Tesis 16

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
VALORACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DEL PRODUCTO

EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS
ALCOHLICAS
MARIA PAULA TORRES TORRES
PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de Microbilogo Industrial
BOGOTA, D.C
Julio 19 de 2007

ALCOHLICAS
APROBADO
___________________________
Olga Luca Mondragn Flrez
Microbiloga
DIRECTORA
_____________________
______________________
Jennifer Alejo
Adriana Pez
Microbiloga
Microbiloga
JURADO
JURADO
BOGOT, D.C.
Julio 19 de 2007

ALCOHLICAS
______________________________
_________________________
Dra. ngela Umaa Muoz. M.Phill
Dr. Lus David Gmez. MSc.
Decana acadmica
Director de carrera
BOGOT, D.C.
Julio 19 de 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos

por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se
publique nada contrario al dogma y a la moral catlica y por que las
tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
DEDICATORIA
Este trabajo est dedicado a Dios por poner en mi camino cada etapa de
mi vida en el momento y en el lugar adecuado. A mis paps Guillermo y
Patricia, por haberme brindado toda su sabidura, su amor y sobre todo su
apoyo incondicional en todo momento y en todas las decisiones que he
tomado y por haber realizado grandes esfuerzos a lo largo de toda mi
carrera para que pudiera ser una gran profesional; a mi hermana Catalina
por su amor, consejos y apoyo brindado a tiempo; a mi familia en general
por ser guas a lo largo de este recorrido; a Janeth Arias por su amistad y
asesora para la realizacin de este trabajo; a mis amigos por la paciencia
y ayuda que me dieron en todo momento; a Olga Luca por su apoyo y
amistad incondicional para que terminar con xito los ltimos semestres
de mi carrera y finalmente a cada una de las personas que de alguna
manera llegaron a mi vida en diferentes circunstancias llenndome de
alegra, amor y fortaleza para finalizar con xito esta etapa de mi vida.
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
1. Introduccin..1
2. Marco Terico..3
2.1.
Levadura.3
2.1.1. Levadura cervecera..3

2.1.1.2. Morfologa (Forma) y composicin celular.3
2.1.1.3. Composicin de la clula de la levadura4
2.1.1.3.1. Protenas..5
2.1.1.3.2. cidos nucleicos..5
2.1.1.3.3. Paredes celulares...5
2.1.1.3.4. Membranas..6
2.2.
Crecimiento y Multiplicacin celular...6
2.2.1. Curva de crecimiento microbiano....6

2.2.1.1. Fase de adaptacin7
2.2.1.2. Fase logartmica.8
2.2.1.3. Fase estacionaria9
2.2.1.4. Fase de muerte...9
2.3. Reproduccin de la levadura...9
2.3.1. Reproduccin Sexual (Meiosis)...9
2.3.2. Reproduccin Asexual (Mitosis)10
2.3.2.1. Divisin celular..10
2.3.2.2. Esporas vegetativas.10
2.3.2.3. Gemacin..10
2.3.2.3.1. Reproduccin por Gemacin..10
2.3.2. Factores que intervienen en la reproduccin de la levadura11
2.3.2.1. Oxgeno..11
2.3.2.2. Temperatura..11
2.3.2.3. Composicin del mosto (sustrato nutritivo)..11
2.4. Floculacin de la levadura11
2.4.1. Hidrofobosidad.12
2.4.2. Potencial Zeta..12
2.4.3. Interaccin protenas azcares..12
2.4.4. Factores que influyen en la floculacin12
2.5. Mutacin de la levadura.13
2.5.1. Mutaciones ms comunes en el proceso cervecero..13
2.5.1.1. Floculacin.13
2.5.1.2. No asimilacin de la maltotriosa....13
2.5.1.3. Precipitacin temprana13
2.5.1.4. Respiracin deficiente.13
2.6. Levaduras salvajes.14
2.7. Metabolismo de los carbohidratos14
2.7.1. Gluclisis..15
2.7.2. Ciclo de Krebs.18
2.8.
Bacterias lcticas como contaminantes..20
2.8.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo.20

2.8.2. Requerimientos nutricionales de bacterias lcticas y subproductos.
2.8.2.1.
Nitrgeno23
2.8.2.2. Oxgeno..23
2.8.2.3. Subproductos que pueden afectar la calidad del producto...23
2.9.
Factores que afectan el rendimiento del alcohol...24
2.9.1. Cambios de pH durante la fermentacin.24

2.9.1.2. Absorcin de bases por la levadura..25
2.9.2. Produccin de cidos.25
2.9.3. Floculacin de la levadura.26
2.10. Proceso de elaboracin de la cerveza27
2.10.1. Molienda..27
2.10.2. Proceso en Pailas..28
2.10.3. Filtracin del Mosto.......28
2.10.4. Ebullicin del Mosto......29

2.10.5. Enfriamiento del Mosto.30
2.10.6. Fermentacin.31
2.10.6.1. Principales transformaciones que tiene lugar
durante la
fermentacin33
2.10.6.1.2. Consumo de oxgeno.33
2.10.7. Maduracin.35
2.10.7.1. Dos etapas..36
2.10.7.2. Fermentar hasta el extracto lmite...36
2.10.8. Filtracin..38
2.10.9. Envasado39
3.
Justificacin40
4.
Objetivos del proyecto..41
4.1. Objetivo general..41

