UNCPBA

Facultad de Ciencias Veterinarias

Departamento de Ciencias Biolgicas

CURSO DE HISTOLOGA, EMBRIOLOGIA Y TERATOLOGIA

GUIA DE ESTUDIO:

TECNICAS HISTOLOGICAS
AUTOR
M.V.M Sc. RICARDO ALZOLA
PROF. ADJUNTO

AO 2001

Se llama tcnica histolgica a la serie de pasos que han de darse para obtener un preparado
observable con el microscopio ptico. Es un proceso largo que abarca desde el momento en que se
toma el material hasta que el preparado puede observarse.
PASOS:
1.- Toma de material.
2.- Fijacin
3.- Deshidratacin
4.- Preparacin para la inclusin
5.- Inclusin
6.- Modelado del bloque catalogacin
7.- seccin con el micrtomo extendido de los cortes pegado
8.- Coloraciones: de rutina o especiales

1.- Toma de material:

Introduccin:
Tratndose de un rea de Histologa el material ha de ser de un animal sano y normal.
Si es posible debe extraerse de un animal vivo y anestesiado, en caso contrario, al menos han de
extraerse l o los rganos sanos lo ms rpidamente posible despus de la muerte.
La mayora de las clulas consisten en una compleja membrana externa que rodea el protoplasma
fluido, mezcla de soluciones de sales, protenas, hidratos de carbono, lpidos, cidos orgnicos y
enzimas. Si las clulas no fueron fijadas, mu chas de estas sustancias se perdern por solucin
simple, por dilisis o por ingurgitacin osmtica de las clulas en el proceso que debe preceder al
corte y a la tincin. En la tcnica histolgica muchos componentes texturales se pierden durante los
sucesivos pasos de la misma. Los componentes que perduran son en gran medida molculas grandes
que no se disuelven con facilidad en especial despus de aplicar el fijador.
Las molculas grandes, particularmente aquellas que forman complejos con otras molculas de gran
tamao, para producir compuestos macromoleculares, son las que mejor se conservan en un corte:
Ej.: - Acidos nucleicos asociados con una protena (nucleoprotena)
- Protenas intracelulares del citoesqueleto que forman complejos con otras protenas.
- Protenas extracelulares en grandes agregados insolubles asociados con otras molculas vecinas
similares, a travs de enlaces cruzados (como sucede en las fibras colgenas) y los fosfolpidos
de las membranas.
Las protenas y cidos nucleicos pequeos como el ARN de transferencia en general se pierden
durante la preparacin de la muestra de tejido. Adems pueden perderse molculas grandes, por ej.
estas pueden ser hidrolizadas por un pH desfavorable en las soluciones fijadoras. Son ej. de
molculas grandes, que desaparecen durante la fijacin de rutina en fijadores acuosos: el glucgeno,
proteoglucanos y glucosaminoglucanos. Tambin suelen perderse los lpidos neutros.
Al preparar muestras para su inclusin en parafina tambin se pierden molculas pequeas solubles
o iones.
Adems y con el mismo propsito, la fijacin debe hacerse muy cuidadosamente antes de proceder
a la deshidratacin.
Muestreo:
En cuanto la sangre deja de llevar oxgeno a los tejidos y de extraerles el anhdrido carbnico,
las enzimas de las clulas que componen los tejidos comienzan a actuar y se produce la autlisis,
las propias estructuras moleculares son deformadas, que es lo que precisamente se ha de evitar. Los
tejidos y rganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:
-

Las glndulas excrinas y endocrinas lo ms rpidamente posible.

El pncreas y el rin deben extraerse no ms de 10 a 15 min. post-mortem.
Otros rganos tales como intestino delgado y/o grueso, estmago, hgado, se deben extraer no
ms all de los 30 min.
Los msculos esquelticos, huesos, piel, encfalo, mdula, ganglios nerviosos no deben
extraerse ms all de 60 min. postmortem.

Material de necropsia:
El examen necrpsico debe ser realizado lo ms rpidamente posible despus de la muerte,
si esto no es posible el animal debe ser colocado a 4 C. o sometido a embalsamamiento por va
arterial.

Comentario:

Procedimientos generales:
Si se extraen varios rganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de rgano
envolvindolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del rgano, mientras
quede el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se escribe con lpiz las
indicaciones (rgano, porcin, etc.) del caso, todo esto es necesario si las muestras a extraerse son
muchas pues luego se ver dificultado el reconocimiento.
La cantidad de lquido fijador en microscopia ptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el
volumen de la muestra.
Los fragmentos de rganos no deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en
ngulos rectos a la superficie de los rganos y deben ser suficientemente profundos para
comprender los constituyentes anatmicos normales como por ej. cpsula, corteza, mdula, etc. A
veces pueden cortarse trozos de rganos de mayor tamao, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en
fijador en que las piezas estn ms fciles de manejar, se realizan cortes ms pequeos de los
mismos.
Cmo realizar las secciones?
Los trozos de rganos tubulares se seccionan directamente con tijeras, los macizos han de ser
desprendidos con las tijeras.
Extrados los rganos deben seccionarse en fragmentos, para esto se debe utilizar una hoja de
afeitar o de bistur (se utilizan a manera de serrucho sin presionar). Los bordes cortados con tijeras
se seccionan y se desechan, porque comprimen los rganos y los deforman.

