Pontificia Universidad Catolica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 1. DATOS INFORMATIVOS: MATERIA 0 MODULO. LABORATORIO CLINICO PRACTICAS CARRERA. MEDICINA NIVEL: SEGUNDO N° CREDITOS: 1,5 (UNO COMA CINCO) CREDITOS TEORIA: 1 CREDITOS PRACTICA: 0s DATOS DEL PROFESOR: Nombre: Celia Annabel Bowen Feméndez Grado Académico o Titulo Profesional: Dra. Bioquimica y Farmacia opcién Biog. Clinica Breve indicacién de la linea de actividad académica: Docencia en diferentes en diferentes ramas de la patologia clinica (Laboratorio clinico y Microbiologia), coordinadora de los laboratorios en el area de Destrezas Clinico Quinirgicas Indicacién de horario de atencién a estudiantes: Martes, Miércoles y Viernes 12:00 a 13.00 horas Correo Electrénico: bowencelia@yahoo es Teléfono: 084678618 PROFESOR: Grado académico o titulo profesional: Dra. Bioquimica y Farmacia opcion: Biog, Clinica/ Diploma Superior en Pedagogias Innovadoras 2. DESCRIPCION DE LA MATERIA: En este nivel dela carrera se estudian los fundamentas basicos del laboratorio clinico, su estructura y organizacion dentro de un servicio de salud, sus funciones y se dan las primeras correlaciones de las pruebas de laboratorio con casos clinicos. Se aprende el uso racional de las pruebas mas comunes y se pretende incentivar al estudiante a tomar con conciencia critica las solicitudes de laboratorio y rescatar la interpretacion clinica como elemento fundamental dela Medicina de Laboratorio. 3. OBJETIVOS GENERAL: Reconocer la metodologia y realizacion de las pruebas basicas de laboratorio clinico con el fin de corroborar la presencia y las concentraciones de los diferentes analitos en las muestras bioldgicas, con la morfologia y fisiologia del individuo normal, estudiadas en las demas areas de las ciencias morfofuncionales del segundo nivel de la carrera 4, ESPECIFICOS: 4.1, ACTITUDINALES a. Compartir conocimientos y experiencia durante el proceso de aprendizaje b. Mangjar adecuadamente el manejo del microscopio seguin las normas indicadas c Identificar y cumplir las normas de bioseguridadSe, Pontificia Universidad Catolica del Ecuador 5 Facultad Medicina % £ Av. 12 de Octubre 1076 y Roca P ‘Apartado postal 17-01-2184 4.2. PROCEDIMENTALES: a. Revisar el método de la puncion venosa y capilar y realizar el procedimiento b. Aprender a preparar soluciones y diluciones y su aplicacién para deducir las unidades de medida utilizadas en el Laboratorio c. Realizar y explicar los pasos del examen elemental y microscépico de orina y del coproparasitario y su respectiva interpretacion 4. Realizar eximenes de glucosa, colesterol, tirea, transaminasas y bilirrubinas asi como relacionarlos con al respectivo diagndstico en caso de haber alteraciones 4.3. COGNITIVOS: a. Revisar los anticoagulantes y tubos de ensayo utilizados en las pruebas mas comunes b. Especificar el fundamento de las pruebas bioquimicas enzimo-colorimeétricas, de la espectrofotometria y Los calculos matematicos necesarios c Conacer la técnica de electroforesis y las diferentes fracciones proteicas sanguineas 5. CONTENIDOS 1. Laboratorio clinico: Normas de bioseguridad PRIMERA SEMANA I* rotacién, DECIMA SEMANA 2*rotacion 2. Toma de muestras de sangre, anticoagulantes, tubos al vacio PRIMERA SEMANA !*rotacién, DECIMA SEMANA ®*rotacion 3. Soluciones y diluciones, unidades de medida SEGUNDA SEMANA I* rotacion, DECIMA PRIMERA SEMANA 2*rotacion 4. Elemental y microscopic de orina TERCERA SEMANA I* rotacién, DECIMA TERCERA SEMANA *rotacion 5. Parasitologia, coprologico-coproparasitario. CUARTA SEMANA I" rotacion, DECIMA CUARTA SEMANA rotacion 6. Carbohidratos’ glucosa QUINTA SEMANA I* rotacién, DECIMA QUINTA SEMANA 2" rotacion. 7. Lipidos: colesterol QUINTA SEMANA I* rotacién, DECIMA QUINTA SEMANA 2" rotacion. 8. Proteinas: electroforesisy examen quimico SEXTA SEMANA I*rotacion, DECIMA SEXTA SEMANA ”"rotacién. 9. Funcién renal: urea SEPTIMA SEMANA I* rotacién, DECIMA SEPTIMA SEMANA 2*rotacién 10. Pruebas de funcién hepatica: transaminasas, bilisrubinas OCTAVA SEMANA I* rotacion, DECIMA SEPTIMA SEMANA * rotacion 6. METODOLOGiA, RECURSOS: 6.1. Métodos didacticos a. Charla de fundamentacién tedrica . Explicacion practica y observacion c. Realizacion de practicas de pruebas de laboratorio 6.2. Recursos a. Uso de manval de practicas de Laboratorio Clinico b. Toma de fotos con respecto a las practicas realizadas en clases (smartboard) c. Uso de Atlas de sedimento uinanto y parasitos ‘scart Dra, Celis Bowen Pagina 2Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 4. Equipos de Laboratorio de Clinico (Microscopios, incubadora, centrifuga, espectrofotometro, etc.) € Reactivos varios £ Muestras bioldgicas varias 7. EVALUACION: 7.1. CRONOGRAMA DE EVALUACIONES: era, Evaluacién (promedio de lecciones): Cada semana 2da. Evaluacién (teorica): Octava semana 3ra, Evaluacion (practica + carpeta): Novena semana SISTEMA DE CALIFICACION: _ . EVALUACIONES PARCIALES PRACTICA YTEORICA: 30 puntos 10 puntos de cada una de las evaluaciones mas trabajos o promedios de lecciones indicadas en el cronograma Nota final: 20 puntos Primera parte’ 10 puntos con un examen final del Area de Practicas en la semana 8 y 18 dela rotacién ‘Segunda parte (examen integrador de la Macrodrea de Morfofuncion): semana 9y 18 dela rotacion 8. BIBLIOGRAFIA: TEXTOS DE REFERENCIA: © Angel M,G.yM Angel R., Interpretacin Clinica del Laboratorio, 6. edicion, Editorial Médica Panamericana, Bogota, 2.001 ‘Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, 0. M. 8., Ginebra, 1.994 TEXTOS s RECOMENDADOS: Henry, J. B., Diagnéstico y Tratamiento Clinicas por el Laboratorio, 9° Edicién, Editorial Salvat Médica, México, 1.993 ‘Métodos Basicos de Laboratorio en Parasitologia Mética, O.M. S., Ginebra, 1.992 ‘Moran Villaroto, Obtencién de Muestras Sanguineas de Calidad Analitica, Editorial ‘Médica Panamericana, México, 2.001 PRACTICA No. 1 ‘store: Dr, Ce Bowen Pagina 3ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador “Facultad Medicina # ‘Av. 12.de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO CLINICO Definicién: Conjuntos de normas y procedimientos para obtener una situacién carente de riesgos 0 con riesgos limitados. PRECAUCIONES UNIVERSALES: 1. Acceso restringido, permitido solo a personas autorizadas 2. Prohibido usar el celular, comer, fumar, beber o almacenar comidas o cualquier objeto de uso personal dentro del laboratorio. 3. Usar ropa protectora de trabajo como mandil, mascarillas, guantes (de latex) la misma que debe ser retirada antes de abandonar el laboratorio. Botas y gorra en casos de exposicin a microorganismos de alta peligrosidad 4. Antes de iniciar cualquier actividad en el laboratorio asegurarse de que en la mano no existan escoriaciones. En caso contrario cubrir las mismas de manera adecuada Cambio inmediato de los guantes en caso de rotura y lavado de manos. No tocarse la boca ni los ojos con las manos enguantadas Evitar la formacion de aerosoles y gotas Manejo adecuados de los objetos corto punzantes. Una vez utilizados se deben almacenar en recipientes rigidos y eliminarse luego de ser decontaminados Terminantemente prohibido pipetear con la boca Debe utilizarse los pipeteadores automaticos 10, Decontaminar las superficies de trabajo una vez terminado el trabajo diario Se recomienda el uso de hipaclorito de sodio al 10% 11. Evitar conductas inseguras y de riesgo. 