Conceptos y Tcnicas de Biotecnologa I

PRODUCCION DE AMILASAS FUNGICAS

OBJETIVO
El trabajo prctico consiste en el aislamiento de hongos productores de enzimas
hidrolticas del almidn, produccin de estas enzimas, medicin de su actividad enzimtica en
forma soluble e inmovilizada y su utilizacin para la produccin de etanol.
INTRODUCCION
Las enzimas que hidrolizan el almidn son un conjunto de enzimas (-amilasa, amilasa, glucoamilasa y enzimas desramificadoras) hidrolticas que catalizan la degradacin del
almidn. Cada enzima tiene una actividad caracterstica generando distintos productos como se
observa en la siguiente figura. Existen amilasas de uso industrial tanto de origen bacteriano como
fngico.

Las amilasas son producidas a gran escala para su uso en la industria de la alimentacin y
de la produccin de combustibles. Los usos ms importantes son:
1. Hidrlisis parcial del almidn para generar dextrinas que son utilizadas como espesantes.
2. Obtencin de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizados en la fabricacin de la cerveza y
confituras (dulces, helados, tortas).
3. Obtencin de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricacin de cerveza, panes y repostera,
confituras y bebidas no alcohlicas.
4. Remocin del almidn utilizado como apresto en la industria textil.
5. Hidrlisis parcial del almidn en la industria panadera para la liberacin de glucosa que es
sustrato de fermentacin de las levaduras para producir el leudamiento de la masa.
6. Hidrlisis del almidn para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones,
entre ellas la produccin de etanol para uso alimenticio y combustible.

DISEO EXPERIMENTAL
Parte I: AISLAMIENTO Y SCREENING
Da 1: Aislamiento (1 parte)
Se colocan semillas de lenteja sobre un medio Slido de agar YPD conteniendo 5 % NaCl
(para evitar el desarrollo de especies Mucorales) y 0.01 % tetraciclina (antibitico que inhibe el
crecimiento bacteriano). Se colocan 4 semillas por caja de Petri. Se incuba a 28C durante 7 das.
Da 2: Aislamiento (2 parte)
Las colonias de hongos (preferentemente las verdes sobre las negras o blancas) se repican
con un escarbadiente en cajas de Petri con agar YPD. Se incuba a 28C durante 7 das.
Da 3: Screening de cepas productoras de amilasas (1 parte)
Las colonias aisladas se pican en cajas de Petri con medio slido de almidn 1 % y agar
1.5 %. Se incuba a 28C durante 4 das.
Da 4: Screening de cepas productoras de amilasas (2 parte)

Las cepas productoras de enzimas hidrolticas del almidn se detectan observando el halo
de degradacin del almidn (crculo claro alrededor de la colonia). Para facilitar la deteccin, se
revela la presencia de almidn en el medio por el agregado de solucin de I 2/KI (0.026 % I2 +
0.26 % KI) que se acompleja con el polisacrido dando una coloracin azul.
Parte II: PRODUCCION DE AMILASAS
Da 4: Produccin de esporas
Las colonias con actividad amilsica se repican en tubos en pico de flauta conteniendo
medio de 5 % salvado triturado y agar 2 %. Se estra con ansa cada colonia en un pico de flauta.
Se incuba a 28C durante 5 das.
Da 5: Produccin de enzimas por fermentacin en sustrato slido
Las esporas de cada pico de flauta se resuspenden en 5 ml de solucin acuosa de Sarkosyl
0.05 %. Se inocula 1 ml de la suspensin de esporas en erlenmeyers de 250 ml conteniendo 5 g
de salvado y 5 ml de agua destilada. Se incuba a 28C durante 5 das.
Da 6: Extraccin de las enzimas
La enzimas extracelulares producidas en la fermentacin del salvado por el hongo se
extraen con 50 ml de NaCl 1.0 %. Agitar durante 30 min a temperatura ambiente. Filtrar por
papel de filtro y conservar el eluido.
Parte III: MEDICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Da 6: Medicin de la actividad enzimtica
La actividad amilsica se determinar utilizando almidn como sustrato. Se cuantificar la
desaparicin del sustrato por espectrofotometra.
La solucin de sustrato consiste en una solucin de almidn tamponada (0.05 % almidn,
0.15 M NaCl, 0,1 M acetato de sodio pH: 5.0).
La reaccin enzimtica se detiene por el agregado de un revelador (0.006 % I 2 + 0.06 %
KI en HCl 0.02 M) del almidn remanente en la solucin de incubacin. El iodo de la solucin de
I2/IK se acompleja con la amilosa nativa con su estructura tridimensional intacta. El complejo

iodo-amilosa se cuantifica midiendo la absorbancia a 640 nm con un espectrofotmetro.

La reaccin consiste en incubar 10 l de extracto enzimtico con 0.5 ml de solucin de
sustrato. La incubacin se realiza a 37C durante 7.5 min. La reaccin se detiene por el agregado
de 4.5 ml de solucin revelador y se mide la absorbancia a 640 nm. El protocolo se detalla a
continuacin:

Medicin de actividad amilsica

Tubo

Extracto

Solucin de

Incubacin

Solucin

Absorbanci

enzimtico

sustrato

a 37C

reveladora

a a 640 nm

1-2

0.5 ml

3-4

10 l

7.5 min

4.5 ml

La Unidad Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede
hidrolizar 10 mg de almidn en 30 minutos, en las condiciones de la reaccin. En esta tcnica se
incuban 10 l de muestra con 0.25 mg de almidn contenidos en 0.5 ml de solucin de sustrato
durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de muestra con 10.000 mg de
almidn durante 30 minutos. Si todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la
muestra sera de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilsica, la fraccin de
almidn digerido se multiplica por 1000.
Clculo de los resultados:

AmilasaUA / dl

Absorbancia (Tubos1 2) Absorbancia(Tubos 3 4)

1000
Absorbancia (Tubos1 2)

Ejemplo:
Absorbancia Tubo (1-2): 0.450
Absorbancia Tubo (3-4): 0.200
0.450 0.200
1000 555 UA / dl
0.450

Calcular las Unidades Amilolticasa por decilitro (UA/dl).