2.- Fijacin:

Concepto:
La fijacin es una operacin destinada a matar las clulas, conservndolas, cuanto sea
posible en el estado en que estn durante la vida.
Introduccin:
Una buen a fijacin debe:
-

inmovilizar la clula
conservar exactamente todas las partes constitutivas.
no hacer aparecer artificialmente otros detalles en la estructura.
Tal fijacin es por ahora imposible de realizar.

Una accin rpida y enrgica del reactivo impide bien las alteraciones espontneas postmortem,
pero este modifica tambin la estructura celular.
Los mejores fijadores son los que adems de actuar rpidamente producen el menor numero
posible de reacciones (modificaciones) secundarias o artificios, capaces de darnos una idea muy
falseada de la morfologa interna de la clula.
Un tejido bien fijado mostrar clulas plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino
presentando muchos detalles de estructura fina.
En qu consiste esencialmente la fijacin? :
Es verdad que la masa celular, formada de albuminoides, no puede ser conservada
exactamente, sino es por un proceso que la solidifique. Esta solidificacin se obtiene por
coagulacin o precipitacin.
La coagulacin es producida por agentes fsicos, la precipitacin, siempre acompaada de
modificaciones qumicas, es producida por agentes qumicos.

El verdadero papel de la fijacin es el de producir una coagulacin o una precipitacin lo ms

completa posible de todos los albuminoides celulares, conservando la configuracin correspondiente a su naturaleza amorfa (citoplasma), granulosa (grnulos de secrecin), filamentosa (con drioma), etc.
Conservacin morfolgica de los Tejidos:
Debe endurecerlos suficientemente para permitirles resistir sin deformarse, todas las
manipulaciones subsiguientes (deshidratacin, inclusin, cortes, etc.).
La fijacin debe producir al mismo tiempo la insolubilizacin de los elementos constitutivos de la
clula y de los tejidos. Es pues necesario que los detalles de estructura, conservados por el fijador
no sean destruidos enseguida por la accin de los lquidos de lavado o de las soluciones colorantes.
Esta insolubilizacin puede ser producida por la deshidratacin, coagulacin y principalmente por
la combinacin qumica del reactivo fijador con los albuminoides celulares.
Preparacin para la coloracin:
Ciertas combinaciones formadas entre fijadores y tejidos tienen la propiedad de combinarse
con ciertas materias colorantes, estas as pueden mordentar los tejidos y permitir coloraciones
especficas.
Funcin del equilibrio fsico:
Cuando hablamos de fijacin debemos tener en cuenta las reglas del equilibrio fsico que se
relacionan con las membranas permeables. Desde el punto de vista fsico, la fijacin es la
penetracin de un producto extrao a travs de una membrana permeable, es ante todo un fenmeno
de smosis.
La rapidez de la difusin est en razn directa con la concentracin de la sustancia que se difunde,
conviene regular esta concentracin de manera que la clula pueda conservar lo ms intacta posible
su forma, volumen y contenido, asegurando una penetracin rpida y completa.
La rapidez de la penetracin est en funcin directa a la concentracin y en funcin inversa del
peso molecular de las sales; esta es mayor para los cuerpos minerales que para los cuerpos
orgnicos.
Cuando una pieza es sumergida en un fijador, pueden suceder tres cosas:
-

La pieza cae al fondo, en este caso el fijador es hipotnico, y la fijacin tiene bastantes
probabilidades de ser incompleta e irregular.
La pieza permanece flotando en la superficie, el fijador es hipertnico, muy denso y las clulas
se contraern.
La pieza se sumerge, pero queda por encima del fondo del recipiente, hay equilibrio fsico y la
fijacin ser buena si los ingredientes del fijador fueron bien elegidos.

Cualidades de los fijadores:

