Rev. Per. Quim. Ing. Quim. Vol. :2 N°, 2009, Pigs. 18-25 APROVECHAMIENTO DE EFLUENTES DE INDUSTRIAS LACTEAS Y LEVADURAS RESIDUALES DE CERVECERIAS PARA LA PRODUCCION DE EXTRACTO DE LEVADURA Y ACIDO ACETICO A. Flores P,; G.' Salas C.2, C. Altamirano C.; A. Patifio G. RESUMEN En al presente trabajo, se efect la produccién de biomasa de Kluyveromyces maranus NRRL-Y-1108 sobre suero lacie desprotenizado y larecuperacion de biomasa de S.cerevisize proveniante de efuente de cerveceria complementado con cultivo sobre melaza de cafia de azicar. Se estableceron como ‘condiciones éptimas par lograr el mimo rencimiento de biamasa: una temperatura de 30 °C, pH ‘Agtacién 600 RPM, un fyjo de aireacién de 1,75 volimenes de ai por volumen de medio por minuto (VVM), conceniracén de lactosa 20 9 ML; (NH, S0, 6g IL; extracto de levadura 15 gl. Se obtvo un rendimiento promedio de: biomasa do 0.58 of9 con K manianus NRRLY-1109 en sueto léteo y un rendimieno de biomasa Yxls 0 48 g/g para Saccharomyces carpuisae en melaza con un rendimiento de 0.45 06, una concentracin collar 12,75 y 11.52 ol. respacvamente a final de la fermentaién. Se ture una cancentracion de Seido actico, (3 giL) por fermentacién aerbica del efluentelqudo de cenveceria, Palabras clave: Cervecerias, 000, fermentaciin acética,vinagre USE OF DAIRY INDUSTRY EFFLUENTS AND WASTE BEER YEAST FOR THE PRODUCTION OF YEAST EXTRACT AND ACETIC ACID ABSTRACT This work was cared cut wih the purpose fo optimize physical chemical panes cblan a microbial tiomass tom Klyreryces marinus NRRL-119 and Sacchronyesscoeusiae. The yeas were jon en suet whey deprtenize,suplenerted wi izogen ard anins sures and molasses 25 fatten source for S corvi. The fementaon pararcers ware. Ar pH 45; Temperate 30°C and fn aeraon rae of 175 VM: Again speed 600 RPU,Lacese concentration § gf; (NH),S0, 6 ol; Yeast extol 1g. The averoge bom yt canes wa 0.58 lactose fox K menzans abd 046 og 5. Cerevisae respectively groan on sweet whey depotenized & mlsses a oolblarconcentabn of 1278 oll & 1152 gl respectively at the end ol aerobic fementation of brewery liquid efent Keywords: Beet, 000, acatc fermentation, vinegar, INTRODUCCION Las levaduras han sido usadas en proce- 805 tradicionales de fermentacién como vi- nos, cervezas y pan, también son usadas como fuentes alternativas de proteinas, en- zimas y vitaminas de alto valor nutricional, tienen numerosas aplicaciones en la indus- tria alimehtaria como aditivos alimentarios, 7 serbcteca@hoinel om, Facute de Gindas Blolgicas,UNNSM. fermentation, It was obtained acetic acd (35 gl) by agentes saborizantes, en la produccién de extractos y medios de cultivo microbiolégi- cose insumos forrajeros. La produccién de extractos de biomasa microbiana con alto contenido proteico y vitaminico, se ha pre~ sentado como una alternativa destinada cub las demandas alimenticias de! hom- bre y de los animales "8 12 2. sles! 9@yahoo.es, Dparamenio de Cperaions Unarias, FCIG-UNMS 18La levadura cervecera es una excelente fuente de vitaminas B, Ca, P, K, Mg, Cu, Fe, Zn, Mn y Cr, ha sido estudiada por sus propiedades medicinales. Es usada para el tratamiento de la diabetes (regulacion de ni- veles de insulina), pérdida de apetito, acné crénico, diarrea, etc. También es recomen- dada como suplemento dietético para la salud del cabello y ufias. En algunos casos causan algunos problemas como fatiga cr6- nica, falta de memoria, inmunodeficiencia, sindrome de de veliga