12, Manejo adecuado de los desechos desde el lugar de origen y realizar tratamiento adecuado especialmente de los infecciosos. 13, Los desechos de los fluidos corporales pueden eliminarse por las cafierias hebituales una vez que hayan sido decontaminados. 14, Lavarse las manos con abundante agua y jabén luego de haber terminado el trabajo diario 15, Plan de inmunizaciones para el personal de laboratorio ana TRABAJO EN CLASE: Poner en practica las normas anteriores durante cada sesion de laboratorio PRACTICA No. 2 ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 4ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 Tema: Toma de muestras de sangre (venosa y capilar) Objetivos: 1. Conocer la técnica para la obtencién de muestras de sangre como medio para mantener la integridad del profesional de salud y la del paciente 2. Adiestramiento adecuado para el manejo de instrumentos necesarios en la toma de muestras sanguineas 3. Aplicar las precauciones universales de bioseguridad en el laboratorio con respecto al manejo de liquidos biologicos y material infeccioso 4. Conocer los usos de los diferentes anticoagulantes empleados en el laboratorio Fundamente teorico: La relativa facilidad con que se obtiene la sangre venosa hace de esta técnica el principal método de obtencion de sangre en los laboratonios de andlisis clinicos. A partir de la sangre sin anticoagulante se obtiene suero, si la sangre contiene anticoagulante, se obtiene plasma, Del plasma forma parte el fibrindgeno, sustancia de la que carece el suero Materiales: -Torniquete -Algodon -Alcohol antiséptico Gsopropilico al 70%) -Jeringuillas -Sistema vacutainer: capsula, tubos alvacio, agujas de toma miltiple - Lancetas -Tubos capilares heparinizados -Plastilina Tecnica dela puncion venosa: 1. Seidentifica al paciente comprobando que la solicitud de examenes comesponda al mismo 2. Si se solicita una muestra en ayunas, debe comprobarse que efectivamente el paciente no ha ingerido alimentos 3. Hay que dirigirse al paciente e informatle sobre el procedimiento a que va a ser sometido, Se debe tranquilizarle, eliminando en lo posible su tension 4. Seha de colocar adecuadamente al paciente, segiin éste se encuentre sentado, 0 en decibito prono, para tener acceso facil y comodo ala fosa antecubital 5. Hay que preparar todo el material, incluidos los tubos para recogida de la muestra, el tomiquete, los abjetos que se emplean para limpiar la piel, las jefingas, cuando sea necesario, la aguja esténil para extraccion de sangre y dispositivo utilizado para jar la aguja al tubo de extraccién al vacio 6. Se solicita al paciente que cierre el pufio para que las venas resulten mas palpables 7. Se seleciona una vena adecuada para la puncién. Se prefieren las venas de la fosa antecubital, en particular la cubital intema y la cefélica También pueden ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 5ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 utilizarse las venas de la mufieca, el tobillo y la mano. Si existiera ya un catéter intravenoso en un brazo, se utilizara el otro para la extraccién de la muestra 8. Preparar la capsula insertando la aguja pero dejando un poco flojo la capucha de la parte extema de la misma para retirarlo al momento de la puncion 9. Se aplica un torniquete varios centimetros por encima de la zona de puncién (aproximadamente a cuatro dedos sobre el doblez del brazo). No hay que dejar nunca el torniquete mas de 1 minuto. En casos excepcionales no debe usarse el tomiquete, por ejemplo cuando en el pedido esta el Calcio 10, Se limpia la zona de la venopuncién con una torunda embebida en solucién en alcohol antiséptico. Se comienza en el punto de la puncion y se prosigue la limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento en espiral. Se deje que la zona se seque y no se toca con ningun objeto que no haya sido esterelizado previamente 11. Se ja firmemente la vena tanto por encima como por debajo del lugar de puncién, con la ayuda de los dedos pulgar y medio, o indice y pulgar. 12, Se realiza la venopuncién, a) Se penetra a través de la piel con la aguja formando un angulo de aproximadamente 15° con el brazo y con el bisel hacia arriba. Se sigue la direccion de la vena con la aguja. B) Se introduce la aguja con suavided pero con la suficiente rapidez para reducir las molestias del paciente No hay que enterrar la aguja C) Si se utiliza una jeringa, se tira hacia atras del émbolo, con tensién lenta y uniforme a medida que la sangre va fluyendo en su interior. No debe realizarse este movimiento con excesiva rapidez, ya que podria hemolizarse la sangre o colapsarse la vena. d) Si se utiliza un tubo al vacio, en cuanto la aguja haya penetrado en la vena, se dirigira el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositive de sujecién. Al mismo tiempo se sujeta tenuemente la aguja en su lugar. Una vez que haya lenado el tubo, se retira, cogiéndolo por su extremo y tirando suavemente de él 13, Cuando la sangre comience a fluir, se suelta el torniquete. 14, Una vez que se haya extraido toda la muestra, hay que indicar al paciente que relaje el puiio y que no bombee con la mano 15, Se coloca suavemente sobre el punto de la puncién una bola de algodén estéril Se extrae la agujay a continuacidn se ejerce presién sobre la zona 16, Se venda el brazo. En general es suficiente una tira de esparadrapo sobre la bola de algoden, para detener la hemorragia. 17, Se mezclan los tubos con el anticoagulante. Si la muestra ha sido extraida con jefinga, se transferiré la sangre alos tubos correspondientes tomando las debidas precauciones para evitar la hemélisis de las muestras, 18, Se comprobara el estado del paciente, por ejemplo, si se ha mareado y si la hemorragia esta controlada 19, Se elimina el material contaminado: agujas, jeringas, algodones, etc 20, Se marcan las etiquetas y se registra la hora en que se extrajeron las muestras. 