El fijador ideal sera aquel que conservase la clula en un estado idntico al estado viviente,
este fijador en realidad no existe, por eso debemos buscar una serie de cu alidades en el fijador a
utilizar que nos acerquen lo ms posible al fijador ideal.
Cualidades:
- Potencia o poder de penetracin: al menos en lo que concierne a los tejidos de manera que el
lquido pueda fijar muy bien las zonas ms profundas e igualmente las capas superficiales.
- El fijador debe producir una coagulacin total de los albuminoides, pero esto no quiere decir
que la coagulacin haya de ser violenta e instantnea, por el contrario, conviene que la
coagulacin sea en cierto modo fraccionada para evitar las contracciones.
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La rapidez de accin de un fijador debe tener por objeto el de matar lo ms pronto posible las
clulas. La precipitacin total, por el contrario, debe producirse adecuadamente de modo que no se
produzcan contracciones.
La muerte de la clula debe ser inmediata y su coagulacin debe ser mediata.
Agentes fijadores:
Los agentes fijadores pueden ser de orden fsico o de orden qumico.
Agentes Fsicos:
- Fro:
No puede ejercer ninguna accin fijadora a temperaturas que no pasen de 0 C. Endurece los
tejidos y suspende las alteraciones celulares debidas a la necrosis y a la autodigestin. Este
agente no sera ms que una ayuda.
La congelacin de los tejidos frescos parece ser a priori, un detestable procedimiento
histolgico. El aumento de volumen de los lquidos que los llenan y la formacin de agujas de
cristales no puede evitar la produccin de verdaderos deterioros. Su nica ventaja es la de no
precipitar los albuminoides y de no alterarlos.
-

Calor:
Ejerce una accin muy diferente segn se aplique a objetos secos o hmedos. La fijacin por
agua hirviendo o por diversos fijadores en ebullicin presta servicios para invertebrados y
bsquedas histoqumicas.

Agentes qumicos:
- cido actico:
Incoloro, cristalizable por debajo de 17 C. Aumenta el contraste entre ncleo y citoplasma.
Forma parte de la mayora de las mezclas fijadoras como fijador de la cromatina.
-

cido smico:
Se presenta bajo la forma de cristales amarillentos. Se obtiene comercialmente en pequeos
tubitos de vidrio sellados, contienen cantidades que varan de 0.1 a 1 g.
El manejo de este cuerpo presenta dificultades, es muy voltil y emite sin cesar vapores
extremadamente irritantes.
Es un enrgico oxidante por lo cual es reducido rpidamente por trazas de materia orgnica, por
lo que se debe tener especial precaucin para preparar las soluciones. El ttulo habitual es de 1
a 2 %, puede prepararse en agua destilada o en cido crmico.
Desde el punto de vista morfolgico, fija sin precipitar, impidiendo adems la precipitacin por
el alcohol durante la deshidratacin. Mata rpidamente las clulas y fija bien el citoplasma y el
condrioma pero no muy bien el ncleo. El osmio es un buen fijador de sustancias grasas y de la
mielina. Es poco difusible y por consiguiente poco penetrante de manera que las capas
superficiales de las piezas estn superfijadas mucho antes que el reactivo haya llegado al
interior.

cido pcrico:
Pequeos cristales amarillentos que se emplean en soluciones acuosas saturadas o en soluciones
alcohlicas. Solubles en fro en agua, mayor solubilidad con temperatura.
Es un reactivo muy penetrante que no se lo emplea solo, sino formando parte de mezclas, como
en el lquido de Bouin. El cido pcrico es un excelente fijador, sobre todo desde el punto de
vista tintorial. Se fija con intensidad sobre los citoplasmas, facilita todas las coloraciones.
Contrae pero endurece poco.

Alcohol metlico:
Reactivo importante en la tcnica de frotis desecados.

Alcohol etlico:
Puede servir como fijador el alcohol absoluto o el de 96 .
El alcohol 100, puede dar excelentes fijaciones, por ej. para el sistema nervioso o frotis
desecados.
Disuelve los lpidos, precipita el glucgeno sin fijarlo y da con los nucleoprtidos un
precipitado hidrosoluble. Es poco penetrante, fija mal los ncleos y poco los citoplasmas.

Bicloruro de Mercurio:
Pequeos cristales blancos muy venenosos, solubles en agua, en fro (7%) en ebullicin (54%),
muy soluble en alcohol (32%). En solucin acuosa precipita enrgicamente los albuminoides,
principalmente los del ncleo. Estas propiedades se exaltan por la adicin de cido actico, que
vuelve ms penetrante el fijador. Una vez terminada la fijacin es necesario eliminarlo de los
tejidos para evitar la formacin de cristales.

Bicromatos:
Los bicromatos alcalinos, (Potasio, sodio, Magnesio, Estroncio, Zinc) fijan bien los citoplasmas
pero destruyen los ncleos. Los bicromatos de Bario, Calcio, Cobre, fijan bien las mitosis pero
no los citoplasmas. El ms empleado de los bicromatos es el de Potasio, gruesos cristales de
color rojo anaranjado, fcilmente solubles en agua (12.4%).