irritable, alergies, debido principalmente debido a antigenos de levaduras y altas cantidades de Cry sa- licilatos", Los efluentes de industrias lécteas como suero ldcteo y cerveceras se caracterizan por una alta carga organica, con azticares residuales del proceso fermentativo y un alto contenido de levaduras. El efiuente ge- nerado por ftracion del proceso de elabo- racion de cerveza. Liega a contener hasta tun 5% (VIV) de alcohol. La accién de los microorganismos presentes en este efluen- te (levaduras cerveceras remanentes de! proceso y bacterias acéticas que se desa- frollan espontaneamente bajo condiciones ‘aerdbicas) hace factible la produccion de extracto de levaduras rico en vitaminas y aminodcidos y Acido acético”®"?. La ma- yoria de los efluentes liquidos de las cer- vecerias estén caracterizados por una alta ‘carga organica, debida a su contenido de azucares remanentes del proceso fermen- tativo y de alcohol etilico. En una cerveceria localizada en la cludad de Lima, uno de los aportes de carga or- ganica mas importantes lo constituye un efiuente proveniente de la sala de bodega y filtracion. Este efluente se genera a razon de 1.5 a 2.0 litros por cada 100 litros de cerveza producida, contiene principaimente ‘carbohidratos, 10-12% piv de levaduras (S. cerevisiae, S. carisbergensis, y §-7% VNV de etanol Las levaduras se almacenan en un "tanque de residuos de levaduras" y se entrega 2 formuladores de alimentos balanceados Rev. Per. Quim. Ing, Quim. Vol. 12 N.°1, 2009. Pigs. 18-25 para animales, quienes aprovechan las le- vaduras. En otras ocasiones, este efluente se convierte en uno de los principales apor- tes a la carga orgénica total del residual de este tipo de industrias, puesto que, aun fitrada, presenta valores de Demanda Qui- mica de Oxigeno (DAO) del orden de los 200,000 mg O,/. El etanol puede llegar a ser responsable de un 50-70% de su DQ0 “soluble” (DQO del flrado). Es importante sefialar que, como parte de la gestion de residuos sdlidos, las empresas cerveceras industriales tratan la biomiasa de levaduras residuales a 86 °C para destruiras y evitar que sean reactivadas por otras empresas, por lo que se liberan levaduras muertas. El extracto de levadura es un producto co- mercialmente valioso, disponible en polvo © en pastas, es usada intensamente como saborizantes en la industria alimentaria, es rica en Acidos nucleicos, principalmente ‘cidos ribonucleicos (ARN). Después de la autolisis e hidrdlisis parcial de ARN, algunos ribonucle6tidos como Guanosina 5-mono- fosfato (GMP) e Inosin 5-monofosfato (IMP) pueden ser extraldos de la blomasa. Estas sustancias son saborizantes eficentes en niveles muy reducidos. Los compuestos responsables de la acci6n intensificadora del sabor en las preparaciones crudas se atribuyen principalmente al glutamato de sodio (MSG), IMP e GMP®, Estos com- puestos acentian los sabores cémicos en los alimentos y encuentran miitiples aplica- ciones como saborizantes"=2" La produccién de extracto de levadura re- quiere la desintegracién de las paredes celulares, Sin embargo, entre los métodos fisico-quimicos y enzimatioos para la ruptu- ra de células de levaduras, el nico método que parece préctico @ escala industrial es fa autolsis"-", La autolisis ocurre a un pH cercano a 5.08. Sin embargo, durante la au- tolisis, e! ARN intracelular normalmente se descompone en sustancias de bajo peso molecular como nucleésidos, 0 bases péri- cas y pirimidicas sin propiedades saborizan- tes, cuando se produce ia autolsis a pH 6.0, ia formacion de GMP es muy reducido”” 19Rev Per. Qui. Ing, Quitn. Vol. 12 N.