MATERIALES Y METODOS Materia Prima La materia prima utilizada fue uva de mesa de exportacion de las variedades Perlette, Flame, Sugar One y Red Globe, cultivadas en la regian de Pesqueira, en el municipio de Hermosillo, Sonora Las cuales fueron proporcionadas por Vifeda Alta S.A. de C.V. (las cuatro variedades mencionadas) Campo "La Cuesta” ubicado en el Km. 23 de la Carretera Hermosillo-Nogales, Sonora. La uva de uso industrial proviene del Campo “La Brea’, calle 4 Sur, Km. 3, Costa de Hermosillo Preparacién de las Muestras de Uva La uva fue lavada con agua destilada y la cascara fue removida manualmente y secada en una estufa de vacio (Nacional Appliance Company, Modelo 3640) 2 50 °C hasta obtener una humedad menor o igual al 12 %. La cascara se pulverizé mecanicamente a un tamafio de particula de 30 mesh en una licuadora Oster a la maxima velocidad por 10 s. Los palvos de cascara y semilla se almacenaron a una temperatura de - 20 °C (Yilmaz y Toledo, 2004) Extraccion de los Compuestos Fendélicos Preparacién de la muestra y extraccion de fenoles. Los compuestos fendlicos fueron extraidos de la cascara (2 g) con 20 mL de metanol acuoso (60:40) con homogenizaciones intermitentes de 10 seg por un periodo de 1 min. Posteriormente se sonicé a temneratura amhiente nar 3 min v se centri 44 6 a 19-000 eam nar15 min a 4°C. El sobrenadante se filtré con papel Whatman (No. 2) y el material sdlido fue sonicado de nuevo con 20 mL de metanol acuoso (60:40) para después ser centrifugado. Una vez filtrado el sobrenadante se mezclé con el primero para congelarse a -20°C, en espera de los analisis de oxidacién y HPLC (Prior y col., 2001) Fenoles Totales Las determinaciones se realizaron espectrofotométricamente utilizando el método de Folin-Ciocalteau (Schlesier y col., 2002) Este método esta basado en la oxidacian de los grupos fendlicos por los acidos fosfomalibdico y fosfotungstico; formandose un complejo verde azulado que se mide a 765 nm Para la determinacién del contenido de fenoles totales de las muestras, se mezclaron 50 uL de cada extracto con 3 mL de agua desionizada, adicionando el reactivo de Folin-Ciocalteu 1 N (250 uL, Merck) para reposar por 5 min, después con 750 uL de Na2CO3 al 20%, y 950 ul de agua desionizada, se homogeniza para reposar por 30 a 40 minutos de reaccién se midié la absorbancia a 765 nm (Fig. 9) Flavonoides Totales Se utilizé al acido galico monohidratado (Sigma Aldrich, USA) para la elaboracion de una curva de calibracién. El contenido de fenoles totales se expresd como equivalentes de acido galico en miligramos por gramo de muestra b.s. (Marinova y col., 2005)50 ul de extracto + 3 mL de agua desionizada + 250 pl del reactivo de Folin-Ciocalteu 1N Y Reposar 5 min t ‘Adicionar 750 ul de NagCO, al 20% + 960 ul de agua desionizada Vortex Y Reposar de 30 a 40 minutos ¥ Leer a 765 nm Figura 9. Diagrama de cuantificacion de fenoles totales. Para la determinacién de flavonoides totales se siguid la técnica descrita por Siddhuraju y Becker (2003) modificada. Unvolumen de 1 mL de extracto se colocé en un tubo de 10 mL, con 4 mL agua destilada, A ésto se afadieron 0.3 mL de NaNOz (5 g/100mL) y 0.3 mililitros de una solucién de AlCl (10:100) después de agitar vigorosamente, se dejo reposar por 1 min. Después de 6 min, se afiadieron 2 mL de solucién de NaOH 1 M, y se aforé a 10 mL con agua destilada La solucién se mezclé, y se midid la absorbancia contra un blanco a 510 nm en un espectrofatometro UV-visible (Cary 100 BIO. Varian) como se observa en la Figura 10. Para la elaboracién de la curva de calibracién se utiliz6 a la Rutina (E. Merck) como estandar El contenido de flavonaides se calculé en base a la siguiente ecuacin lineal Y = 1.442 — 0.024 r= 0.995 Donde: Y es la absorbancia medida y X es el contenido de flavonoides en mg quercetina/mL. Se calcularon los rendimientos de extraccién de fenoles y flavonoides a partir de las pesos totales de los racimos de uvas, asi como de la cascara fresca y seca lentificacién de los Compuestos Fendlicos por HPLC El procedimiento para la identificacion de los compuestos fendlicos se realizé de acuerdo al método descrito por