Formaldehdo:
Este cuerpo es un gas cuya solucin acuosa lleva el nombre de formalina o de formol. Toda vez
que hablemos de formol puro tendremos en vista la solucin comercial al 40%.
El formol es el fijador ms utilizado, a causa de su bajo precio y la facilidad de su empleo.
Es un fijador importante a causa de su poder coagulante y su notable capacidad de penetracin.
El formol comercial es un lquido incoloro, que emite vapores irritantes. A veces los vapores
del formol pueden producir accidentes febriles, bronquitis, queratitis.
Resulta muy desagradable manejar piezas embebidas en formol a causa de las violentas
punzadas que no se tarda en sentir en los ojos, la accin sobre la mucosa olfatoria, es tal vez
menos sensible, pero ms durable y la olfacin puede terminar por quedar notablemente
disminuda.
Conviene no poner los dedos en contacto con las soluciones que contienen formol porque la
epidermis se fija rpidamente y endurece de manera poco agradable, adems de poder
ocasionar dermatitis alrgicas por contacto.
Para manejar piezas que han permanecido en formol sin sufrir los inconvenientes mencionados,
se las lava con agua y luego se las introduce en agua ligeramente amoniacal, as se suprime
todo olor.
El formol de comercio casi siempre contiene una cantidad ms o menos considerable de cido
frmico. Esta impureza daa muchas veces la fijacin, produce precipitacin en los tejidos,
destruye las clulas mucosas y daa seriamente los citoplasmas por lo que es necesario
emplear siempre formol neutro.
Es conveniente adoptar una convencin para formular el ttulo de las diluciones:
El porcentaje mirar siempre la soluci n comercial de 40%, para preparar una solucin al 5%
se mezcla 5 cc. de formol con 95 cc. de agua. La solucin comercial presenta a veces una
alteracin particular que se manifiesta por un aspecto lechoso y por la formacin de
precipitado blando ms o menos abundante, el fro interviene mucho en este fenmeno.
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Estas transformaciones se explican por la existencia de tres ismeros:

a.- El formol con una molcula de formaldehdo,
b.-el paraformol con dos molculas,
c.- el trioximetileno con tres molculas.
El formol y el paraformol coexisten en las soluciones lmpidas, bajo la influencia del fro o por
otras causas, se polimerizan y dan trioximetileno, insoluble, que forma un precipitado blanco.
Tericamente el formaldehdo es un no-electrolito, por consiguiente incapaz de formar sales,
pero s de formar compuestos de adicin.
El formol solo, puro o diluido es un mal fijador, produce hinchamiento de los tejidos y
vacuoliza las clulas o bien les da un aspecto de sobrefijados, disminuye los contrastes entre
citoplasma y ncleo.
La adicin de cido actico, corrige el defecto del formol y aumenta notablemente la
coloreabilidad del ncleo. En los rganos muy vascularizados el formol a veces forma
precipitados negruzcos muy incmodos, que pueden pasar por pigmentos. Para eliminarlos
pueden tratarse los cortes con potasa. El formol forma parte de gran cantidad de mezclas
fijadoras y es uno de los mejores fijadores para el sistema nervioso y para las mitocondrias.
Mezclas Fijadoras:
Las mezclas fijadoras se utilizan para tcnicas de rutina o para tcnicas especiales.
Las mezclas fijadoras son combinaciones de agentes fijadores, cada uno de los cuales es por si solo
insuficiente para dar una fijacin que respondaa todas las exigencias.
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de von Tellyesniczki:
A base de bicromato de potasio cido actico y agua destilada (3 g, 5 cc, 100cc). el bicromato
conserva bien el citoplasma. El cido actico conserva bien los ncleos. Las muestras no deben
ser mayores de 0.5 cm de dimetro. El tiempo de fijacin no debe superar los dos das, al
trmino del mismo debe hacerse un lavado en agua corriente de 24 h.
de Bouin:
Para hacer esta mezcla es conveniente tener una solucin saturada de cido pcrico.
Componentes: solucin saturada de cido pcrico 15 cc, formol 40% 5 cc, cido actico 1 cc.
Es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucgeno; penetra rpidamente a los
tejidos, es un buen fijador general, salvo para el rin. Es muy adecuado para las coloraciones
de Masson y Mallory. Produce poco encogimiento. Segn el tamao de la pieza la fijacin
requiere de 1 a 24 h. El lquido completo es una solucin estable. Este fijador produce lisis de
los glbulos rojos y disminuye la cantidad de hierro frrico demostrable. Los tejidos no deben
permanecer por ms de 12 a 24 h. pues sino se vuelven duros y quebradizos. Una vez terminada
la fijacin se debe pasar directamente a la deshidratacin con alcohol 80.
De Carnoy:
Los componentes de esta mezcla son los siguientes: alcohol etlico, cloroformo, cido actico
glacial (60 ml, 30 ml, 10 ml ).
Este fijador es muy adecuado para pequeos fragmentos tisulares, por ej. obtenidos por
raspado, que se fijan bien en 30 min. a 2 h. Tambin inicia la deshidratacin, es un bu en fijador
para el glucgeno, los ncleos se tien bien. Como inconvenientes podemos citar que produce
lisis y encogimiento importante. Disuelve los lpidos y la mielina. Fija bien el glucgeno.

