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Taller 2
Taller 2
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA
CTEDRA BIOTECNOLOGA PARA NO BIOTECNLOGOS
TALLER TCNICAS MOLECULARES
Amanda Catalina Duarte Gmez 244480
ELECTROFORESIS
Es una tcnica que permite visualizar los cidos nuclicos en geles que actan
como un soporte.
1. Cul es el principio de la electroforesis?
El principio se basa en el movimiento de partculas cargadas en un campo
elctrico, que se mueven hacia el electrodo de carga opuesta.
2. Cules son las aplicaciones que se le han dado a esta tcnica?
Se aplica en la separacin de compuestos que tiene grupos Ionizables como
los aminocidos, protenas, pptidos y cidos nucleicos.
3. Qu clases de electroforesis se pueden encontrar?
Electroforesis capilar.
Electroforesis de ADN.
entender la composicin gentica y el mapa que todos los seres vivos poseen
para su existencia.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN
Son enzimas que cortan las molculas de ADN en sitios especficos denominados
sitios de restriccin, razn por la cual se les ha llamado en algunas ocasiones las
tijeras moleculares.
5. Cul es el origen de las enzimas de restriccin?
Las enzimas de restriccin son unas protenas con accin cataltica que tienen
la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro o seis pares de
bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se
encuentre dicha secuencia.
6. Cmo se nombran las enzimas de restriccin?
Las enzimas de restriccin se nombran a partir de las bacterias de las que son
extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de
donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el
gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra
indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han
aislado de esa cepa.
7. Qu significa que algunas enzimas de restriccin tengan una secuencia
palindrmica?
Que leen igual en cualquier sentido.
8. A continuacin se muestran algunas enzimas de restriccin con sus
caractersticas:
5
GAAAAAACTGAAATTACGGTTGACGCACCTCTGGTATAAGGCTGATG
AAACTTGGGCTGAAAAGTGATGAAGTCTATTACATAGGCGGAGTGAAG
CCCTGCCGCCTCCATTATCTAA 3
A esta muestra se le realiza una restriccin con EcoRI y posteriormente con HindII,
luego se visualizan los productos de digestin en un gel de agarosa.
A
+--------
<-------- -
Carriles:
A. Fragmento sin digerir.
B. Fragmento digerido con slo EcoRI
C. Fragmento digerido con EcoRI y HindII
Desnaturalizacin:
Para que pueda iniciarse la reaccin es preciso que las molculas de ADN molde
se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue calentando a
temperatura de 90 a 95C para que produzca la rotura de los enlaces puente de
hidrogeno intercatenarios y la separacin de ambas cadenas, para asegurar la
completa separacin de la doble cadena del ADN esta temperatura debe
mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste
tender a renaturalizarse muy rpidamente dificultando con esto el proceso de
hibridacin.
Hibridacin:
Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la temperatura de la
reaccin hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C para que se pueda
producir la hibridacin especfica de los cebadores a las secuencias flanqueantes
del fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que se realiza esta
etapa debe establecerse para cada reaccin en funcin de la longitud de los
cebadores y su secuencia (Temperaturas inferiores a la ptima nos producirn
hibridaciones inespecficas de los cebadores y temperaturas superiores nos
dificultarn la eficiencia de la misma.
Extensin:
Durante esta etapa la ADN polimerasa termoresistente incorpora nucletidos en el
extremo 3 del cebador utilizado como molde la cadena de ADN previamente
desnaturalizada.
La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin suele ser de 72C ya
SECUENCIACIN
La secuenciacin involucra una cantidad de procesos en los cuales se determina
la serie exacta de los nucletidos que conforman una cadena de ADN.
16. Por qu es necesario secuenciar fragmentos de ADN?
Para saber el orden de los nucletidos y para investigar los procesos biolgicos
fundamentales.
17. Explique brevemente uno de los procedimientos que son utilizados para
secuenciar.
La secuenciacin con marcador fluorescente, se basa en marcar los
didesoxinucletidos con un color diferente fluorescente para observar toda la
muestra en una sola reccin hacindola una tcnicamuy atractiva por su
practicidad.