4.2. Objetivos especficos..41
5.
Materiales y Mtodos...42
5.1. Tipo de estudio42

5.2. Anlisis Microbiolgicos44
5.3. pH, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de Incubacin45
5.4. Tcnicas Empleadas..45
5.4.1. Siembra en Placa.45
5.4.2. Filtracin por membrana.46
5.4.3. Recuento en cmara de Neubauer...47
5.4.3.1. Levadura en Proceso de Fermentacin y Maduracin..47
6.
Resultados ........................................48
7.
Discusin de Resultados.58
8.
Conclusiones.......................72
9.
Recomendaciones73
10.
Referencias Bibliogrficas...74
11.
Anexos78
LISTA DE TABLAS
Pg.
Tabla 1. Porcentaje de la Materia seca remanente.4
Tabla 2. Anlisis Microbiolgicos.44
Tabla 3. pH, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de Incubacin45
Tabla 4. Agua acueducto de Cali.48
Tabla 5. Enjuagues Tanques (Fermentaciones y Maduraciones)..49
Tabla 6. Agua de Empuje y Mosto...50
Tabla 7. Propagacin de la Levadura..51
Tabla 8. Fermentaciones y Maduraciones..51
Tabla 9. % Petite Mutants (Respiracin Deficiente)..54
Tabla 10. Agua Desairada.55
Tabla 11. Tierra Diatomcea.55
Tabla 12. BBT`s..56
Tabla 13. Sifn (Cerveza sin pasterizar).56
Tabla 14. Conteo celular Fermentaciones..56
Tabla 15. Conteo celular Maduraciones.57
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1. Morfologa Saccharomyces cerevisiae.3
Figura 2. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilizacin
de la glucosa...16
Figura 3. Ciclo del cido tricarboxlico (Ciclo de Krebs)...19
Figura 4. Fermentacin de glucosa por bacterias cido lcticas21
Figura 5. Proceso Cervecero42
Figura 6. Material para toma de muestras..43
Figura 7. Enjuague Tanque 107...49
Figura 8. Medios Utilizados en (Propagacin, Fermentacin
y Maduracin)52
10
RESUMEN
Este trabajo se realiz con el objetivo de evaluar la calidad microbiolgica
del producto en proceso en una planta productora de bebidas alcohlicas.
Como primera medida se hizo una revisin del proceso tpico cervecero
llevado a cabo en la planta con el fin de identificar los puntos crticos
claves durante la produccin y para llevar a cabo el cumplimiento de los
objetivos planteados al inicio de esta valoracin, se tomaron muestras en
cada una de las etapas identificadas, donde el manejo de las muestras se
realiz,
utilizando
material
estril
(botellas
biolgicas)
su
almacenamiento previo a la siembra se llev a cabo bajo condiciones de

refrigeracin para evitar multiplicacin de microorganismos presentes en
stas o proliferacin de contaminantes por mal manejo de las mismas,
para garantizar la trazabilidad de este estudio, los resultados obtenidos
durante todo el proceso de investigacin, fueron consignados en un
formato que previamente fue establecido. Para el aislamiento e
identificacin de los diferentes microorganismos se llevaron a cabo las
tcnicas de siembra en superficie y profundidad, recuento en cmara de
Neubauer y filtracin por membrana, utilizando medios altamente
selectivos que garantizaran el xito de la siembra y a su vez se respet
pH, tiempos, temperatura y mtodos de incubacin que ya haban sido
estandarizados. Los resultados encontrados en la mayor parte de las
etapas de produccin fueron consistentes a lo largo del estudio puesto
que no se identificaron microorganismos ajenos o contaminantes del
proceso cervecero, sin embargo donde se encontraron variantes de la
levadura al observar los indicadores, las muestras no se salen de los
parmetros establecidos para encontrar este tipo de mutacin durante el
proceso fermentativo, entrando dentro de especificaciones. Finalmente,
se pudo concluir que la estandarizacin que se tiene actualmente del
proceso es la adecuada y con la cual se puede garantizar una ptima
calidad del producto terminado.
11
Palabras Claves: Valoracin de la calidad, Produccin de cerveza,

Variantes de levadura
ABSTRACT
Present work had an objective to evaluate microbiological quality of
product in process at alcoholic beverage industry plant. First was doing a
review of typical process at plant goes to identify critical points during
production and objectives since that validation started.
All parts of process were sampling using sterile material (sample bottles)
and there were package refrigerated.
Results were consigned in a previously established format to have a
guaranty of tradability of present study.
To the isolation of microorganisms techniques used were: counting
chamber Neubauer and membrane filtration using selective mediums
under standardized conditions like pH, time, temperature and incubation
methods.
Results showed that in all time of present study, measures were
consistent because didnt find foreign microorganisms, however, where
we found yeast variants, samples didnt going out of established
parameters.
Finally, we can conclude that standardization of process is adequate to
guaranty the quality of finished product.
Keys
words:
evaluate
microbiological
microorganisms, yeast variants
12
quality,
beer
production,
1. INTRODUCCIN
La premisa fundamental de una empresa productora de bebidas
alcohlicas es que la calidad de sus productos surge como consecuencia
de hacer las cosas bien desde el comienzo, en forma ordenada y
metdica, es as como en el proceso de elaboracin se ha observado que
uno de los aspectos ms importantes para esta empresa consiste en
garantizar una excelente calidad de su producto, por medio de un riguroso
control, la utilizacin de una buena y adecuada materia prima y la
realizacin de un ptimo proceso de fabricacin, logrando as el objetivo
de la satisfaccin de sus clientes, tanto externos como internos, en el
marco de un proceso integrador de todas las reas involucradas en el
sistema de calidad.
En la medida que se avanza en el proceso de elaboracin de la cerveza,
se evidencia que dentro de cada una de las etapas de elaboracin existen
muchos riesgos que pueden afectar el producto en proceso organolptica,
fisco- qumico y microbiolgicamente y de esta manera influir en la calidad
del producto terminado.
En el control de la calidad se encuentran involucrados no solo el control
proceso,
las
especificaciones
el
muestreo,
sino
tambin
los
procedimientos de organizacin, documentacin y autorizacin que