3.- Deshidratacin:

Concepto:
Los tejidos contienen grand es cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que
debe ser eliminada y reemplazada por parafina.
Detencin de la fijacin:
Una vez transcurrido el tiempo de fijacin deseado es preciso detenerlo rpidamente.
El fijador que rodea la pieza p uede ser eliminado por lavado en:
a.- agua
b.- alcohol
a.- Es imprescindible hacerlo despus de la fijacin con cido crmico, bicromato de potasio y
cido smico.
Se hace en agua corriente de 2 a 24 h.
b.- Piezas que han estado en alcohol, cido pcrico o formol, se llevan directamente al alcohol 70 o
80%, llevndose as a cabo el lavado y el inicio de la deshidratacin.
La deshidratacin se realiza por medio de un reactivo anhidro pero vido de agua. Puede utilizarse
la acetona o el alcohol etlico (es el ms utilizado).
La deshidratacin se hace en forma progresiva con sucesivos baos de alcohol, cada vez menos
hidratados 70 80 90 96 100.
Tiempos de permanencia en cada lquido:
Alcohol 70
las piezas pueden perman ecer varios das.
Alcohol 96
2 baos en un lapso de 24 h.
Alcohol 100
3 baos de una hora c/u.
Como han de introducirse las piezas:
Las piezas se han de envolver en gasa a manera de bolsitas, colocarlas en cartulina, etc. pero
siempre suspendidas.
Para la deshidratacin debern emplearse frascos anchos y de cierre hermtico. Los recipientes
deben ser agitados peridicamente para que la mezcla de alcohol y agua sea lo ms perfecta
posible.
En cada etapa la cantidad de deshidratante debe ser superior a 10 veces el volumen del tejido por
deshidratar. Una mala deshidratacin es siempre perjudicial por lo que es necesario controlar el
resultado de la misma.
Los disolventes utilizados antes de la parafina son el xileno, benceno, tolueno, butilo, si la pieza ha
sido mal deshidratada los lquidos se tornan opalinos.

4.- Preparacin para la Inclusin:

El aclaramiento o desalcoholizacin permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado
por un lquido (solvente) que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado.
La parafina es un hidrocarburo slido, con escasa elasticidad que ha de penetrar a los tejidos,
ocupando hasta sus ltimos intersticios. Para lo cual ha de licuarse mediante temperatura.
Solventes:
Benceno xileno tolueno cloroformo fenol en alcohol carbolxilol etc.
La palabra aclarar proviene de que adems de eliminar el alcohol muchas de estas sustancias tienen
la propiedad de trasparentar los tejidos.
Xileno: es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los tejidos sean excesivamente
duros y quebradizos y esto nunca deben dejarse en este lquido ms de 3 horas.
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El xileno es inadecuado para el encfalo y los ganglios linfticos, pues los hace demasiado
quebradizos, para estos rganos es mejor utilizar cloroformo.
Tolueno: tiene las mismas propiedades generales que el xileno pero resulta mejor porque endurece
mucho menos los tejidos.
Cloroformo: resulta excelente para el tejido nervioso, ganglios linfticos y emb riones pues
produce poco encogimiento y no endurece mucho los tejidos.
Cmo se realiza el aclaramiento? :
Las piezas se trasladan a un frasco que contenga el volumen adecuado del solvente (30
veces).
Si cuando las piezas son colocadas en el solvente se observa que estn formando nubosidades
opalinas y que estas no desaparecen de inmediato, quiere decir que la deshidratacin no ha sido
completa. Debe volverse al alcohol absoluto.
Cundo esta terminado este paso? La finalizacin de este paso es tarea de la vista, si las piezas se
han vuelto difanas, trasparentes, lo est. Las piezas pueden ser trasladadas a la parafina.

5.- Inclusin:
La parafina es un hidrocarburo no cclico. A la temperatura ambiente es slido. La
temperatura suave la disuelve por completo. Una temperatura mayor de 65 llega a disolverla,
producindose vapores de olor desagradable, inflamables y tambin txicos. Hay parafinas que
funden a distintas temperaturas, para la mayora de los trabajos pueden utilizarse las que lo hacen a
56-58. En la estufa debe haber cuatro vasijas con parafina ya disuelta. En cada vasija ha de haber
un volumen suficiente como para cubrir por completo las piezas que se han de colocar. Es
conveniente que cada vasija posea su nmero de orden 1, 2, 3 y 4.
El recipiente nmero 1 debe tener parafina ya fundida a la que se mezclar una pequea cantidad de
solvente, el 2 y 3 deben contener parafina pura, que poco a poco ira adquiriendo algo de solvente
cuando las piezas vayan pasando por ellas.
El 4 debe tener parafina completamente pura.
Tiempo de cada bao:
Depende un poco del tamao de cada pieza. En cada recipiente pueden estar de 2 a 3 h. Lo
que se ha hecho hasta ahora mediante los baos de parafina se conoce con el nombre de
impregnacin.
La inclusin consiste en encerrar cada pieza dentro de un bloque de parafina pura.
Pasos de la inclusin:
Se ha de preparar tantos moldes cuantas piezas han de incluirse.
Se extrae una pieza, se la libera de la envoltura de gasa, se la ubica en el fondo del molde,
orientndola para saber luego por donde ha de ser cortada.
Sobre la pieza puesta en el molde se vierte parafina fundida, pura de la cuarta vasija. Se deja el
molde sobre una superficie plana y fra, se espera que la falta de calor solidifique toda la parafina,
formndose as un bloque. Mientras se trabaja en una pieza las dems deben estar en la estufa.
Los moldes:
Los hay de varias clases: barras de Leukart, cajas de papel, hormas de metal.
Barras de Leukart:
Consisten en un par de barras de metal, dobladas en ngulo recto a manera de escuadras. A su vez
cada rama de la escuadra tiene un ngulo recto en el extremo. Esta disposicin permite que una
barra se aplique contra la otra, como permite deslizamiento es posible agrandar o achicar el molde
conforme las neces idades.
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Las cajas de papel :