°1, 2009, Pigs 18-25, MATERIAL Y METODOS: Para la produccién de levaduras sobre sue- ro lacteo desproteinizado, se utilizo Kluyve~ romyces marxianus NRRL-Y-1009, proce- dente de la Northern Regional Research Laboratories ARS-USDA; Saccharpmyces cerevisiae NRRL Y-605 desarrollado sobre melaza de cafia de aztcar, y biomasa de levaduras de efluente de cerveceria, Para la produccion de acido acético se utiiz6 el efluente Iiquido de la filtracion de levaduras el efluente de la separacién de levaduras y se utiiz6 una cepa de Glucono- bacter suboxydans NRRL, haciéndolo de- sarrollar en condiciones aerébicas en tan- que agitado de 100 |, con una agitacién de 300 RPM y 1.8 VVM de aireacion, durante 96 horas. Preparacién de inéculos para procesos fermentativos Elinéculo para fermentacién de suero|lacteo se preparé utilizando el medio de Mawson" 181 ml_con volimenes de trabajo de 100 mL incubados durante 18 horas en un agitador rotario, Allcuotas se transfirieron alicuotas de 20 mi de estos cultivos e incubadas a 30°C durante 18 horas, obteniéndose el inéculo para iniciar la fermentacién. Evaluaci6n de la cinética de crecimiento de las levaduras Los parémetros cinéticos y_rendimiento celular de K, marianus NRRL-Y-1109 y Saccharomyces cerevisiae NRRL-Y60S-, fueron evaluadas en cultivos sumergidos en ote en un reactor agitado de 100 litros del laboratorio de Microbiologia Ambiental y Biotecnologia-UNMSM empleando los pa- rametros operacionales optimizados sobre suero ldcteo desproteinizado y melaza de cafia mas micronutrientes a nivel de matra- ces agitados.© 1" Los indculos fueron preparados a partir de cultivos desarrollados en Agar YPL y trans- feridos a un matraz con 100 mi de suero léc- teo desproteinizado con una concentracién 20 de lactosa 20 gf, (NH,),S0,5 g/l KHPO, 5 gil; extracto de levadura 2.5 gil, incubados 30 °C con agitacion constante (150 RPM) durante ocho horas y luego transferidos en alicuotas de 10 ml a matraces Erlenmeyer con 100 mi del medio descrita o medio con suero lacteo total, suplementado con solu- cién de oligoelementos®. "5 *. Los cultivos “semilleros® fueron incubados a 30 °C, con agitacién de 150 RPM, du- rante 8-9 horas, hasta alcanzar una con- centracién celular de 1-2 x 107 células / mi en medio de Mawson‘ suplementado con solucién de oligoelementos y micronu- trientes: CaCl,.2H,0 0.1 gil; MgSO,. 7 H,0; H,B0,, CuS0,2 H,0 0.1 mg/l; FeCl, 6 H,0 0.15 mgfl; ZnSO, 7 H,0 0.15 mgil. Para el cultivo de S. cerevisiae NRRL-Y-, se utilize el medio de Mawson modificado reempla- zando la sacarosa por sacarosa en concen tracién de 20 gi En el reactor agitado de 100 litros de ca- pacidad, se realizaron varios ensayos de acuerdo @ un disefio factorial simplifica- dot'2, En [os ensayos de recuperacién de biomasa de S. cerevisiae se utiliz6 leva- duras residuales del efluente del tanque y mezclado con una alicuota (50:50) del me- dio resultante del ensayo de produccién de S. cerevisiae NRRL-Y- Determinaciones analiticas. La concen- tracion celular de las levaduras cultivadas fue estimada midiendo la densidad éptica y el peso seco, de acuerdo al protocolo su- gerido por Flores." 