aseguran se lleven a cabo las pruebas pertinentes para verificar el
cumplimiento de los estndares internacionales y de est manera
asegurar que la calidad es satisfactoria.
Es as como el objetivo de este trabajo de investigacin es valorar la
calidad microbiolgica del producto en proceso empleado en cada una de
las etapas de produccin de bebidas alcohlicas, con el fin de identificar
los microorganismos tpicos o posibles contaminantes, que puedan
13
afectar la calidad del proceso de elaboracin y de esta manera establecer

por medio de los resultados obtenidos, si stos afectan la calidad del
producto terminado.
14
2. MARCO TEORICO
2.1. Levadura
Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen principalmente
por gemacin, son organismos eucariticos, es decir que tienen una
membrana nuclear bien definida que envuelve el ncleo (Adams et al,
1998).
Las levaduras son las causantes principales de la fermentacin de los
alimentos, lo cual puede ser perjudicial (deterioro) o favorable (produccin
de cervezas, vinos, pan, quesos, enzimas, etc) (Adams et al, 1998).
2.1.1. Levadura cervecera
Saccharomyces cerevisiae tiene como caracterstica que al final de

la fermentacin se va al fondo del tanque, se conoce como
levaduras de profundidad y su temperatura ptima de fermentacin
es de 10 14 C (Aguilar, 2003).
2.1.1.2. Morfologa (Forma) y composicin celular
S. cerevisiae tiene forma esfrica, elipsoide u ovoide. Su tamao vara
con la edad de la clula pero generalmente oscila entre 4 y 14 micras.
Puede vivir aislada o formando colonias (Aguilar, 2003).
Fuente: El cervecero en la prctica, 2002.

Figura 1. Morfologa de Saccharomyces cerevisiae.
15
La clula est constituida aproximadamente por:

P-glucanos (polisacrido)
40%
Mananos (polisacrido)
40%
Protenas
8%
Lpidos (grasas)
7%
Sustancias inorgnicas
3%
Hexosamina y quitina
2%
2.1.1.3. Composicin de la clula de la levadura

Con el objeto de producir una nueva clula, todos los compuestos
presentes en la clula se deben incrementar. La clula de levadura tiene
alrededor del 75 80% de agua (Adams et al, 1998).
El contenido de otros materiales es usualmente expresado como % de la
materia seca remanente.
% DE LA MATERIA SECA REMANENTE
Minerales:
8%
Carbohidratos:
40%
Material nitrogenado:
Protenas
64%,
peptonas
10%,
aminocidos
8%,
cidos nucleicos.
Lpidos:
1% - 2%
( 5% P2O5 ; 3%K2O)
(glucgenos,
Betaglucanos, etc)
Fuente. El cervecero en la prctica, 2002

Tabla 1. Porcentaje de la Materia Seca Remanente
16
2.1.1.3.1. Protenas
Alrededor del 50% del material celular (seco) puede ser material
protenico. Las protenas presentes son principalmente enzimas y
protenas estructurales. Las protenas se combinan con los cidos
nucleicos para formar los sitios para la sntesis de nuevas protenas. Las
protenas son sintetizadas en la levadura a partir de los aminocidos, la
formacin de los enlaces pptidos requieren energa, la cual es portada
por el ATP (Klimovitz, 2002). Algunos aminocidos de los requeridos
estn presentes en el mosto y son transportados dentro de la clula y
concentrados all por los aminocidos-permeasas; la eficiencia de este
transporte es diferente para cada aminocido, as que los aminocidos
disponibles dentro de la clula para la sntesis de protenas no estn
necesariamente en la misma proporcin que en el mosto. Si un
aminocido no esta disponible dentro de la clula, la levadura puede
sintetizarlo por s misma (Klimovitz, 2002).
2.1.1.3.2. cidos nucleicos
Constituyen alrededor del 18% del material celular nitrogenado. Dirigen la
sntesis de protenas, la secuencia de las cuatro bases en el cido
nucleico determina la secuencia de los aminocidos en la protena que se
est sitentizando. Proporcionan la informacin gentica necesaria para
sintetizar las protenas (Klimovitz, 2002).
2.1.1.3.3. Paredes celulares
Compuestas principalmente de polisacridos, entre ellos la manosa y la
glucosa que forma los mananos y beta glucanos. Una considerable
cantidad de protenas tambin est presente con algunos componentes
menores tales como fosfatos. Durante la fermentacin la composicin de
la pared celular cambia (Aguilar, 2003).
17
2.1.1.3.4. Membranas
Las membranas rodean el citoplasma y las mitocondrias de la clula de
levadura. Estn compuestas por mananos, protenas y materiales grasos,
estos ltimos son principalmente esteroles y glicridos. La membrana
citoplasmtica es semipermeable y regula el flujo de nutrientes hacia el
interior de la clula y el de subproducto hacia el exterior (Aguilar, 2003).
2.2. Crecimiento y multiplicacin celular
El crecimiento celular es el incremento ordenado de todos los
constituyentes de la clula viva, es el desarrollo individual, su estudio
implica conocer los modelos que explican la generacin y sntesis de
macromolculas, como se sintetiza la pared celular y que enzimas
participan, etc; adems de los aspectos bioqumicos interesa conocer
tambin como se transportan y ensamblan las macromolculas y de
donde se ensamblan (Klimovitz, 2002).
La multiplicacin celular, por otra parte, se refiere al estudio del aumento
del nmero de individuos en un poblacin; su estudio implica conocer la
cintica de la multiplicacin, velocidad con que se sucede, relaciones que
tiene con el medio ambiente, con los productos y con el consumo de
sustratos, cambios fisiolgicos y morfolgicos que se suceden (Klimovitz,
2002).
2.2.1. Curva de crecimiento microbiano
Cuando un microorganismo (bacteria, hongo o levadura) se le inocula en
un medio de cultivo apropiado para su desarrollo y se le dan las
condiciones ptimas para su crecimiento, este presenta una curva de
crecimiento tpica, donde fcilmente se podra graficar en funcin del
tiempo la concentracin celular (nmero de clulas por unidad de volumen
18
del cultivo) o concentracin de biomasa microbiana (gramos de clulas