Se construyen con una tira de cartulina delgada o con papel resistente. Son muy econmicas con
respecto a las barras dado que aquellas son sumamente caras.
Hormas de metal:
Se pueden hacer de dos maneras circulares o cuadradas . Las circulares se hacen cortando
transversalmente rodajas de caos de metal o de plstico, las cuadradas se hacen cortando lminas
de aluminio o de hojalata que se doblan sobre un molde de madera, los extremos libres pueden
soldarse.
Ambos tipos de hormas carecen de piso, por lo que es necesario colocarlas al hacer la inclusin
sobre una superficie lisa (ej. un azulejo)

6.- Modelado del bloque catalogacin:

La forma de los bloques deben ser preferentemente de pirmide truncada. Las caras opuestas
han de resultar paralelas entre s, lo mismo que las aristas.
Catalogacin:
Cada pieza lleva un hilo con una tarjeta donde se indica de qu rgano o porcin del mismo
se trata. Esta medida es la base para catalogar los bloques. La catalogacin puede hacerse de
diferentes maneras de acuerdo a las necesidades particulares.
Siempre se tendr en cuenta que en la misma conste, animal, fijador, fecha, cdigo, bloques, etc.

7.- Seccin con el micrtomo extendido de los cortes pegado:

Como la finalidad de todos estos pasos es poder observar los tejidos con el microscopio, es
necesario reducir las piezas histolgicas a delgadas secciones.
Las secciones finas y parejas se obtienen con el micrtomo. Este aparato consiste bsicamente en
una base pesada que soporta una superficie por la que se desliza una cuchilla, un tornillo que
acerque el material y lo ponga al alcance del filo de la navaja, de modo que siempre su avance
ofrezca la misma medida del material.
Como el tipo de micrtomo ms utilizado es el de deslizamiento, las indicaciones se harn siempre
con referencia a este tipo.
El bloque se debe pegar en un taco de madera, de la siguiente forma: se calienta una esptula en la
llama de un mechero, la que se aplica a la cara inferior del bloque, que se sostiene algo inclinado
sobre el taco de madera, a fin de que algunas gotas de parafina fundida caigan sobre su cara
superior, una segunda aplicacin de la esptula calentada contra la parafina, disolvern otra porcin
de parafina, que no ser necesario dejar caer sobre el taco, y el bloque se aplica y presiona entonces
contra el taco y luego se deja enfriar.
El micrtomo lleva una pieza que posee una morsa, entre sus ramas se coloca el taco de madera y
luego se aprietan con el tornillo de presin hasta que este muy firme.
Es conveniente que la navaja del micrtomo ya este colocada en el cepo de la pieza portacuchilla.
Una vez colocado el bloque se hace deslizar la cuchilla hasta que su filo est ubicado sobre el
bloque.
La pieza portabloque posee una cremallera que permite bajar o subir el bloque, que deber hacerse
contactar con el filo de la navaja. La cara inferior de la cuchilla no debe ser paralela a la cara del
corte.

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Como se regula el espesor de los cortes?

Se hace mediante un tornillo micromtrico, sus pasos de rosca son muy estrechos. Al
avanzar, empuja el bloque portamaterial por una rampa oblicua al plano de deslizamiento de la
cuchilla. Para hacerlo avanzar hay una palanca lateral, una especie de brazo y un tope.
Elegido el espesor que se desea dar a los cortes, se desliza la cuchilla. Se hace el primer corte. Este
si ha salido entero, se recoge con un pincel hmedo y se deposita en la superficie del agua contenida
en una bandeja o cubeta. Es mejor que sea agua fra. Los cortes que naturalmente salen ondulados
se extienden y alisan por completo mediante el agregado a la bandeja de agua tibia.
Pegado de los cortes:
Para la mayor parte de los preparados de histologa normal, la tcnica exige que los cortes
estn fijos.
El portaobjeto debe estar limpio, para recoger cortes se toma un portaobjeto seco, se deposita en su
centro una gota pequea de albmina de Mayer, se extiende esta gota con el borde externo del dedo
meique. La gota debe quedar extendida por completo, formando una pelcula sumamente delgada,
casi invisible.
Ahora se lleva el porta al agua de modo que su cara untada est arriba. Se coloca esta cara por
debajo de un corte sin defectos. El corte puede ser sujetado por un pincel. Se levanta el porta y se
extrae del agua junto con el corte en el centro del porta.
Todava el corte est libre, para que se adhiera hay que hacer evaporar el agua y coagular la pelcula
de albmina de Mayer mediante calor, esto se consigue llevando el porta a una estufa a 37 0 40 ,
durante unos 30 min como mnimo.