21,Se envien los tubos de sangre para su andisis a los correspondientes departamentos del Laboratorio. Si es preciso, se hace constar la hora en la solicitud Puncién capilar: ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 6Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 1. Tener todo el material en perfecto orden: algodén, alcohol, lancetas, tubos capilares y plastilina Pedir al paciente que se frote el dedo pulgar hasta que obtenga una buena inrigacion de la zona de puncion Desinfectar la zonay secatla con otro algoden libre de alcohol Sacar la lanceta y realizar la puncidn de forma répida y firme Deshechar la primera gota para evitar contaminacién con restos de alcohol. Colocar el capilar en la zona e ir llenandolo hasta las tres cuartas partes del tubo Retirarlo de la zona y colocar un algodon con poco alcohol y solicitar al paciente que se sostenga por unos minutos para que deje de fluir la sangre 8. El capilar sellarlo con plastilina y colocarlo en el lugar designado para ese paciente awe Anticoagulantes utilizados con mas frecuencia, EDTA (tapon lila): Tubo estéril con anticoagulante EDTA: sal de acido etileno diamina tetracético di o tripotasica o di sédica, concentracion: 1,2 a 2,0mg/ml de sangre(4,1 a 6,8mmol/l de sangre) basado en EDTA anhidro. Para uso en hematologia Citrato de sodio (tapén azul 1/9 y tapén negro 1/4): citrato trisédico con 0,100 a 0,136 mol/l de acido citrico. Se recomienda 0,105 mol/l para lograr la estandarizacién recomendada por la WHO para que quede a 3,2%, Se usa para pruebas de coagulacién (TP, TTP, fibrindgeno), utilizar | parte de citrato y 9 de sangre entera Tapén rojo: Tubo estéril sin anticoagulantes ni aditivos ni geles separadores. Para obtener suero Los tapones de colores con una banda Gris agregada indican que el tubo corresponde a uno los anteriores y que ademés contiene gel separador de suero o plasma TRABAJO EN CLASE: Estudiar bien las instrucciones anteriores para ponerlo en practica con algiin compaiiero de clase PRACTICA No.3 Tema: Soluciones y diluciones Objetivos: ~ Conocer lo que es un solute y un solvente para preparar soluciones a diferentes concentraciones - Conocer dos formas de expresar matematicamente la proporcién de soluto a solvente dentro de una solucion (piv y viv) ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 7ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador “Facultad Medicina # ‘Av. 12.de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 ~ Realizar diluciones simples a partir de una solucion Fundamente tesrico: Las soluciones son mezclas homogéneas de dos o mas substancias, que pueden separarse por métodos fisicos en sus diversas substancias componentes. En una solucién, aquella substancia que se encuentra en mayor proporcién se conoce como Solvente y las demas como Solutos Existen varias formas de expresar la concentracién de una solucion, esto es, la proporcién de soluto a solvente. Para efectos cualitativos, frecuentemente se habla de soluciones diluidas, concentradas, saturadas 0 sobresaturadas. Aunque existen diversas formas de expresar mateméticamente la proporcién de soluto a solvente dentro de una solucién, las de uso mas extendido suelen ser Molaridad, el Porcentaje Peso a Volumen, el Porcentaje Peso a Peso y las Partes por Millén. El porcentaje Peso a Volumen es una relacién que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en cada 100 mililitros de solucion. Materiales y reactivos: Materiales: - Probeta graduada de 50 ml - Vaso de precipitacion de 50 ml - Matraz aforado de 50 mi - Pipetas graduadas de: 1, 2, 5 y 10 ml - Peas de seguridad - Tubos de ensayo - Gradillas - Balanza - Vailla de vidrio Reactivos: - Safranina en polvo ~ Cloruro de sodio en polvo - Agua destilada Procedimiento: 1. Método para preparar soluciones: Unidades de medidas piv = peso de soluto sobre volumen de solvente expresado en gr/ 100ml viv = volumen de soluto sobre volumen de solvente expresado en ml/100 ml. Ejemplo de soluciones p/v: Preparar 50 ml. de solucién de NaCl (cloruro de sodio) al 0.85% en agua destilada Datos Vi=50 ml. ‘V2= 100 ml ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 8Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 Concentrac. Solucién= 0.85% (pesar 0.85 gramos de NaCl y aforar con agua destilada hasta obtener 100 ml de solucién) 0.85 gr. NaCl —> 100 ml agua destilada x > 50 ml agua destilada X= 0.425 gr. de NaCl disolver en agua destilada hasta obtener 50 ml de solucion Ejemplo de soluciones viv: Preparar 40 ml. de solucién de Etanol al 70% en agua destilada Datos Vi=40 ml. ‘V2= 100 ml Concentrac. Solucién= 70% (70 ml de etanol puro diluidos en 100 ml de agua destilada) 70 ml de etanol ——> 100 ml agua destilada x — > 40 ml agua destilada X= 28 mi, de etanol puro diluir en 12 ml de agua destilada para obtener una solucién de 40 mi de etanol al 70% 2. Método para realizar diluciones Partiendo de una solucign cualquiera que sea su concentracién las diluciones se realizan del siguiente modo Si se tiene una solucion HCI (acido clorhidrico) y se quiere diluir en agua destilada 1-20 para obtener un volumen final de 50 ml se realiza los siguientes calculos Iml de soluc, HCl __, 20 ml. de agua destilada x —> 50 ml de agua destilada X=2.5 ml de HCl se necesita para obtener una solucién de 50 mi en agua destilada (medir 47.5 ml de agua) 3. Para obtener el factor de dilucion: Utilizando el ejemplo anterior el factor de dilucidn se obtiene del siguiente modo Fd= Volumen mayor = ‘Volumen menor (alicuota)— La solucién en efecto esta diluida 20 veces PRACTICA No. 4 Tema: Elemental y microscépico de orina Objetivos: ‘scart Dra, Celis Bowen Pagina 9ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 1. Analizar la orina realizando examenes macréscopico, quimicos y microscépicos enlamisma 2. Correlacionar los parémetros anelizadlos con enfermedades renales o del tracto urinario Definicion de examen rutinario de orina: Es un examen fisico y/o quimico de la orinay comprende una serie de pruebas quimicas y microscopicas para evaluar infecciones del tracto urinario, enfermedad renal y enfermedades de otros érganos que provocan la aparicion de metabolitos anormeles (productos de descomposicién) en laonina El examen elemental y microscépico de orina consta de tres partes: 1) Macroscépico: color, aspecto 2) Quimico (tira reactiva). pH, leucocitos, proteinas, glucosa urobilindgeno, biliubina, cuerpos cetonicos, sangre 3) Microscépico: leucocitos, eritrocitos, células bajas, células altas (se reporta numero por campo en 10 camposcon lente de 40x), moco, bacterias, cristales, parésitos, hongos (se reporta por cruces en 10 campos con lente de 40 x) y cilindros se reporta ntimero por placa (con lente de 10x) 1. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina a El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la farmacia uno estéril apropiado para la recoleccién de orina b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la mafiana c. Practicar previo aseo genital, con aguay jabén, sin dejar residuos. Esto es especialmente importante en la mujer que debe lavarse el area entre los labios de Ja vagina y evitar la contaminacién de la muestra con crema, antisépticos y secreciones vaginales, Los hombres y nifios deben limpiarse la cabeza del pene 4. Deje escapar la porcién inicial de la miccién al inodoro, a continuacién recolecte en el frasco la porcion media (10 ml) y descarte la porcién final de la miccion nuevamente en el inodoro e. Tape bien el frasco y entréguelo rapidamente al Laboratorio (maximo dos horas luego de tomar la muestra). NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual 2. Método para el anilisis de orina macroscépico y quimico: a Después de recibir la orina en el laboratorio, analizarla tan pronto como sea posible, Antes del andlisis las muestras de orina deben estar a la temperatura ambiente b. Realizar la homogenizacién dela orina c. Con movimientos moderados en el recipiente transportado hasta el laboratorio (bien mezclada y no agitada) ‘Verter en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm aproximadamente 10 ml e. Determiner el color, aspecto (nitidez) £ Registrar la presencia de un olor inusual y de cantidades anormeles de espuma coloreada ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 10ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 g. Sumergir brevemente la tira reactiva, no mas de un segundo (evitar tocarla con los dedos, ya sea antes o después de sumergirla) h. Eliminar el exceso de orina en Ja tira: limpiar el borde de la misma con el reborde del tubo o con papel secante i. No permitir que los reactivos de la tira se junten j. No depositar la tira reactiva directamente sobre la superficie de trabajo k. Seguir exactamente las recomendaciones en cuanto al tiempo para cada test quimico 1 Mantener la tira reactiva junto a la carta de colores y leer bajo una buena iluminacion m. Tener en cuenta las fuentes de error, la sensibilidad y la especificidad de cada prueba con latirareactiva 21. Parametros que se observan en el examen macroscépico : En el examen macroscopico se analiza el aspecto como por ejemplo si es trasnparente, ligeramente turbia, turbia, espesa, opacay el color de la orina que puede ser amarilla pélida, amarilla oscura, amber, roja verde, azul entre otros 22. Parametros que se observan en el examen quimico: ¥ Densidad (6 gravedad especifica) Registra la concentracuién iénica de la orina (es decis, qué tan concentrada o diluida se encuentra). Se basa en la liberacion de protones por un formador de complejos en presencia de cationes Esto causa un viraje de color del indicador azul de bromotimol, de azul hacia amarillo, pasando por verde azulado “pH Indican la acidez o alcalinidad de la orina. Los valores pH més frecuentes en orina fresca de personas sanas se encuentran entre 5 y 6. El test es especifico para la deteccion de iones hidronio, siendo el valor pH el logaritmo decimal negativo de la concentracién de iones hidronio. El papel reactivo contiene los indicadores rojo de metilo, fenolitaleina y azul de bromotimol ¥ Leucocitos Comprueba la actividad esterasica de granulocitos, Esta enzimas desdoblan un éster de indoxilo a indoxilo, que reacciona con una sal de diazonio formando un colorante violeta se detectan leucocitos intacto y también los lisados (indicio de IVU) ¥ Nitrito: Los agentes patogenos mas frecuentemente causantes de infecciones de las vias urinarias, E. coli y la mayoria de los gérmenes patogenos urinarios, transforman el nitrato absorbido con Ja alimentacién en nitrite. Este es detectado por una coloracién del rosa al rojo de la zona reactiva, El ensayo se basa en el principio de la prueba de Griess y es especifico para el nitnito Gndicio de IVU) ¥ Proteinas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de pH y reacciona de manera especialmente sensible ala albimina ¥ Glucosa: La deteccién de glucosa se efectia segin el método especifico de la glucosa-oxidasa-peroxidasa “ Cuerpos cetonicos: La deteccion se realiza en el principio de la prueba de legal y reacciona més intensamente al acido acetilacetico que a la acetona Las ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 11ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con inanicién y diabetes ¥ Urobilindgeno: Es un producto de degradacién de la bilirrubina. El test se basa en que una sal de diazonio estable produce con el urobilindgeno, casi instanténeamente un colorante azdico rojo v Bilirrubina En la orina es un producto de degradacion de la hemoglobina La deteccién se basa en la copulacién de una sal de diazonio con bilirrubina para formar un colorante azoico, Incluso los mas leves matices rosa ya deben ser considerados como positivas Hemoglobina Es un indicio de hemélisis. La mioglobina cataliza la oxidacion del indicador por el hidroperéxido organico contenido en el papel reactivo Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva amarilla indican la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina asi como los eritrocitos hemolizados o 1a mioglobina son indicados por una coloracion verde homogénea de la zona reactiva 3. Método para realizar el examen microscopico del sedimento urinario a Una vez realizado el examen microscopico y quimico de la orina se la centrifuga por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente homogenizada b. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. El volumen final utilizado para resuspender el sedimento puede variar segiin el sistema estandarizado que se use, pero debe ser siempre constante en cualquier laboratorio dado c. Resuspender con suavidad el sedimento, eliminar las dos primeras gotas y colocar la tercera gota en una placa portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos Dejar que la orina se deposite durante 30 a 60 segundos. d. Observar al microscopio con abjetivos de pequeiio y gran aumento. Para detectar algunas entidades del sedimento con un indice bajo de refraccion sera necesaria una luz amortiguada o una iluminacién de contraste de fase El foco fino debe variarse continuamente mientras se examina Progresar de manera sistematica alo largo de toda la placa, teniendo cuidado de examinar los bordes en busca de cilindros. e. Recuento del ntimero de cilindros por lo menos en 10 campos de pequefio aumento (10x) y anotar en el informe el ntimero de cilindros por campo Puede utilizarse un margen razonable, es decir, 0 a2, 2.25, 5.10, etc. Usar el gran aumento (40x) para indicar el tipo de cilindros. Los cilindros se apreciaran si se utiliza microscopio de contraste de fase £ Identificacion y recuento de los eritrocitos, leucocitos y células epiteliales renales utilizando el objetivo de gran aumento (40x). Efectuar el recuento por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como células por campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable g. Reporter: h. Las células epiteliales (bajas) y altas si estén presentes en gran mimero o como fragmentos (células transicionales) ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 12ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador = Facultad Medicina # ‘Av. 12.de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 i. Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a pequefio aumento puede expresarse por lo menos como 2 + j. Los cristales se cuantifican bajo pequefio aumento. La presencia de cristales anormales debe confirmarse quimicamentey correlacionarse con La historia del paciente k. Grandes cantidades de moco OBSERVACION: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo nivel ubicado en el internet cuya pagina es ftp.puce.edu.ec 31. Elementos que se observan en el examen microscépico: * Las bacterias y otros microorganismos (normelmente no estan presentes) © Cilindros urinarios © Cristales © Grasa © Moco * Glébulos rojos (un indicio de dafio en los tibulos) © Células tubulares renales © Células epiteliales de transicion © Glébulos blancos (un indicio de infeccion del tracto urinario) TAREA EN CLASE: Cada estudiante debe traer su muestra de orina siguiendo las instrucciones anteriores, realizar el anélisis clinico durante la practica y realizar el reporte de la misma para archivar en la carpeta PRACTICA No.5 Tema: Parasitologia : Coproparasitario Objetivos: 1. Observacién macroscépica y microscépica de las heces para aprender a reconocer diferentes patologias gastrointestinales 2. Aprender a realizar la técnica para la preparacién de un coproparasitario Materiales y rectivos: A. Materiales Placa portaobjetos Placa cubreobjetos -Microscopio -Guantes -Paillos de dientes ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 13rs, Pontificia Universidad Catolica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 B. Reactivos -Solucién fisiologica al 0.85% -Solucién de lugol (dilucién 1:5 de lugol) -Muestra de heces Procedimiento: Recoleccién de la muestra: Debe recogerse en un recipiente limpio, debe tenerse cuidado de no mezclarse con orina descartar los provenientes de pacientes tratados con bismuto y bario. Las muestras obtenidas deben enviarse rapidamente al laboratorio especialmente si son liquidas 0 semiliquidas ya que las formas trofozoicas de los protozoos pierden movilidad y mueren poco después de enfriarse Procesar la muestra antes de dos (2) horas. $i esto no es posible, mantener las muestras, en reftigeracién o temperatura de 4° Centigrados 1. Examen macroscépico (fisico) heces: La inspeccion de las heces es importante, ya que puede conducir a un diagnésttico de infectacién parasitaria, ictericia obstructiva, diarea, melabsorcién, obstruccion rectosigmoidea, disenteria o colitis ulcerosa, o pérdida de sangre en el conducto gastrointestinal a Debe anotarse la consistencia (especificando si son pastosas, blandas, semiliquidas 6 liquidas 6 duras) y color del excremento (café, amanilla, rojiza, negruzca, verdes, etc) b. Los proglétides o gusanos adultos se pueden detectar en el examen general, manchas de sangre o moco, y, la presencia de restos alimenticios Color. Normalmente las heces son de color pardo de diferente intensidad, este color se debe a la presencia de urobilina, varia de acuerdo a la ingestion de alimentos y medicamentos Olor. Las sustancias arométicas provenientes dela desaminacidn y descarboxilacién del triptofano por las bacterias son las que le dan ala materia fecal el olor caracteristico. Consistencia. Normalmente las heces son blandas aunque moldeadas. Se observan heces extremadamente duras en el estreflimiento y liquidas por accion de purgantes, o por causas que originen diarea Esta consistencia puede ser- Liquida, blanda o dura Aspecto. Hay diferentes aspectos como son : Diarreico, cremoso, mucoide, granuloso, pastosa,caprino Reaccion: La reaccion y el pH de la materia fecal depende del régimen alimenticio 2, Examen Microscépico de las heces: En una lamina portaobjetos se colocan dos gotas, en la parte izquierda solucién salina y en la derecha Iugol, luego se toma con un palillo la muestra de materia fecal, se debe escoger la parte que tenga elementos anormales como sangre, moco, etc. y de otra parte ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 14ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 para que asi quede una muestra representativa, se homogeniza en la lamina primero en Ja solucién salina y luego en el lugol, se le colocan los cubreobjetos. La suspensién no debe quedar muy gruesa pero tampoco muy delgada Residuos_aliment s: Fibras musculares: Se presentan en forma de cilindros con estrias longitudinales y transversales. Grasas_neutras. Aparecen como esferas reffingentes de diferentes tamafios Acidos __grasos Se observan como —agujas.-—_—incoloras Almidones. Tienen formas isregulares y son refractiles al agregar el lugol Fibras vegetales. Se caracterizan por ser de doble pared, contienen clorofila y poseen un canal central muy mercado. Productos de init Se observa en cualquier patologia Globulos Rojos. Su hallazgo indica lesion en la parte baja del aparato digestivo Celulas epiteliales Indican una excesiva imitabilidad Bacterias Carecen de significacion clinica Leucocitos. Si hay gran cantidad = indica imritacion—_bacteriana. Cristales de Charcot-leyden: Se ven en forma de rombos alargados 2, Examen parasitolégico NEMATODOS: Gusanos redondos Ascaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm, presenta una célula rodeada por tres capas, producen una patologia de dolor de estomago y desnutricion CESTODOS: Gusanos planos -Taenta Los huevos miden 20-30 x 30-40 mm, son ovoides con membrana gruesa, amarillenta que se encuentra estriada en forma de empelizada y encierra un embrion de seis. ganchos poco —visibles. «= Produce —trastomos—nerviosos. PROTOZOARIOS: Entamoeba histolitica: Se observan quistes miden aprox. 20 mm se observa con cuatro niicleos. Pueden causar lesion de la mucosa intestinal Entamoeba coli: Son quistes mas grandes que los de histolitica, tiene mas de cuatro nicleos. Es considerada como no patogena Giardia lamblia: es un protozoo flagelado patogeno que parasita el tracto digestivo de humanos y otros mamiferos, Presenta un tamafio de 20 micras de longitud y 15 de ancho. Posee 8 flagelos, 2 anteriores, dos posteriores, dos ventrales y dos caudales, cuya funcion es la de motilidad. Proyectada en un plano se parece una pera ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 15rs, Pontificia Universidad Catolica del Ecuador “Facultad Medicina * # Av. 12 de Octubre 1076 y Roca 7 = Apartado postal 17-01-2184 OBSERVACION: Por favor revisar el atlas para segundo nivel ubicado en el internet cuya pagina es ftp.puce.edu.ec TAREA EN CLASE Cada estudiante debe realizar un examen coproparasitario y hacer el reporte para archivarlo en la carpeta PRACTICA No.6 CARBOHIDRATOS: Determinacién de glucosa en sangre 1. Objetivos: 1. Conocer la técnica mediante la cual se determina la glucosa en sangre 2. Diferenciar pacientes con hipo e hiperglicemia 2. Fundamento teérico: La glucosa es la principal fuente de energia de las células en el organismo. La glucosa es un monosacarido con una concentracién postpandrial de 90 mg/dl en la sangre y sirve como una fuente de energia indispensable para la funcion celular. El diagnéstico de los trastomnos del metabolismo de los hidratos de carbono se apoya en parte en la medicion de la glucosa plasmatica, ya sea en ayuna o tras estimulacién 0 pruebas de supresion Los resultados de 1a glucosa plasmética pueden clasificarse como hiperglucémicos (como la diabetes mellitus) 0 hipoglucemicos Principio dela reaccién: La prueba utilizada se determina mediante el método enzimatico colorimétrico, basado en la reaccion de Tnnder. Glucosa+ 02+ HO GOD (glucosa oxidasa} acido glucénico + H2O 2H,0; + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasg) quinoneimina (rojo) + 44,0 La glucosa se determina después de la oxidacién enzimatica en presencia de glucosa oxidasa El perdxido de hidrogeno formado reacciona bajo la catalisis de peroxidasa con fenol y 4-aminoantipirina formando un complejo rojo violeta llamado quinoneimina Punto final de una reaccién: Las reacciones catalizadas por enzimas son unicas en el sentido de que presentan aumentos muy grandes de la velocidad en relacion a las reacciones no catalizadas y muestran una cinética de saturacién, es decir la velocidad de Ja