microbianas en sustancia seca por unidad de volumen de cultivo)
(Ingledew, 1996).
2.2.1.1. Fase de adaptacin
Esta fase recibe diversos nombres, se consideran de adaptacin cuando
la poblacin inicial se localiza en un medio ambiente que les favorece
para
su desarrollo; en estas condiciones los individuos necesitan
adaptarse a ese medio ambiente generando abundante actividad

metablica pero sin multiplicarse; se producen enzimas e incremento en
los componentes estructurales especialmente los citoplasmticos, las
clulas adsorben gran cantidad de agua y hacia el final de esta fase
presentan un tamao mayor que el normal (se considera tamao normal
el que presentan durante la fase logartmica). En esta fase hay mayor
consumo de oxgeno por clula que en cualquier otra fase y se observa
adems incremento en la concentracin del ARN mientras que el ADN
permanece constante; el tiempo de duracin depende de las condiciones
del medio ambiente: prolongado si son desfavorables, corto si son
favorables e inclusive puede ser cero en el caso de que se traslade una
poblacin en fase logartmica a un medio similar si la dilucin no es alta.
En muchos casos la fase de adaptacin se prolonga demasiado, siendo
ms correcto denominarla de latencia; en estos casos las condiciones
para el desarrollo son muy desfavorables (pH, baja temperatura, falta de
nutrientes, etc) y el organismo solamente esta subsistiendo (Ingledew,
1996).
A la fase de adaptacin se le denomina tambin fase LAG. El cambio de
la fase LAG a la fase LOG se denomina de aceleracin positiva; la
reproduccin celular comienza y poco a poco se va aumentando la
velocidad de crecimiento (Adams el al, 1998).
19
2.2.1.2. Fase logartmica

En esta fase se representa tambin cambios citomorfolgicos; la clula se
vuelve fisiolgicamente joven y se encuentra en su estado ms normal; en
el caso de las bacterias todas las clulas reaccionan al Gram en forma
homognea y es en esta fase en donde se describe si son Gram Positivas
o Gram Negativas. La clula tiene composicin normal constante,
mientras que la composicin del medio vara. El metabolismo es bastante
activo y dirigido esencialmente a obtener energa y construir para
multiplicarse, por eso es esta fase se producen los metabolismos
primarios (Ingledew, 1996).
La pared celular es ms delgada que en otras fases y esto hace que la
poblacin sea ms sensible a los agentes fisicoqumicos. El tiempo de
duracin depende del organismo y de las condiciones del medio, si estas
son favorables el tiempo ser menor, puesto que al ocurrir metabolismo
se genera una mayor poblacin y el material nutriente se agotara ms
rpidamente (Klis et al, 2002).
A medida que se sucede el metabolismo van cambiando las condiciones
del medio, por ejemplo el pH; en estas condiciones se reduce la velocidad
del crecimiento, (fase de desaceleracin), esta disminucin tambin se ve
afectada por el agotamiento de los nutrientes y porque el metabolismo
produce sustancias txicas que se van acumulando, ejemplo, los
alcoholes, aldehdos, etc; las cuales tienen efecto antimicrobiano
(Ingledew, 1996).
A medida que transcurre el tiempo, las condiciones se tornan ms
desfavorables hasta que se llega a un estado de equilibrio en el cual se
produce ligera multiplicacin pero tambin muerte; este estado se
denomina fase estacionaria (Ingledew, 1996).
20
2.2.1.3. Fase estacionaria

La poblacin se equilibra; se presentan tambin cambios morfolgicos:
decrece el tamao de la clula, aumenta el espesor de la pared celular
como un mecanismo de resistencia para contrarrestar las condiciones
adversas del medio ambiente; hay variacin en la actividad metablica y
se sintetizan principalmente los metabolitos secundarios (Klis et al, 2002).
A la cantidad de clulas que alcanzan esta fase se le denomina
crecimiento total.
2.2.1.4. Fase de muerte
Disminuye el nmero de clulas viables; al aumentar la mortalidad
disminuye la concentracin en biomasa a la autlisis; la poblacin puede
llegar a un punto tal de auto esterilizacin en el que los individuos mueren
por las mismas condiciones que han generado (Klis et al, 2002).
Esta fase es muy importante desde el punto de vista bioqumico ya que en
ella se generan sustancias de mucho inters especialmente los
antibiticos (Ingledew, 1996).
2.3. Reproduccin de la levadura
La levadura se puede reproducir de dos formas diferentes: sexual y
asexual.
2.3.1. Reproduccin sexual (Meiosis):
En este proceso se realiza la fecundacin unindose dos clulas
sexuales.
Los dos ncleos de las clulas se unen formando uno, mezclndose el
material gentico de los dos padres.
21
De este tipo de reproduccin resultan cuatro clulas hijas, cada una con la
mitad de los cromosomas iniciales (Klimovitz, 2002).
2.3.2. Reproduccin asexual (Mitosis):
Se caracteriza porque sin fecundacin, un solo individuo puede producir
una clula exacta (Klimovitz, 2002).
Este tipo de reproduccin puede ocurrir de tres maneras:
2.3.2.1. Divisin celular: es una simple divisin de la clula formando un
nuevo individuo a partir del que se esta dividiendo (bacterias y algunos
tipos de levaduras) (Klimovitz, 2002).
2.3.2.2. Esporas vegetativas: la clula forma un cuerpo reproductor, que
una vez afuera y en condiciones del medio adecuadas produce un nuevo
organismo (bacterias y hongos) (Klimovitz, 2002).
2.3.2.3. Gemacin: es la ms importante en este caso porque es la
principal forma en que se reproduce la levadura cervecera (Klimovitz,
2002).
2.3.2.3.1. Reproduccin por Gemacin
La clula madre produce un pequeo brote en la pared celular, que
aumenta gradualmente y se estructura poco a poco como una nueva
clula de levadura (Klimovitz, 2002).
Cuando la clula hija ha alcanzado el desarrollo adecuado, se separa de
la clula madre por estrangulacin dejando una cicatriz en la pared
celular (Klimovitz, 2002).
22
Es posible llegar a tener cadenas celulares cuando una madre tiene

