a partir de callos. Ntese

el cilindro vascular con xilema tipo dtarco. La flecha indica clulas con paredes
engrosadas del Upo endodrmico. IOOX.

Se present tambin formacin de verdaderas races (organognesls)

delgadas, con abundantes pelos que crecan generalmente dentro del medio
de cultivo.
Si bien el objetivo prncipal del cultivo de callos es la regeneracin de
plar.tas con variaciones genticas aprovechables. mediante los procesos de
organognesis y/o embrogness, esto no siempre es posible debido a que
las clulas han sido sometidas a una serie de procesos traumticos desde
el momento de la excisin del explante. Alteraciones genticas y fisiolgicas
pueden dar origen a formas anormales como las obtenidas en el presente
estudio.
Despus de la excisin. ocurren fenmenos tales como: Incremento de la
permeabilidad de la membrana. destruccin o sin tesis de hormonas de
crecimiento y la consecuente activacion gentica diferencial. cambios en la
actividad de la peroxidasa y en el metabolismo de los compuestos fenlcos,
y muchos otros efectos complejos que afectan el "estado celular Inherente"
(Tran Than Van. 1981).
En la mayora de los casos. la capacidad de regeneracin de vstagos
disminuye con la edad y el subcultivo. pero la capacidad de formar races
puede persistir por aos (Narayanaswamy. 1977). Loewenberg (1969) resal-

TORRES

O . FANDIO

P. PEREA M.: CULTIVOS

t la capacidad de callos de

IN VITRO

77

Cyclamen persicum para regenerar vstagos y

races despus de siete aos de subcultvo.

Otro factor que afecta seriamente la organogness a partir de callos es la
utilizacin de 2-4-D. especialmente en altas concentraciones. El AlA Y el
ANA son auxinas ms adecuadas para mantener la estabilidad cromosmica (Nickell y Torrey. 1969). Para T. tuberosum no fue posible obtener callos
empleando estos dos ltimos reguladores de crecimiento. aunque falt un
estudio ms produndo al respecto.
El 2,4-D es ampliamente utilizado en la induccin de callo. pero los
explantes deben transferirse en corto tiempo a un medio con c.toqunnas
para mantener el potencial de regeneracin del vstago. El mantenmento
de la estabilidad cromosmica en cultivos de callos y clulas en suspensin
constituye. en el momento. uno de los principales objetivos el) las investigactones de organogness "in vtro" (Flck, et al., 1983).
ENRAIZAMIENTO
Los vstagos obtenidos por micropropagacin a partir de yemas que
crecieron en el medio para enraizamiento a una temperatura de 18C.
desarrollaron numerosas races delgadas con abundantes pelos. mientras
que los vstagos incubados a 22C dieron origen a races tuberosas de un
aspecto similar al del tubrculo que constituye la parte comestible de T.
tuberosum (fig. 5). La temperatura es un factor fisico importante que influye
en el desarrollo "in vtro" de diferentes tejidos y rganos vegetales. debido
a su accin sobre los procesos enzimticos del metabolismo celular (Butenko.1968).

Fi,. 5.

Morfologa de races que crecieron a diferentes temperaturas. Izquierda. races

tuberosas desarrolladas en cultivo a 22C. Derecha. races del-tadas (filiformes) obtenidas en cultivo a IBOC.