reaccién alcanza un valor maximo a una concentracién determinada de sustrato, no ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 16Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 dan por resultado aumento de la velocidad de la reaccion, La medida se realiza siempre en las condiciones optimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc. En estas condiciones, la velocidad de reaccién observada es 1a velocidad maxima (Vax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicién de los productos o la desaparicion de los reactivos. En el caso de la reaccidn de la glucosa catalizada por la enzima glucosa oxidasa y la peroxidasa llega a su punto final cuando todo el sustrato (glucosa) se ha oxidado, y después se mide el cambio de color. Espectofotémetro: La absorbancia y 1a transmitancia de una sustancia en disolucién se miden con un aparato denominado espectrofotemetro, el cual consta basicamente de los siguientes componentes Fuente deluz: Lampera que emite una mezcla de longitudes de onda Colimador: Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtiéndola en un haz de rayos paralelos Monocromador. Dispositivo que selecciona luz de una unica longitud de onda, Detector fotocléctrico Transductor de luz en clectricidad La luz provoca el desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente eléctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida Registrador: Mide la sefial del detector, la compara y genera una medida en una escala determinada, bstor: Drs, Celia Bowen Pagina 17Se, Pontificia Universidad Catolica del Ecuador 5 Facultad Medicina % £ Av. 12 de Octubre 1076 y Roca P ‘Apartado postal 17-01-2184 A) Esquema de un espectrofotémetro de un solo haz B) Esquema de un espectrofotémetro de doble haz, en el cual se corrigen las variaciones espectrales de los diferentes elementos épticos que lo componen El funcionamiento del espectrofotémetro es el que sigue: la luz de una fuente continua pasa a través de un monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente Esta luz “monocromética” atraviesa una muestra de espesor b, y se mide la potencia radiante de la luz que sale, Es necesario calibrar el espectrofotometro con un blanco antes de medir las absorbancias de la disolucién problema Esta celda o cubeta de referencia sirve para compensar los efectos de reflexidn, dispersion o absorcién de luz de la celda con el disolvente Cuando emerge poca luz de la muestra (absorbancia alta), la intensidad es dificil de medir. Cuando emerge mucha luz de la muestra (absorbancia baja), es dificil detectar la diferencia de absorbancia entre las celdas de muestra y de referencia 3. Parte experimental: 3.1. Procedimiento: Ensayo: Longitud de onda Hg 546 nm. Paso de luz 1 cm Temperatura: 20-25°C Medicién: frente aun blanco de reactivo, Se requiere un blanco de reactive por serie Esquema de pipeteo: Microdeterminacién Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD 6 muestra STD 6 muestra Sul Reactivo para glucosa 500 ul 500 ul ‘Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25°C 6 5 minutos a 37°C. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente aun blanco de reactivo antes de 60 minutos, ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 18jad Catélica del Ecuador Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 Materiales y reactivos: Materiales Reactivos Espectrofotometro Reactivo para glucosa Tubos de ensayo Estandar de glucosa (100 mg/dl) Gradilla Muestras de suero sanguineo (6 plasma) Pipetas automatica Puntas de plastico para pipetas automet Reloj Cubetas de plastico para espectrofot. Nota: El espectrofotometro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. 3. Caleulo dela concentracién dela glucosa C (me/dl)= 100 x AA muestra AA Estandar Valores de referencia: 70 — 100 mg/dl TRABAJO EN CLASE: Realizar el andlisis de glucosa en un suero sanguineo y luego reportar los célculos en la carpeta con la respectiva interpretacion del resultado PRACTICA No7 jeterminacién de colesterol en sangre 1. Objetivos: 3. Conocer la técnica mediante la cual se determina el colesterol en sangre ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 19rs, Pontificia Universidad Catolica del Ecuador j “Facultad Medicina 4 2 Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 4. Diferenciar pacientes con hipo e hipercolesteremia 2. Fundamente tesrico: Los principales lipidos del plasma humano son el colesterol, los ésteres del colesterol, los trigliceridos, los fosfolipidos y los acidos grasos no esterificados. El colesterol es un importante componente estructural de las membranas celulares y un precursor para la biosintesis de los acidos biliares y las hormonas esteroideas El riesgo cardiovascular es una funcién continua de la concentracién de colesterol y que los individuos situados en el limite superior del margen normal tienen un riesgo mayor que los que estan situados en el limite inferior. La prueba utilizada para determinar colesterol es mediante el método enzimético colorimétrico del siguiente moda Principio de la reaccion: Esteres de colesterol+ HO CHE(colesterol esterasa) colesterol + acidos grasos 'HE(colesterol esterasa), Colesterol + O> CHO (colesterol oxidasa) colesterol- 3-ona + H:Os 2H0) + 4-aminoantipirina + fenol POD (peroxidasa) Quinoneimina (rojo) + 4 HO |_POD (peroxidase) El colesterol se determina después de hidrélisis enzimatica y oxidacion, El indicador es la quinoneimina (complejo rojo) formada por el perdxido de hidrégeno y 4- aminoantipirina en presencia de fenol y peroxidasa. 2. Parte experimental: 2.1. Procedimiento: Ensayo: Longitud de onda Hg 546 nm. Paso de luz 1 cm Temperatura: 20-25°C Medicién: frente aun blanco de reactivo, Se requiere un blanco de reactive por serie Esquema de pipeteo: Microdeterminacién Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo STD 6 muestra ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 20jad Catélica del Ecuador Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 STD 6 muestra Sul Reactive paracolesterol_ | 500 ul 500 ul ‘Mezclar, incubar por 10 minutos de 20-25°C 6 5 minutos a 37°C. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente aun blanco de reactivo antes de 60 minutos, Materiales y reactivos: Materiales Reactivos Espectrofotémetro Reactivo para colesterol Tubos de ensayo Estandar de colesterol (200 mg/dl) Gradilla Muestras de suero sanguineo (o plasma) Pipetas automatica Puntas de plastico para pipetas automét Reloj Cubetas de plastico para espectrofot. Nota: El espectrofotometro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. 