varias formaciones de nuevas clulas al mismo tiempo y a su vez las
clulas en crecimiento empiezan a ser madres de otras nuevas, sin
haber terminado de separarse (Klimovitz, 2002).
2.3.2. Factores que intervienen en la reproduccin de la levadura
2.3.2.1. Oxgeno: A mayor oxigeno, entonces mayor es la velocidad de
reproduccin
2.3.2.2. Temperatura: A mayor temperatura, mayor velocidad, teniendo
en cuenta que la temperatura ptima de desarrollo se encuentra entre
25C y 30C
2.3.2.3. Composicin del mosto (sustrato nutritivo): debe contener los
nutrientes requeridos para la formacin de la nueva clula
2.4. Floculacin de la levadura
La floculacin es una propiedad fsica, donde las clulas de la levadura se
adhieren unas con otras, formando grupos que rpidamente sedimentan
(levaduras de fondo) o alcanzan la superficie del liquido (levaduras de
superficie) (Klimovitz, 2002).
Una levadura que flocule bien facilita la separacin y recoleccin de la
levadura, disminuye tiempos de proceso y evita que pase excesiva
cantidad de levadura a maduracin (riesgos de autolisis) (Klimovitz,
2002).
Los mecanismos fsicos por medio de los cuales la levadura flocula son:
23
2.4.1.
Hidrofobosidad:
la
pared
celular
presenta
caractersticas
hidrfobas (repele el agua) lo que hace que se aglomeren. Esta propiedad

esta asociada a la edad de la clula (Klimovitz, 2002).
2.4.2. Potencial Zeta: Es una medida de la carga elctrica de la
superficie celular. La reduccin en esta carga favorece el acercamiento
celular (y por ende la floculacin). La carga superficial se afecta por el pH
del medio y la presencia de sustancias buffer como los fosfatos
(Klimovitz, 2002).
2.4.3. Interaccin protenas azcares: Existe una protena llamada
lectina que tiene la propiedad de reconocer (atraer) sacridos como la
manosa. Como la pared celular de la levadura es rica tanto en lectina
como en manosa se considera factible que estos compuestos se atraigan
entre si uniendo las clulas (Klimovitz, 2002).
2.4.4. Factores que influyen en la floculacin
Una levadura que carezca de los factores genticos de la floculacin no
podr flocular.
A menor temperatura la levadura entra en un estado de latencia que
activa el sistema de floculacin.
A menor pH se activa la floculacin por la neutralizacin de cargas en la
pared celular. Durante la fermentacin hay una cada de pH por lo que la
levadura tiende a flocular al final.
El calcio favorece la formacin de lectina en la pared celular y facilita la
unin lectina-manosa entre las clulas de la levadura.
24
La presencia de azcares (como la manosa) o de protenas tipo lectina en

el mosto puede bloquear los sitios de atraccin de la pared de la clula e
interrumpir la floculacin (Klimovitz, 2002).
2.5. Mutacin de la levadura
Se conoce como mutacin los cambios que ocurren en la informacin
gentica de la clula (DNA) inducido por factores externos y que pueden
generar variaciones en el metabolismo o comportamiento celular,
asociados a la fraccin de DNA alterado (Heggart, 1999).
En el proceso cervecero se pueden favorecer las mutaciones por malas
prcticas
de
manejo
almacenamiento,
de
tratamiento
la
levadura
cido,
(condiciones
contaminacin
externas
con
de
levaduras
diferentes, etc). Sin embargo nos es muy comn que se presenten

mutaciones a gran escala en el proceso tpico cervecero (Heggart, 1999).
2.5.1. Mutaciones ms comunes en el proceso cervecero
2.5.1.1. Floculacin: La levadura no flocula adecuadamente (separacin
difcil)
2.5.1.2. No asimilacin de la maltotriosa: genera fermentaciones
frenadas
2.5.1.3. Precipitacin temprana: la levadura se precipita al fondo del
tanque antes de terminar de fermentar
2.5.1.4. Respiracin deficiente: la levadura presenta deficiencias en su
respiracin generando malas fermentaciones y un perfil de subproductos
totalmente diferente. Se conoce como petite mutant (Klimovitz, 2002).
25
2.6. Levaduras salvajes
Se considera como levadura salvaje o silvestre cualquier espcimen

que no corresponda al utilizado en el proceso y que aparece como
contaminante del medio o equipos de trabajo (Heggart, 1999).
No todas las levaduras salvajes originan defectos en el producto, pero son
indeseables ya que pueden llegar a competir con la levadura del proceso.
Algunos tipos de levadura salvaje, pueden producir velos (turbidez), malos
olores, sabores anormales, floculacin deficiente y fermentacin diferente.
Las levaduras salvajes se pueden identificar por diferentes formas:
Forma de las clulas (redondas, ovales, alargadas, etc)
Tamao de la clula
Forma de agrupamiento de las clulas (aisladas, cadenas, etc).
Forma de reproduccin
Metabolismo fermentativo.
Algunas de las levaduras salvajes ms comunes en cervecera son:

Saccharomyces elipsoideus, S. turbidans, S. pastorianus, S. chevaliere.
Cndida utilis, C. tropicales y C. mycodema (Heggart, 1999).
2.7. Metabolismo de los carbohidratos
Las clulas de levadura necesitan una fuente de energa qumica libre
para crecer, debido a que muchos de los componentes de la clula
26
requieren de sta para ser sintetizados. Parte de esta energa es obtenida

por el rompimiento de los azcares simples, como la glucosa, pero esto
no ocurre en una forma simple y rpida; en cambio las clulas obtienen la
mayora de sus requerimientos inmediatos de energa del rompimiento del
ATP, en el cual los grupos fosfato pueden ser removidos por una enzima
de la levadura, liberando gran cantidad de energa, sta es entonces
utilizada por las enzimas para el crecimiento de la levadura. El ATP es
producido en la clula de la levadura por dos mecanismos de formacin
diferentes: La gluclisis y el ciclo de los cidos tricarboxlicos (ciclo de
Krebs), el segundo de los cuales es mucho ms complejo y eficiente que
el primero (Kandler, 1983).
La gluclisis puede ser conducida aerbica y anaerbicamente; cuando
es aerbica el producto final es el cido piruvco que entra al ciclo de
Krebs; cuando es anaerbica el producto final es el alcohol (Kandler,
1983).
2.7.1. Gluclisis (Embden Meyerhof Parnas)
La ruta glicoltica o tambin denominada Embden Meyerhof Parnas es la
utilizada por Saccharomyces cerevisiae y consiste en la degradacin de
los azcares presentes en un medio de cultivo para la obtencin de
energa y otros intermediarios necesarios para el crecimiento de la
levadura. Durante el proceso son producidos cantidades sustanciales de
etanol, CO2 y calor gracias a la accin de enzimas las cuales, al interior
de la clula, catalizan diversas reacciones que resultan en la produccin
de dos molculas de cido pirvico, estas a su vez por la accin de la
enzima piruvato descarboxilasa en condiciones anaerbicas, en dos
molculas de acetaldehdo y dos de CO2 y finalmente dos molculas de
etanol a partir del acetaldehdo por accin de la enzima alcohol
deshidrogenasa y cuya reaccin podra resumirse as:
27
Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ ------------ 2 Piruvato + 2ATP + 2NADH+

2H++ Calor
2 piruvatos + 2NADH + 2H+ ------------------ 2 Etanol + 2CO2 + 2NAD
Algo del cido pirvico producido y otros intermediarios pueden ser
usados por la levadura en variedad de rutas metablicas como sustrato
para la generacin de nuevas clulas, algo de glicerol es generado a
partir de uno de los intermediarios de la ruta: la dihidroxiacetona,
dependiendo de las condiciones, de manera que no puede desligarse el
metabolismo respiratorio del fermentativo pues esta
ruta metablica
opera tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis

generndose energa en forma de ATP y calor respectivamente. (Jacques
et al, 1999).
rd
Fuente: The alcohol textbook 3 edition page 61.
Figura 2. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilizacin de la glucosa.
28
Los hechos principales de la fermentacin son:

1. Activacin de la glucosa con dos molculas de ATP (reacciones 1 y 3).
2. Isomerizacin de la glucosa.
3. Rompimiento del azcar de 6 carbonos en 2 de 3 carbonos cada uno.
4. Oxidacin de los fragmentos con NAD coenzima. El NADH2 reducido es
liberado dentro de la clula. La oxidacin libera ATP es entonces
regenerado (etapas 6 y 9) removiendo fosfatos de los compuestos de 3
carbonos por el ADP.
5. El NADH2 reducido que se libera es oxidado, reduciendo el
acetaldehdo (formado por al cido pirvico) a etanol. El NAD libre es
liberado y puede ser aprovechado para la fermentacin de otro azcar.
Parte del NADH2 tambin puede ser usado para formar cido lctico.
El ATP producido puede ser usado como fuente de energa por la
levadura. Algunos de los compuestos intermedios tambin son usados
para el crecimiento de la levadura, tales como el cido pirvico pueden
ser liberados de la clula de levadura a la cerveza, nuevamente el cido
pirvico es un ejemplo. Cuando esto pasa, la levadura queda con un
exceso de NADH2 es usado para formar glicerol a partir de la
dihidroxiacetona fosfato (Harper, 2004).
Despus del alcohol y CO2, el principal subproducto de la fermentacin
por levadura es el glicerol.
El cido pirvico durante la fermentacin es usado, en la parte, para la
produccin de aminocidos y parte queda en la cerveza.
29
2.7.2. Ciclo de cidos tricarboxlicos (Ciclo de Krebs)

La fermentacin va gluclisis es muy poco eficiente en la liberacin de
energa y formacin de ATP, ya que alrededor del 95% de las caloras
utilizables de los azcares del mosto permanece en el alcohol formado
durante la fermentacin. En presencia de oxgeno, mucha ms energa
aprovechable en la formacin de ATP puede ser obtenida de la glucosa
(Harper, 2004).
Despus de la gluclisis el cido pirvico formado pasa a travs de una
serie de reacciones conocidas como el ciclo del cido ctrico.
Las reacciones son mostradas en la grfica, en donde se puede observar
que forman un ciclo. Al comienzo el cido oxalactico se combina con el
cido actico en la forma de acetil-coenzima A. Cuando el ciclo se
completa, el resultado neto es la oxidacin del cido actico a CO2 y
agua; el cido oxalactico es liberado para comenzar otra vez el ciclo con
otra molcula de cido actico obtenida del cido pirvico. El hidrgeno
removido en las fracciones intermedias del ciclo en la forma de coenzimas
reductoras puede ser oxidado en presencia de oxgeno por una serie de
reacciones que generan ms ATP (Harper, 2004).
Transferencia de hidrgeno o electrones del hidrgeno a travs del
sistema citocromo.
El resultado final es producir alrededor de 38 ATP de una molcula de
glucosa. La fermentacin sin oxgeno produce slo dos ATP a partir de
una molcula de glucosa.
30
Fuente: Harper: Bioqumica ilustrada, 2004.