78

ACTA f3JOLOGICA COLOMBIANA

VOL. 1, No. 5

Es importante anotar que T. tuberosum crece en lugares de bajas temperaturas en donde la produccin de tubrculos es normal. En contraste, la
tuberizacin "in vitro" es favorecida por un incremento moderado de la
temperatura. Este hecho constituye una demostracin significativa de los
fenmenos complejos que se presentan durante los procesos efectuados en
la aplicacin del cultivo de Tejidos Vegetales.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
l. Se estableci que el tejido parenquimtico fue el responsable de la
induccin y formacin de callo en los cultivos "in vtro" de explantes de
peciolo de T. tuberosum
2. Se obtuvo morfogness anormal a partir del subcultivo de los callos,
probablemente como consecuencia del prolongado cultivo de los mismos en
un medio con concentraciones de 2,4-D relativamente altas.
3. Se encontr que la temperatura ejerce una influencia notOJa sobre la
morfologa del enraizamiento "in vtro" de vstagos obtenidos por micropropagacn.
4. Es importante continuar los estudios encaminados a obtener regeneracin de plantas a partir de callos y cultivos celulares de esta especie, con
el propsito de inducir variaciones genticas que permitan. en un futuro
cercano, el mejoramiento de la calidad del producto comestible, y con ello,
incrementar su comercializacin. Otros productos de calidad nutricional
semejante o inferior, como la papa y la yuca, son objeto de programas de
mejoramiento por parte de investigadores del rea de cultivo de tejidos en
entidades internacionales tales como el CIP y el CIAT.
5. T. tuberosum es una especie que presenta gran facilidad y diversidad
de respuestas en condiciones de cultivo "in vtro", por lo tanto, se recomienda utilizarlo como material didctico en cursos de capacitacin.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a los profesores ngela de
Barrera, Hernn Cardozo y Jess Norato del Departamento de Biologa por
su constante apoyo durante la realizacin de este trabajo, y al seor Fabio
Ramrez del Laboratorio de Fisiologa Vegetal por su colaboracin.

TORRES O., FANDIO P., PEREA M.: CULTIVOS IN VITRO

79

BIBLlOGRAFIA
BUTCHER, D. & D. INGRAM. 1976. Plant Tissue Culture. Studies in Biology N 65.
Edward Arnold Publtshers, London.
BUTENKO, RG. 1968. Plant Tissue Culture and plant Morphogenests.
for Scentfc Translatons Jerusalem.

Israel Program

ELLIS, R & C. BORMAN. 1971. Anatorncal aspects of growth prolferaton in Ncoliana

Tabacum tissue cultures in vitro. J.S. Afr. Bot. 37(2): 109-126.
ESAU, K. 1965. Plant Anatomy. John Wiley and sons Inc. New York.
FANDIO, T., O. TORRES, y M. PEREA. 1987.Morfognesis y Mcropropagacn de
Tropaeolum tuberosum. Boletn cientfico de la Asociacin Colombiana de Estudios
vegetales in vitro-ACEVIV. Vol. 1. N 2. En prensa.
FLlCK, C., D.EVANS, & W. SHARP. 1983. Organogenesis. In: Handbook of plant cell
culture. Vol. 1. Technques for propagaton and Breedng, D.A. Evans, W.R
Sharp, P.V. arnmirato and Y. Tamada. (Eds). pp. 13-81.
GONZALEZ, G. Y ROBANDO. 1980. Estudio preliminar de la composicin qumica
del cubio. Trabajo de Grado. Departamento de Qumica. Facultad de Ciencias.
Universidad Nacional de Colombia. Bogot. 111 p.
INTERNATIONAL ASSOCIATION FOR PLANT TISSUE CULTURE. 1985. Newsletter
No.45: 15-22.
LOEWENBERGS, J. 1969. Cyclamen callus culture. Can J. Bot 47: 2W52067.
MURASHIGE, T & F. SKOOG. 1962. A revised medum for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum 15: 473-497.
NARAYANASWAMY,
S. 1977. Regeneraton of plants from Tissue Cultures. In: Applied
and Fundamental Aspects ofPlant Cell Tissue and organ Culture. Reinert, J. y Y.
Bajaj (Eds). pp. 179-206.
NASSUTH, A, T. WORMER, F. BOUMAN, & G. STARlTSKY. 1980. The histogenesis of
callus in coffacanephora stem explants and dscovery of early ernbryod initiation.
Acta. Bot. Neerl. 29(1): 49-54.
NICKELL, L. & J. TORREY. 1969. Crop improvement
culture. science 166: 1068-1069.
PEREZ, E. 1956. Plantas Utiles de Colombia. Sucesores

through plant ccll and tissue

Rivadeneira

~:;'\.Madrid.

Raj, M. & H. MANN. 1970. Regenerative studies on the detached leaves of Echeveria
elegans, Anatomy and Regeneration of leaves in sterile culture. Can J.Bot.
48: 1887-1891.
TRAN THANH VAN, K. 1981. Control of morphogeness
Rev.Plant. Physiol. 32:291-311.

in "in vtro" Cultures. Ann.

VILLAMIZAR;M. 1985. Aporte al conocimiento de: UUucus tuberosos, Oxalis tuberosa

!:I Tropaeolum tuberosum. Trabajo de grado. Departamento de Biologa. Facultad
ele Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Bogot. 148 p.