8.- Coloraciones de rutina y especiales:

Las manipulaciones siguientes son inmediatamente previas al proceso de coloracin. Para
que el corte pueda ser coloreado debe estar completamente libre de parafina y suficientemente
hidratado.
Los colorantes son cuerpos qumicos disueltos en agua destilada o a veces el alcohol. La parafina no
se mezcla con ellos, como aquella ha penetrado en el interior de las clulas estas no podrn ser
teidas.
Desparafinacin de los cortes:
Para realizar la desparafinacin de los cortes los mismos son introducidos en un frasco de
boca ancha que contenga xileno. Lo ideal es hacer dos baos de aproximadamente 10 min. c/u, de
esta forma se asegura una perfecta desparafinacin de los cortes. El xileno puede utilizarse varias
veces.
En los pasos siguiente el xileno debe ser eliminado porque sino la hidratacin del corte ser
imposible. Se elimina mediante el alcohol etlico. Se realizan sucesivos lavados en alcohol 100.96
y 70.
Una vez realizados los baos con alcohol se puede proceder a la hidratacin de los cortes.
La hidratacin es una operacin necesaria. Debe eliminarse el resto de alcohol que hay en el corte.
Se realiza sumergiendo los mismos en un frasco que contenga agua destilada, durante dos o tres
min. De esta forma el corte estar listo para comenzar algn proceso de coloracin.
Teora de la coloracin:
Se sabe que las imgenes producidas por absorcin, en preparaciones coloreadas, son mucho
ms fciles de interpretar que las imgenes de difracciones dada por preparaciones no coloreadas,
adems los diversos elementos de los tejidos poseen poco ms o menos el mismo ndice de
refraccin lo que hace que el reconocimiento sea una tarea difcil.
Estos dos argumentos hacen comprender la necesidad de las coloraciones para el estudio
morfolgico de clulas y tejidos.
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Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo.

La mayor parte de los colorantes artificiales (y an los naturales como la hematoxilina), derivan de
cuerpos incoloros, por ej. de carburos aromticos.
La coloracin es la propiedad que tienen ciertos cuerpos de ejercer una absorcin selectiva sobre la
luz. Dicho de otra manera un cuerpo se ve de tal color porque trasmite por trasparencia o por
difusin las radiaciones complementarias de las que l absorbe.
Tipos de coloraciones:
Directas: se producen por inmersin en el bao colorante.
Indirectas: en este tipo de coloracin, el colorante no puede actuar directamente, el objeto que ha
de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia que lo prepare para admitir el
colorante, esta se llama mordiente.

Clasificacin de los colorantes:

Puede hacerse desde el punto de vista qumico (por su naturaleza) o desde el punto de vista
histolgico (por su uso).
Desde el punto de vista qumico los colorantes se agrupan conforme a su constitucin.
Desde el punto de vista histolgico se los clasifica en naturales y artificiales.
Colorantes naturales:
En todos ellos hay un principio colorante producido por la naturaleza que luego la tcnica
del hombre ha sabido extraer, componer y hacerlo efectivo.
Hematoxilina: La hematoxilina es una sustancia capaz de colorear, extrada de la madera de un
rbol conocido como rbol de Campeche, originario de Centroamrica.
La hematoxilina se expende en polvo, el cual es cristalino, casi incoloro o algo amarillento a veces
ms oscuro.
La hematoxilina, como tal, aunque est disuelta en agua o en alcohol de 96 o de 100, es incapaz
de colorear, para poder hacerlo, debe sufrir una oxidacin.
La hematoxilina oxidada es hematena y bajo este cambio fsico -qumico y la unin con una base es
capaz de colorear.
La base es conocida como mordiente, hay muchas bases que actan como tal, la ms conocida es el
alumbre que puede ser de potasio, hierro o cromo.
El mordiente es un intermediario entre el colorante y el tejido y en general entre dos cuerpos que
qumicamente carecen de afinidad.
De alguna manera activa las molculas del tejido y forma con ellas una unin firme y estable. Con
el colorante forma un precipitado que presenta una fuerte coloracin y es, adems insoluble en
agua y otros lquidos. Este tipo de precipitado coloreado se llama laca. Los mordientes deben ser
cidos nunca bsicos.
Orcena: Es un principio colorante extrado de ciertos lquenes. Es un cido dbil. Utilizando una
mezcla en que el cido actico acta como mordiente se utiliza para colorear cromosomas. Tambin
colorea las fibras elsticas.
Colorantes artificales:
Algunos son colorantes del ncleo y otros del citoplasma.
Son sales producidas de la unin de una base y un cido.