9 Las células fueron recolectadas a 4,500 RPM por 15 minu- tos y lavadas dos veces con buffer fosfa- to pH=6.6 y secadas a 105 °C en un crisol hasta obtener un peso constante. Recuperacion de la biomasa Alcanzada la fase estacionariade crecimiento, todo el caldo de cultivo fue centrifugado (12,000 g/t5 minutos). El sedimento se lavé dos veces con agua destilada y se deshidrato (55 °C /18 h) en una estufa Memmert. El residuo seco se deposito en frascos cerrados herméticamente y se almacené a 4 °C.Obtencién de los concentrados proteicos Se prepararon dos tipos de concentrados proteicos: C,) mediante extraccion alcalinay subsiguiente precipitacion isoeléctrica (1; 3; 4,); C, por extraccién alcalina, fosforilacién con trimetafosfato de sodio y precipitacion isoeléctricat'®:?" Hidrolisis de suspensiones celulares Las biomasas de K. marcianus NRRL- Y-1109 y S. cerevisiae fueron recuperadas or centrifugacién a 4,500 RPM por 20 mi- nutos" Para la autolisis de las levaduras, se prepa- r6 una suspensién celular de 10% (P/V) en buffer fosfato pH= 6.4. Se afiadié ell acetato a una concentracion final de 5% (P/V). Las suspensiones celulares fueron incubadas a 35-50 °C por 18-24 horas, las levaduras au- tolisadas fueron centrifugadas a 4,500 RPM pot 20 minutos. Los pellets fueron descarta- dos, recuperéndose los sobrenadantes para posteriores analisis. Parte de los autolisados de levaduras fueron secados a 95 °C por 3-4 horas, la hidrélisis del ARN fue logrado por accion enzimético de 5-fosfodiesterasa por 10 horas a 55 °C (PIV) de acuerdo a Ta- nekawa, 1981.2"! La enzima fue inactivada Por tratamiento térmico a 96 °C por cinco minutos. La concentracién de ARN fue de- terminada por espectrofotometria segtn De Palma Revilion, et al" Para las determinaciones de humedad, proteina cruda, cenizas, nitrégeno no pro- teico se siguié la metodologia de Official Methods of Analysis A.O.A.C. Intemacio- nal". La proteina verdadera se determind mediante la diferenola entre el nitrégeno total y el nitrogeno no proteico, la grasa por Rev, Per. Quit. Ing, Quim, Vol. 12 N.°1, 2009. Pigs. 18-25 el método de Soxhlet, carbohidratos por diferencia y los acidos nucleioos segin el método empleado por Michell et al La concentracion de proteinas fue determi- nada por el método de Folin-Ciocalteau; los ‘carbohidratos por el método Fenol-Suifurico y por el método de Miller. La composicion global del extracto de levadura fue determi- nada siguiendo los protocolos propuestos por la AOAC, 1984" Se determiné la concentracién de Acido ‘acético por titulacién con solucién de NaQH 0.5 N y del pH utilizando técnicas estanda- rizadas.") RESULTADOS La optimizacion de pardmetros de produc- cién de biomasa de las levaduras Kluyve- romyces marxianus Y-1109 sobre suero lacteo desproteinizado y S. cerevisiae so- bre melaza de cafia de azcar suplemen- tado con fuentes de N determinados en experiments preliminares fueron: 1,475 voliimenes de aire por volumen de medio por minuto (VVM), concentracién de lac- tosa 20 gil; (NH,),0, 6 gil; extracto de levadura 1.5 gil, Se obtuvo un rendimiento promedio de: biomasa de 0,58 g/g lactosa, con K. mar- xianus NRRL-Y-1109, una concentracion celular 12,75 g/g: Para Saccharomyces cerevisiae y un rendimiento de biomasa Yxls 0 46 g/g y 10.52 gil, siendo sus paré- metros 6ptimos: Sacarosa 25 g/l; concen- tracion de sales y extracto levadura 5 gi agitaci6n 6000 PM: aireacién 1.825 VVM, con una p, de 0.36 hrs.~"y un tiempo ge- neracional de 1.98 h. (Tabla N.° 1 ). 21Rev. Per. Quim. Ing. Quim. Vol.12 N° 1, 2009, Pigs. 18-25 “TENPO EN HORAS Fig. N.