Figura 3. Ciclo del cido Tricarboxlico (Krebs)
Algunos compuestos intermedios del ciclo TCA son usados por la

levadura para su crecimiento. Por ejemplo, acetil-CoA y a - cetoglucano.
Pequeas cantidades de algunos cidos del ciclo son liberados por la
clula de la levadura y contribuyen a la acidez de la cerveza. Por ejemplo
al cido succnico. Los cidos unidos a la coenzima A son muy inestables
y algunas veces reaccionan para formar steres, los cuales tienen una
gran influencia en el aroma de la cerveza (Harper, 2004).
Las reacciones de la gluclisis ocurren dentro de la clula, en el
citoplasma. Las TCA tambin ocurren dentro de ella, pero slo en una
parte muy especializada en la clula, llamada mitocondria. La mitocondria
puede ser formada solamente a partir de otra mitocondria algunas veces
31
durante la gemacin de la levadura, una clula hija puede formarse sin

mitocondrias. Cuando esto ocurre la clula hija y toda su descendencia no
podrn nunca formar mitocondrias por lo tanto, crecen muy lentamente en
los medios de cultivo de laboratorio, porque no pueden usar el oxigeno del
aire para crecer ms eficientemente; forman slo pequeas colonias en el
agar; por esta razn estas levaduras son llamadas petite verdant o
respiratorias deficientes (RD). (Heggart, 1999).
Las levaduras RD producen fermentaciones pobres, con poca atenuacin
y tienden a liberar gran cantidad de diacetilo en la cerveza. Por esta razn
las levaduras con cierto porcentaje de RD deben ser descartadas
(Klimovitz, 2002).
2.8. Bacterias lcticas como contaminantes
El grupo de bacterias lcticas est constituido por cocos y bacilos que
comparten propiedades fisiolgicas y bioqumicas y cuyo metabolismo
generador de energa es fermentativo, los sustratos fermentables son
azcares que incluyen variedad de monosacridos, disacridos y
polialcoholes y cuyo producto final principal es el cido lctico y en
algunos casos el nico dependiendo de la ruta metablica que utilicen
para convertir los carbohidratos, de ah que las bacterias lcticas pueden
dividirse en dos grupos segn los productos resultantes de la
fermentacin de glucosa (Jacques et al, 1999).
2.8.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo
El grupo de bacterias lcticas denominado homofermentativo produce
virtualmente un nico producto de fermentacin: el cido lctico, mientras
el grupo heterofermentativo produce etanol y CO2 adems de cido
lctico. Dicha diferencia est determinada por la presencia o ausencia de
la enzima aldolasa, una de las enzimas claves en la gliclisis; los
32
heterofermentadores, carentes de aldolasa, no pueden descomponer el

difosfato hexosa a fosfato triosa, en lugar de ello, oxidan la glucosa 6fosfato a 6-fosfogluconato y entonces lo decarboxilan a pentosa fosfato, la
cual se transforma en triosa fosfato y acetilfosfato por medio de la enzima
fosfocetolasa (Jacques et al, 1999).
Esta triosa fosfato se convierte finalmente en cido lctico con la
produccin neta de 1 ATP, mientras el acetilfosfato acepta electrones del
NADH generado durante la produccin de pentosa fosfato y as se
convierte en etanol sin produccin de ATP (Jacques et al, 1999).
Debido a esto, los heterofermentadores producen slo un mol de ATP a
partir de glucosa a diferencia de los homofermentadores que producen
dos moles de ATP igualmente a partir de glucosa (Jacques et al, 1999).
Fuente: modify of carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria, 1983.

Figura 4. Fermentacin de glucosa por bacterias cido lcticas.
33
Estas rutas para el metabolismo de carbohidratos llevadas a cabo por las

bacterias acido lcticas pueden igualmente dividir este grupo en tres
clases: homofermentativos obligados, heterfermentativos facultativos y
heterofermentativos obligados, las especies de homofermentativos
obligados el nico producto final a partir de hexosas es el cido lctico y
la va glicoltica es la nica utilizada, las especies de este grupo producen
la enzima aldolasa pero no producen la fosfocetolasa, lo cual las inhabilita
para fermentar pentosas y gluconato (Jacques et al, 1999).
Las especies de heterofermentativos facultativos poseen las dos enzimas
aldolasa y fosfocetolasa inducible, pues logran fermentar pentosas y
gluconato slo bajo ciertas condiciones pues la ruta de a fosfocetolasa es
inhibida en presencia de glucosa. (Jacques et al, 1999) y finalmente, las
especies lcticas heterofermentativas obligadas generan una mezcla de
productos finales bajo condiciones normales usando cualquiera de las
vas metablicas; estos productos finales incluyen cido lctico, cido
actico, etanol y CO2 as como pequeas cantidades de cidos frmico y
succnico, estos organismos excepto algunas cepas especficas, pueden
fermentar pentosas y gluconato (Jacques et al, 1999).
2.8.2.
Requerimientos
nutricionales
de
bacterias
lcticas
subproductos
Las necesidades nutricionales de las bacterias lcticas son muy similares
a las de las levaduras convirtindose as en sus principales antagonistas
por nutrientes esenciales y factores de crecimiento que algunas veces
estn presentes en cantidades limitadas en los sustratos de fermentacin,
as como que son capaces de metabolizar las mismas fuentes de carbono
para realizar su tipo de fermentacin (Jacques et al, 1999).
34
2.8.2.1. Nitrgeno: varios aminocidos y vitaminas son necesarias para

el
crecimiento
de
cido
lcticas,
algunas
homofermentativas
heterofermentativas poseen enzimas proteasas y pueden degradar las