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Colorantes para el ncleo: su base es la que se combina con los cidos nucleicos, por lo tanto
sta es la coloreada. El cido es el incoloro.
Colorantes para el citoplasma: el cido del colorante es el que se combina con el citoplasma.
La base es la incolora.
Colorantes artificiales ms comunes: vesubina, tionina, azul de toluidina, azul de metileno, fucsina
bsica, violeta de metilo, verde de metilo, anaranjado de acridina.
Se ha dividido a los colorantes segn su afinidad que presentan con el ncleo o con el citoplasma:
colorantes nucleares o bsicos su componente colorante activo es una base coloreada.
Colorantes citoplasmticos o cidos: su componente activo es un cido coloreado.
Colorantes neutros.
La mayor p arte de los colorantes que se utilizan son sales.
Los colorantes bsicos son sales cuya base es coloreada y su cido es incoloro, Ej. azul de
metilenoclorhidrato de tetrametiltionina o sea es una sal formada por la combinacin de la
tetrametiltionina (base coloreada) de azul de metileno con el cido clorhdrico. Reaccionan con los
grupos fosfato de los cidos nucleicos (DNA-RNA), los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos
y los grupos carboxilo de las protenas.
Los colorantes cidos llevan una base que es incolora combinada con un cido coloreado, Ej.
eosinaeosinato de potasio (base incolora) combinada con el cido eosnico
(tetrabromofluorescena) que es coloreado.
Los colorantes neutros tanto el cido como la base son coloreados Ej. eosinato de azu l de metilenoazur de metileno.
Los componentes que se tien con colorantes cidos se dicen que son acidfilos (filamentos
citoplasmticos, la mayor parte del citoplasma no especializado, y las fibras extracelulares).
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante bsico se dice que es basfilo
(heterocromatina, nucleolos, ergastoplasma, matriz del cartlago).
Proceso de coloracin:
Tomaremos como base para la descripcin de este proceso a la coloracin de hematoxilina y eosina
considerada como la coloracin de rutina.
Coloracin de hematoxilina y eosina:
Desparafinar los cortes: realizar dos baos de xileno de 10 a 15 min. c/u.
Eliminamos el solvente por sucesivos baos en: alcohol de 100, 96, 70 de 1 a 2 min. c/u.
Hidratacin de los cortes: en agua destilada durante 1 a 2 min.
Tincin nuclear: en hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada.
Viraje de la hematoxilina: en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5 min.).
Lavado en agua destilada o corriente.
Coloracin citoplasmtica: eosina al 0.5% o en una mezcla de eosina/floxina al 0.5% durante 15
a 30 seg.
Lavado en agua destilada.
Deshidratar, aclarar y montar.
Los pasos de la deshidratacin pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37 por 15
a 20 min.

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Coloraciones especiales:
Las coloraciones especiales comprenden un conjunto de tinciones o impregnaciones utilizadas para
poner de manifiesto o resaltar determinadas estructuras de los tejidos.
Para tejido conectivo:
Fibras colgenas:
Tricrmico de Van Gieson: las fibras colgenas se observan de color rojo.
Tricrmico de Gomori: se observan de color rojo.
Tricrmico de Masson: las fibras colgenas se observan de azul.
Fibras Elsticas:
Mtodo de Gomori: las fibras elsticas se tien de prpura oscuro.
Orcena: se tien de prpura.
Fibras reticulares:
Mtodo de Gomori para la impregnacin argentica de la reticulina: las fibras reticulares se
observan negras.
Tejido adiposo:
Sudan black: el tejido adiposo se observa de color negro.
Sudan IV-rojo Escarlata:
- grasas neutras: se observan de color rojo vino.
- lipoides: rojo anaranjado
- fosfolpidos: se tien poco o nada.

Carbohidratos y mucopolisacridos:
Acido Perydico de Schiff (PAS): los mucopolisacridos bsicos o neutros se observan de color
rojo.
Azul alcian: los mucopolisacridos cidos se observan de color azul.
Coloracin para el estudio neurohistoqumico:
Coloracin de la sustancia de Nissl- mtodo de la tionina fenicada: los grumos de Nissl y
ncleos aparecen teidos de color azul profundo.
Luxol fast blue-PAS-hematoxilina: la mielina se observa azul brillante
Modificacin de la tcnica de Glees-mtodo de Marsland, de impregnacin argntica a cortes de
parafina: clulas nerviosas, neurofibrillas y clulas de la glia en diversas tonalidades de negro,
fondo de color habano.

BIBLIOGRAFA

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