4. Calculo dela concentracién de colesterol C (me/dl)= 200 x AA muestra AREstandat Valores de referencia: hasta 200 mg/dl TRABAJO EN CLASE: Realizar el andlisis de colesterol en un suero sanguineo y luego reportar los calculos en la carpeta con la respectiva interpretacion del resultado ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 21ov’, Pontificia Universidad Catélica del Ecuador Facultad Medicina Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 CONSULTA: Criterios de la OMS para - Sindromes metabélicos - Factores de riesgo cardiovascular Nota: Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluacion parcial PRACTICA No.8 TEMA: Método para electroforesis de proteinas en suero Objetivo: Aplicar la técnica de electroforesis para separar las diversas fracciones proteicas del suero humano Fundamente tesrico: La electroforesis es una técnica basada en los movimientos de moléculas cargadas en un campo eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (catodo y anodo), este movimiento denominado “electroforesis” da nombre a la técnica En el transporte electroforético, a la fuerza del campo eléctrico se opone la resistencia viscosa del medio, produciéndose, cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las particulas En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se movera hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga eléctrica, 2) su tamafio, 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio. La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquimica a la separacién de compuestos que poseen grupos ionizables (aminoacidos, péptidos, proteinas, acidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Si la molécula tiene carga positiva migrara hacia el cétodo, si tiene carga negativa hacia el aodo, La fuerza idnica de la solucién tampén tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migracién de los solutos mas rapidas y con menor desprendimiento de calor. Las proteinas estén compuestas de aminoacidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO y -NH* 3), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien de permanecer eléctricamente neutras segiin la proporcién de los diversos grupos ionizados aun determinado pH. En su punto isoeléctrico (pl o pHi, la proteina tiene carga neta cero. Por debajo de pl las proteinas estaran cargadas positivamente y por encima del pl negativamente El porcentaje normal de estas proteinas en el suero humano es -Albumina. 54-62% ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 22jad Catélica del Ecuador Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 -a-globulinas......9-15% -B-globulinas......14-19% ~y-globulinas......14-19% En el siguiente cuadro se observa la concentracién normal en mg/dl , peso molecular (PM) y funciones de las proteinas (el cuadro no presenta una clasificacion completa de las proteinas, se observan unos cuantos ejemplos que se encuentran en mayor concentracién) PROTEINAS PM CONCENTRACION | FUNCION 1)Albimina 69000 3500 24500 mg/dl | Presion oncética y transporte 2)Globulinas alfal Alfal glucoproteina | 40000 35 a140 mg/dl Proteina de fase acida aguda Alfa I antitripsina | 54000 200-400 mg/dl Proteasa inhibidora 3)Globulinas alfa? Alfa? 725000 140-420 mg/dl Proteasa inhibidora macroglobulina Haptoglobina 90000 380 a 780 mg/dl Liga HB circulante 3.Globulinas beta ‘Transferrina 76000 200 a 300 mg/dl “Transporte del Fe Hemopexina 5700 50 2 100 mg/dl Liga el hem 4.Gama globulinas IgG 150000 700 21500 mg/dl | Anticuerpos IgA 150000 a 300000 - ‘Anticuerpos IgM 750000 2900000 - ‘Anticuerpos Crioglobulinas 220 - Desconacido TRABAJO EN CLASE: Realizar el andlisis de las proteinas en un suero sanguineo y luego reportar en la carpeta con una foto los resultados con una posible patologia de la respectiva consulta (realizar un ejemplo de cada una en la misma foto) CONSULTA: Patologias que se presentan cuando hay aumento 6 disminucién de cada una de las proteinas (albimina, alfal y alfa? globulina, betal y beta globulina, gamma globulina) Nota Archivar en la carpeta y estudiar para la evaluacién parcial PRACTICA No.9 ‘store: Dr, Ce Bowen Pagina 23rs, Pontificia Universidad Catolica del Ecuador j “Facultad Medicina 4 2 Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 TEMA: Determinacin de urea (Método enzimatico-colorimétrico) Fundamente tesrico: Laurea es el principal compuesto nitrogenado no proteico mas imporatnte en la mayoria de los liquidos biolégicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico, Se produce en el higado y es excretada en la orina a través de los rifiones Una elevacién de la concentracién sérica de urea, se interpreta generalmente como una posible disfuncion renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores séricos de urea se encuentran intimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteracion en estas variables se traduciré en un cambio de la concentracién de urea en suero. Fundamento del método: La urea se hidroliza por accién de la ureasa en presencia de agua para producir amoniaco y didxido de carbono. En una reaccion de berthelot modificada los iones amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato produciendo un complejo verde llamado indofenol que se determina colorimétricamente ‘ureasa NH2~ CO-NH2 +20 ______ (NH.")2 + CO2 Nittoprusiat (no es enzims) (NH.*)+ salicilato+ ClONa+ 2-oxoglutarate tn dofenol (verde) Parte experimental: 1Procedimiento (en suero o plasma) LL. En cuatro tubos de ensayo marcados como B (blanco), $ (Standard), M1 (muestra 1) y M2 (muestra 2) agregar: I B Ss I ML M2 Standard - 10 ul Suero o plasma - - 10ul 10 ul Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul Enzima ureasa_| Sul Sul [ Sul Sul ‘Mezclar por agitacién suave incubar 10 minutos a 20-25° C o por 3 minutos a 37°C Reactive 2 1000 ul 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar por agitacién suave e incubar 10 minutos a 20-25° C o por 5 minutos a 37°C. Leer 1a absorbancia de la muestra (AA muestra) y del estandar (AA Estandar) en espectrofotdmetro a Hg 578 nm frente aun blanco reactivo antes de 60 minutos Calculos de concentracién de urea: C (me/dl)= AA muestra x 80 AAestandar Valores dereferencia en suero: 10 — 50 mg/dl Parametros a considerar: ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 24rs, Pontificia Universidad Catolica del Ecuador j “Facultad Medicina 4 2 Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 - El espectrofotdmetro debe estar encendido 20 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras 2.Materiales y reactivos: 2.1. Materiales: -Gradilla -Cuatro tubos de ensayo -Espectrofotémetro -Pipetas autométicas -Puntas de plastico para pipeta automatica -Cubetas de plastico para espectrofotémetro -Reloj 2.2.Reactivos: -Reactivo 1: Buffer fosfatos (pH 7.0), Salicilato de sodio, Nitroprusiato de sodio, EDTA -Reactivo 2: Buffer fosfato (pH 13), hipoclorito “Standard: solucion de urea 80 mg/dl -Ureasa (enzima): Solucién estabilizada y tamponada de alta potencia -Suero sanguineo TRABAJO EN CLASE: Realizar el anélisis de urea en un suero sanguineo y luego reportar los célculos en la carpeta con la respectiva interpretacion del resultado PRACTICA No. 10 TEMA: Determinacién de transaminasas : TGO y TGP Las transaminasas son unas enzimas, principalmente localizadas en el higado. Las mas importantes son: - TGO: Transaminasa glutamicooxalacética Esta presente en casi todos los érganos, dentro de las células y que cuando se encuentran en sangre en niveles muy elevados significa que ha habido destruccién celular. - TGP. Transaminasa glutamicopintvica Se localiza principalmente en el higado y su mision es la fabricacion de glucosa Se utilizan en la clinica para la confirmacién diagnéstica del infarto agudo de miocardio y para el estudio de enfermedades hepaticas o musculares Para realizar el examen en sangre, previamente es necesario que el paciente, unos dias antes, haga una dieta en la que no sobrecargue el higado, no tomando alcohol, escasas proteinas y grasas y también es necasrio no realizar esfuerzos fisicos importantes Parte experimental: ‘scart Dra, Celis Bowen Pagina 25Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 1 Procedimiento (en suero o plasma) tanto para TGO como para TGP: Longitud de onda Hg 334 nm Temperatura: 25°C Cubeta: 1 om paso de luz Ajuste cero: contra el aire Reactivo de trabajo 1000 ul colocar en la cubeta Muestra 100ul_colocar en la cubeta Mezclar e incubar por 1 minuto a temperatura de 25° C, leer en el espectrofotometro (Al), repetir las lecturas exactamente al 2do.