Cantos y col (2000)TmL de extracto +4 mL de agua desionizada + 300 uL de NaNOz al 5% + 300 ul de AlCl 2 Reposar 1 min + [Adicionar 2 mL de NaOH 1M +| 2.4 mL agua desionizada Vortex ¥ Leera415nm Figura 10. Diagrama de cuantificacian de flavonoides totales El equipo utilizado fue un Varian 9050 equipado con un detector de luz ultravioleta (Varian 3400). Se utilizé una columna Supelcosil™ LC18 (30 x 0.4 cm x 5 um tamafo de particula Supelco, Bellefonte, PA). Los solventes fueron agua mas 5% de acido férmico (solvente A) y metanol grado HPLC (solvente B) a unflujo de 1.5 mL/min. La elusién se realizé con un gradiente empezanda con 2% de B hasta alcanzar 32% de B a los 30 min 40% de B a los 40 min. Los cromatogramas fueron registrados a 280, 320, y 360 nm Los diferentes compuestos fenélicos se identificaron por comparacién con los tiempos de retencién de los estandares correspondientes. El acido galico, catequina y epicatequina fueron cuantificados a 280 nm, el resveratrol y el acido clarogénico a 320 nm y el quercetin-3-rutinosido conocido como rutina (flavonal) a 360 nm (Garcia-Alonso y col., 2003). Se elaboraron curvas de calibracion para cada estandar identificado. Los compuestos fendlicos de los extractos fueron analizados por triplicado Act id Antioxidante por Ensayo ABTS** Este método se basa en la reduccién de la coloracion verde/azul producida por la reaccién del ABTS** (3.8 mg/mL) con 88 uL de persulfato potasico (37.5 mg/mL) incubados a temperatura ambiente (£25°C) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS** se diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0.70 + 0.1 a 754.nm. Las muestras filtradas (0.1 mL de extracto) se diluyen con 3.9 mL del radical y se homogeniza por 1 minuto. La absorbancia se mide de forma continua transcurridas 7 minutos (Figura 11)19.5 mg del radical ABTS + 5 mL de agua bidestilada Soin. © 37.8 mg de persulfato de potasio + 1 mL de agua bidestilada Soin. © ¥ 88 pL de Sain. © + Soin. © dejar reposar en oscuridad Sain. @ (12-16 h) a Tam. ¥ 88 mL de etanol +1 mL Saln.®@ —Soin.® ¥ Colocar en celda 3.9 mL Soin. © + 0.1 mL muestra ¥ Leer inmediatamente a Yas nm Figura 11. Diagrama de determinacion de la actividad antioxidante por el radical ABTS** La reduccion en absorbancia es relacionada a la del Trolox, un analogo sintético e hidrofilico de la vitamina E, el cual determina el valor TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacitity), calculado como moles de equivalentes Trolox por gramo de sdlido (Pellegrini 2003)Actividad Antioxidante por Ensayo DPPH Los antioxidantes reducen el radical libre 2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH*), el cual tiene una absorbancia maxima a §15 nm. La solucién del radical se preparé disolviendo 2.5 mg DPPH’ en 100 mL etanol Para el ensayo fotométrico se mezclaron 3.9 mL de solucién de DPPH" y 0.1 mL de diferentes concentraciones de los extractos para la elaboracién de una curva de calibracién (Figura 12). La absorbancia de las muestras se midié en funcién del tiempo hasta que las diferencias fueron menores que 0,003 (Materska y Perucka 2005) A partir de las cinéticas de disminucién de DPPH". Se utilizaron los valores asintoticas de absorbancia y se graficaron en funcién de las concentraciones para cada extracto. De éstas ultimas curvas se calculd la concentracion media efectiva (ECso), que es el contenido de antioxidante requerido para reducir la concentracién inicial de DPPH" a la mitad, para poder comparar la capacidad antioxidante de los diferentes extractos. Los resultados finales se expresaron como mg de fruto/mg de DPPH" (Molyneux 2004) 2.5 mg de radical DPPH y aforar a 100 mL con metanol 'Elaborar curva de diluciones (para determinar EC50) {Homogenizar Tomar 0.1 mL de la dilucion + 3.9 mL de salucién. de radical t Reposar por 30 minutos ¥ Leer inmediatamente a Asis nm Figura 12. Diagrama de determinacién de la actividad antioxidante por el radical DPPH" Los datos fueron analizados por un analisis de varianza y comparacién de medias por la prueba de Tukey (p<0.05) utilizando Sigmastat 3.5 (Point Richmond, CA, USA). Todos los analisis se realizaron por triplicado