Parte IV: INMOVILIZACION ENZIMATICA
Da 6: Inmovilizacin enzimtica
El extracto enzimtico se inmoviliza con alginato de sodio. El alginato es un polisacrido
producido por algas soluble en agua, en una solucin con iones divalentes como el Ca2+
polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacridos. Al polimerizar una
solucin de alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se
generan.
Para la inmovilizacin se colocan 10 ml del extracto enzimtico en un vaso de precipitado
y se agregan 100 mg de alginato de sodio (1.0 % final). Se homogeiniza y se toma con una
jeringa de 10 ml. Se hace gotear la solucin en un vaso de precipitado conteniendo solucin de
CaCl2 200 mM. Se producen esferas de 3-5 mm de dimetro que polimerizan al entrar en
contacto con la solucin de CaCl2. Las esferas se estabilizan durante 1 h en la solucin de CaCl2 a
temperatura ambiente. Las esferas se lavan con buffer acetato 0.1 M, pH: 5.
La actividad de la enzima inmovilizada se determina agregando 5 ml de solucin de
sustrato e incubando 5 min a 37. Luego se extrae una alcuota de 0.5 ml y se agrega a cada tubo
4.5 ml de solucin reveladora. Se mide la absorbancia en espectrofotmetro a 640 nm.

Parte V: PRODUCCION DE ETANOL POR FERMENTACION

Se estudiar la capacidad de fermentacin para producir etanol de Saccharomyces
cerevisiae a la vez que se ver su incapacidad para utilizar almidn como fuente de carbono, por

lo que se hace imprescindible la hidrlisis previa del polisacrido para su utilizacin por la
levadura usando para ello el extracto enzimtico obtenido.
Da 6: Inoculacin
Las fermentaciones se realizarn en erlenmeyers de 50 ml conteniendo 40 ml de agua
destilada y 1.0 g de harina de trigo o maz autoclavadas. A este sustrato se le agrega 5 ml del
extracto enzimtico obtenido o 5 ml de solucin de NaCl 1.0 % y 100 l de tetraciclina 10
mg/ml. Se extrae una alcuota de 3 ml de cada fermentacin para determinar las condiciones
iniciales. Luego se inocula con 0.5 ml de una suspensin de Saccharomyces cerevisiae de 50
mg/ml y se incuba durante 5 das a temperatura ambiente.
Da 7: Determinacin de etanol
Se cuantificar el etanol producido en las fermentaciones (4 muestras: antes y despus de
incubar s/c extracto enzimtico) por el mtodo de microdifusin. Este mtodo se basa en que si
una sustancia voltil y un solvente puro se mantienen en compartimientos separados pero en
contacto con la misma atmsfera, el soluto voltil tender a disolverse en el solvente puro. El
soluto voltil pasar de la solucin original hacia la atmsfera para luego disolverse en el solvente
originalmente puro. Finalmente, esto implicar una difusin del soluto desde la solucin original
al solvente. Este proceso ocurrir hasta alcanzar el equilibrio pero, si en lugar del solvente puro
utilizamos una sustancia que convierta al soluto voltil en no voltil, la difusin ocurrir hasta que
la presin de vapor en la atmsfera compartida tienda a cero. El ensayo se realizara en dos tubos
colocados uno dentro del otro. En el compartimiento exterior (tubo ancho) se colocar 0.5 ml de
solucin saturada de carbonato de potasio que causar que el alcohol sea menos soluble en la
solucin acuosa. Por otro lado se prepara el compartimiento interior (tubo angosto) que
contendr 1.0 ml de solucin de dicromato de potasio 0.145 % en cido sulfrico 10 N y se
coloca dentro del tubo ancho con la ayuda de una pinza; en presencia de esta solucin el etanol es
oxidado a cido actico y el Cromo pasa a Cr 3+ cambiando su color de amarillo anaranjado a
transparente. Una vez preparado el dispositivo se agrega al compartimiento exterior 0.1 ml de
solucin standard o muestra y se tapa con un tapn de goma. Se incuba 60 min a 45C, se saca el
tubo angosto y se le agrega 0.5 ml de agua destilada y se mide la absorbancia a 450 nm.

Dispositivo para la determinacin de Etanol

Tapn de Goma

Compartimiento exterior:
Solucin saturada de
Carbonato de Potasio con
Standard o Muestra

Compartimiento interior:
Solucin de Dicromato de Potasio
El protocolo se detalla a continuacin:
Determinacin de Etanol
Tubo N

Muestra (100 l)

Absorbancia a 450 nm

1-2

Agua destilada

3-4

EtOH 0.25 %

5-6

EtOH 0.5 %

7-8

EtOH 1.0 %
Sin extracto / Sin incubar

9-10

11-12
13-14
15-16

Sin Extracto / Incubado

Con extracto / Sin Incubar

Con extracto / Incubado

Graficar la curva de calibracin (Absorbancia vs % de Etanol) y luego calcular el porcentaje de

etanol producido en cada una de las fermentaciones.