(A2) y 3er. Minuto(A3) Realizar los célculos AAJ min= Al - A2 (usando los dos primeros minutos de lecturas de absorbancia) AAI/ min = Al - A2 (usando los tres minutos de lecturas de absorbancia) AA2/ min= A? -A3 AAJ min = (AA + AA2)/2 Concentracion de TGP= AA x 1790 Concentracion de TGO= AAx 1790 Reportar los resultados en Ul Valores de referencia (varia de acuerdo a la marca comercial del reactivo y a la temperatura de medicién): TGO: Mujeres hasta 32 U/L Hombres hasta 38U/ TGP: Mujeres hasta 31 U/L Hombres: hasta 41 U/l Parametrosa considerar: - Espectrofotometro encender 20 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras 2.Materiales y reactivos: 2.1. Materiales: Espectrofotometro, pipetas automaticas, puntas de plasticos para pipeta, cubetas, reloj 2.2.Reactivos: TGOy TGP TRABAJO EN CLASE: Realizar el andlisis de TGO 6 TGP en un suero sanguineo y luego reportar los célculos en la carpeta con la respectiva interpretacién del resultado ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 26Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 PRACTICA No. 11 TEMA: Determinacion de bilirrubina total y directa El 80-85% de la bilirrubina se origina de la degradacién de la hemoglobina con un 15- 20% que es derivada del citocromo, mioglobina y catalasas, La bilisrubina no conjugada, la cial se liga ala albtimina del plasma, es producida en el curso de la degradacion en el sistema reticuloendotelial, células Kupffer del higado, bazo y medula ésea, Los ensayo de bilisrubina son posible para evaluar el grado de severidadad de los sintomas clinicos de la ictericia asi como para evaluar la funcion y el estado del higado Significado de los resultados anormales La ictericia es la coloracion amarillenta de la piel y de la esclerotica del ojo, que ocurre cuando la bilirrubina se acumula en la sangre a un nivel mayor a 25 mg/dL aproximadamente. La ictericia se presenta porque los glébulos rojos se estan descomponiendo demasiado rapido para que el higado los procese, lo cual podria suceder debido a una enfermedad hepatica o a una obstruccién de las vias biliares, Si hay una obstruccion de las vias biliares, la bilirrubina directa se acumulara, escapara del higado y terminaré en la sangre. Si los niveles son lo suficientemente altos, una parte de ella aparecera en la orina, Selo la bilirrubina directa aparece en la orina. El aumento de la bilirrubina directa generalmente significa que las vias biliares (secrecion hepatica) estan obstruidas El aumento de la bilisrubina indirecta o bilirrubina total pueden ser un signo de: Sindrome de Cngler-Nayjar Enitoblastosis fetal Enfermedad de Gilbert Cicatrizacion de un hematoma grande (moreton o sangrado bajo la piel) Anemia hemolitica Enfermedad hemolitica del recién nacido Hepatitis Ictericia fisiolégica (normal en los recién nacidos) Anemia drepanocitica Reaccin a una transfusion © Anemia pemiciosa El aumento de la bilisrubina directa puede indicar: Obstru: Cirrosis Sindrome de Dubin-Johnson (muy raro) Hepatitis ‘sara: Dra Celia Bowen in de las vias biliares Pagina 27Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 + Colestasis intrahepatica (acumulacién de bilis en el higado) debido a cualquier causa En presencia del acelerador cafeina, la bilirrubina total se acopla con el acido sulfénico para formar un complejo azobilirrubinado rojo, la intensidad del color es proporcional a a concentracién de la bilirrubina La determinacion de la bilisrubina directa es desarrollada sin aditive de cafeina La adicién de tartrato alcalino causa una transformacién del complejo rojo de La azobilirrubina a un complejo azul y las lecturas de las absorvancias son entre 546-578 nm. Bilirrubina total: Acido sulfanilico + NaNO2_ » acido sulfonico diazotizado Bilirrubina+ acido sulfonico diazotizado __cafeina azobilirrubina (rojo) Azobilirrubina + tartrato _______» complejo verde 1. Esquema de pipeteo: Bilirrubina total Microdeterminacion: Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo Muestra Reactivo 1 100 ul 100 ul Reactivo 2 25 ul Reactivo 3 500 ul 500 ul Muestra 100 ul 100 ul Mezclar, incubar por 10-60 minutos a temperatura ambiente. Afiadir Reactive 4 500 ul 500 ul Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 5-30 minutos, Leer la absorbancia de la muestra contra el blanca Bilirrubina directa Pipetear en las cubetas Blanco de reactivo Muestra ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 28jad Catélica del Ecuador Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 Reactivo 1 100 ul 100 ul Reactive 2 25 ul Solucion NaCl 0.9% 1000 ul 1000 ul Muestra 100 ul 100 ul Mezelar, incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Leer la absorbancia de la muestra contra el blanco 2. Caleulos: Bilirrubina total: C (mg/dl)= 10.8 x AA bilisrubina total Bilirrubina directa: C (mg/dl)= 13.7 x AA bilirrubina directa Bilirrubina indirecta BI= Bilisrubina total (BT) - bilirrubina directa (BD) 3. Materiales y reactivos: Materiales Reactivos Espectrofotémetro Reactivos para bilirrubina Tubos de ensayo Muestras de suero sanguineo (6 plasma) Gradilla Pipetas automatica Puntas de plastico para pipetas automét Reloj Cubetas de plastico para espectrofot. Nota: El espectrofotometro debe estar encendido 20 minutos antes de leer las absorbancias. Valores de referencia: Bilirrubina total: hasta 1.0 mg/dl Bilirrubina directa: hasta 0.25 mg/dl ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 29Av. 12 de Octubre 1076 y Roca ‘Apartado postal 17-01-2184 TRABAJO EN CLASE: Realizar el andlisis de las bilirrubinas en un suero sanguineo y luego reportar los céloulos en la carpeta con la respectiva interpretacién del resultado BIBLIOGRAFIA: _ + Angel M., G. y M. Angel R., Interpretacién Clinica del Laboratorio, 6°. edicié Médica Panamericana, Bogota, 2.001 + Henry, J. B., Diagnéstico y Tratamiento Clinicos por el Laboratorio, 9%. Edicién, Editorial Salvat Médica, México, 1.993 Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, 0. M. S., Ginebra, 1.994 Métodos Basicos de Laboratorio en Parasitologia Médica, O. M. S., Ginebra, 1.992 ‘+ Moran Vilaroto, Obtencién de Muestras Sanguineas de Calidad Analitica, Editorial Médica Panamericana, México, 2.001 , Editorial ‘sara: Dra Celia Bowen Pagina 30