°4. Cinética de crecimiento de S. cerevisiae NRRL-Y- en condiciones optimizadas. Tabla N° 4, Evaluacion de parametros cinéticos de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae sobre melaza de catia de azticar en reactor agitado de 100 its. cone. Velo Tiempo Wea gy Size eu SN eeccg, oman mt Tes ae aaa 2 ts ms 2rrO~E5 0m OE 9b MaROMbion URS x0q aD aU MLN okt 4% atest a re ee ee $5 Tape Pence 146 ebeyiOl: gif ancaip eC 7&8 mma 8G Siagenih sig OMG SS 14 on a D2R FA op 238 pe os mts ta Preparacién y caracterizacién de los con- contrados proteicos Para evitar la coprecipitacion de acidos nu- leicos a bajos valores de pH ®ly debido a que no se observaron grandes diferencias en los valores de pH de minima solubilidad de las proteinas, los concentrados por pre- cipitacién a pH 4. La composicién quimica de los mismos y del extracto obtenido de ellos se muestra en las Tablas 2, 3 y 4 para ambos tratamiento. Todos los parémetros, a excepcion de la humedad y la proteina verdadera, mostra- ron diferencias significativas entre los trata- 22 mientos estudiados (C, y C,). El contenido de cenizas en C, resulté estadisticamente mayor que en C1, como era de esperarse ya que parte de Ie sal utiizada en la fosfo- filacién proteica durante la elaboracion det concentrado C, queda remanente forman- do parte del producto final. En cuanto al contenido de grasa, éste result signficat- vamente mayor en C1 que en C,, Los valo- res obtenidos para ambos concentrados se aproximan a 3,58% 4,1% Los resultados del presente estudio de- muestran que se puede obtener un concen- trado proteico a partir de biomasa microbia- na Kluyveromyces marxianus NRRL-Y-1109y S. cerevisiae residual de cerveceria cul tivadas en suero lacteo desproteinizado y melaza de cafia de aztcar respectivamente Los valores de rendimiento y la concentra~ cién celular obtenidos fueron satisfactorios para estos microorganismos, En relaci6n con la extraccién de extracto de levadura puede observarse en la Tabla 2, que el tratamiento de biomasa de K. mar- xianus y S. cerevisiae en concentraciones de 80-100 gil a 50 °C por 8 horas es el mas eficiente para inducir la autolisis celular con una solubiizacién de 50% de proteinas coincidente con los reportados por Orban et al.; Revillon J.P. ef al, quienes demuestran ademas que los tratamientos celulares pre- vios con NaC! 5% o la ruptura mecanica de células no modifican el proceso autolitico. En la Tabla 3, se observa que el tratamien- to termico no influye significativamente en la liberacién de proteinas intercelulares. La maxima concentracién de proteinas solu- bles se observa a 37 °C por 12 horas, esto podria explicarse como sugiere Revillin a que el etl acetato al 5% (P/V) es un eficien- te agente permesbilizante. En cuanto ala produccién de acido acético, se observé que la concentracién de micro- organismos en el reactor, aumenta hasta el tercer dia, esto nos indica la capacidad de las levaduras remanentes en el efluente y bacterias aceticas de metabolizar el etanol y los aziicares remanentes en condiciones aerdbicas. Hacia el cuarto dia de! experimento de produccién de acido acético, se presenta tun maximo en la concentracion de micro- organismos (1.25 x 10" UFC/mL) y en la ‘concentracién de Acido acético, (3.5 g/L) acompafiados de un minimo de la DOO (2,100 mg O/L), se debe considerar que ‘a excepcién de algunas especies como el Gluconobacter™, la mayoria de las bacte- rias acéticas son capaces de procesar el etanol a dcido acético, especialmente si los demas nutrientes organicos se tornan es- casos. Rev Per. Quitn Ing. Quin, Vol.12 N.°1,2009. Pégs. 18-2 Tabla N° 2, Composicién quimica de los con- centrados proteicos de K Manianus NRRL- ‘¥-1109 y levadura residual de cerveceria, Tormey Scan Timo Gob Genco mumps 1 ©, Concentrada proteice por extraccién alcalina y preciitacén soeléctrca , Concentrado proteio por extracién aleana, foste- rlacion con trimelafostate de socio y precptacion isoeléctrca Tabla N.°3. Liberacién de proteinas solubles por diferente procedimientos de autolisis en K. Mar- xlanusyy 8, cerevisiae residual de cerveceria. BU obsonsy B Tabla N.* 4, Composicién del extracto de leva- dura de blomasa de K. marxianus NRRL-1109 y S. cerevisiae residual de cerveceria 23Rev. Per. Qui, Ing, Qui. Vol. 12 N.°1,2009. Pags. 18-25, CONCLUSIONES Los resultados obtenidos indican la factibil- dad de producir extracto de levadura rica en proteinas, vitaminas y aminoacids y acido acético a partir de una biomasa de K. mar- xianus, S. cerevisiae y efluentes industriales de las cervecerias, fermentacién de suero lécteo en condiciones aerdbicas, a través de lun proceso que involucra operaciones muy sencillas como la agitacién y la aireacion, El producto de desecho de cervecerias se puede convertir en materia prima para pro- ducir un producto que podria ser comerciali- zado come extracto de levaduras y “Vinagre de cerveza’, si se lograra la concentracién de acido acético minima permitida (Codex alimentarius). El costo cero dela "materia pri- rma’, la sencillez del proceso y de los equipos requeridos permiten vislumbrar su rentabili- dad, aun si se debiera incorporar una etapa de pasteurizacion del producto final para asegutar su inoculdad y una clarificacién (p. ej, con carb6n activado) para mejorare! aspecto visual del producto. El tratamiento previo es muy sencilo: as levaduras conteni- das enelefiuente “crudo’, de poca actividad biol6gica por el origen del efluente, pueden ‘separarse mediante procesos fisicos como la centrfugacion 0 la sedimentacion en frio y sometidos a procesos de autolisis para ser comercializadas con destino ala formulacién de alimentos balanceados para animales, contribuyendo de este modo al balance econ6mico del proceso. El proceso propuesto de produccién de vinagre de cerveza permite una disminucion de la carga orgénica del efluente, con el consiguiente Impacto favorable en el disefio ylo la performance del proceso de tratamiento. El estudio del comportamiento de bacterias acéticas perfectamente identificadas, en lo que a cinética y rendimientos respecta, resultaré de suma utilidad en el disefio del proceso a escala industrial 24 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS [1] Akiyama S, DIM, Arai Y, Nakoa Y, Fu- kuda H, Production of Yeast biomass US. patent 3, 909, 632. 1975. ‘AOAC Official Methods of analysis 17" ‘ed. Association of official Analytical Chemists, Washington. BabayanTL, Bezrukov MG. Acta bio- technol, 1985. 5, 129-136, Bekatorou A, Psarianos C, Koutinas A. 2006 44 (3): 407-415. 2] 3} 4] [5] Berstein S, Tzeng Ch. Environmental Protection technology series. 1977, EPA.600/2-77-133. Behalova B, Beran K. Folia Microbio- logica, 1979. 24: 455-461 Belem MAF, Gibas BF, Lee BH. J. Food Sci, 1997.62:851-857. Codex alimentarius, Art.1328 y 1335, Capitulo XIV, Res. MS y AS N° 80/82. Dziekak JD. Food technol. 1987. 41 104-112 Palma Revillion JP de, Brandelli A, Zachia A. M.A. (2003): Braz. Arch, Biol. 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