protenas en formas asimilables de nitrgeno, sin embargo esta
caracterstica no es general y la mayora de ellas toman el nitrgeno
necesario del medio de cultivo en el que se hallen, de manera que en este
sentido son fuertemente competitivas frente a las levaduras en sistemas
de fermentacin (Bely et al, 2003).
2.8.2.2. Oxgeno: las bacterias lcticas se han descrito como anaerobias,
sin embargo se ha demostrado que prefieren ambientes microaeroflicos y
pueden sobrevivir en ambientes donde el oxgeno est completamente
ausente, manejando una tasa de crecimiento baja (Oliveira, 1999).
Este tipo bacteriano carece de las enzimas catalasa y superoxido
dismutasa, las cuales son usadas por bacterias aerbicas para convertir
compuestos txicos: el perxido de hidrgeno y el superxido
respectivamente, ambos formados durante sus procesos respiratorios
(Jacques et al, 1999).
Saccharomyces cerevisiae produce catalasa y crece adecuadamente bajo
condiciones aerbicas, con el oxigeno como requerimiento principal en los
primeros estados de la fermentacin por lo que se constituye en otra
ventaja competitiva de las bacterias lcticas bajo condiciones anaerobias
en la fermentacin de la levadura. (Jacques et al, 1999).
2.8.2.3. Subproductos que pueden afectar la calidad del producto
La produccin de algunos compuestos por bacterias contaminantes
contribuye a la disminucin de la calidad del producto final de la
fermentacin as como el desarrollo mismo del proceso pues el
microorganismo fermentador puede ver afectada su fisiologa por la
35
presencia de sustancias extraas y/o en altas cantidades (Jacques et al,

1999).
Los cidos lctico y actico son productos que afectan notablemente las
caractersticas organolpticas del producto (etanol), pues se producen a
partir de l, as como la acrolena y el diacetil, una cetona que puede
producirse durante la fermentacin cuando el piruvato es convertido a
cido lctico y algunas especies de Pediococcus y Lactobacillus son los
responsables de dicha produccin, no obstante, las levaduras producen
diacetil durante los primeros estados de la fermentacin pero este es
removido por la accin de varias enzimas y por la presencia de algunos
aminocidos en el medio (Jacques et al, 1999).
2.9. Factores que afectan el rendimiento de alcohol
Un gran nmero de factores pueden reducir el rendimiento de alcohol y
disminuir la productividad de la planta, estos factores pueden ser
reducidos o eliminados para minimizar las perdidas de sustrato y
maximizar las ganancias en trminos de producto (Oliveira, 1999).
2.9.1. Cambios de pH durante la fermentacin

El pH de la cerveza vara entre 3.9 4.5; en parte se debe a las
diferencias en los mostos, pero tambin a las diferencias en la
fermentacin. Por ejemplo, un mosto dado produce una cerveza con pH
4.4 cuando se fermenta con levadura de produccin normal y puede
producir cervezas con pH 3.9 cuando se fermenta con levadura recin
salida del propagador (Klimovitz, 2002). El pH cae rpidamente en las
primeras etapas de la fermentacin, lo que significa que se presenta
incremento en la concentracin de iones H+ o acidez.
36
2.9.1.2. Absorcin de bases por la levadura

La remocin de bases o lcalis del mosto puede hacer que est se vuelva
ms cido. Por muchos aos, se asumi que la levadura usa los iones
fosfato bsicos H2PO42 como fuente de fosfatos para el crecimiento, y
que la perdida de sta base causa el descenso del pH durante la
fermentacin (Klimovitz, 2002).
Sin embargo se ha demostrado que la levadura usa slo el ion H2SO4- el
cual es ligeramente bsico. Por lo tanto, el uso de los fosfatos produce
solamente alrededor del 10% del aumento de la acidez durante la
fermentacin (Klimovitz, 2002).
Los aminocidos bsicos son usados por la levadura y la prdida de stos
produce un 30% del cambio de acidez.
2.9.2. Produccin de cidos

El CO2 producido durante la fermentacin es dbilmente cido. Esto
produce un 10% del cambio de acidez.
Los cidos orgnicos, especialmente el succnico, lctico, pirvico y
mlico producidos por la levadura, producen otro porcentaje del cambio
de acidez durante la fermentacin. La levadura puede excretar algunos
iones H+ directamente a la cerveza pero esto no ha sido demostrado an
(Klimovitz, 2002).
Ya que la malta es la fuente de compuestos bsicos como los iones
fosfato y los aminocidos, el contenido de malta tambin influye en el pH
de la cerveza. A mayor cantidad de malta, mayor cantidad de compuestos
37
bsicos presentes al comienzo de la fermentacin y mayor el pH de la

cerveza (Klimovitz, 2002).
2.9.3. Floculacin de la levadura
Al finalizar la fermentacin, las clulas de levadura forman agrupaciones
probablemente hasta de 100 clulas; la levadura S. cerevisiae atrapa
burbujas de CO2 y flota.
El que la levadura por s misma, se remueva del mosto fermentado
despus de que ha cumplido a cabalidad su funcin metablica, es una
de las principales caractersticas deseables en la levadura cervecera; a
esta caracterstica se le designa con el nombre de floculacin (Klimovitz,
2002).
Existen muchas definiciones de floculacin de la levadura pero una de las
ms aceptadas dice: Floculacin es el fenmeno por medio del cual las
clulas de levadura se adhieren en grumos y sedimentan rpidamente del
medio en el cual se encuentran suspendidas (Klimovitz, 2002).
Las caractersticas de floculacin de un cultivo puro de levadura en
particular, es una de las propiedades ms importantes que se tiene en
cuenta al seleccionar una cepa de lavadura para propsitos cerveceros
(Klimovitz, 2002).
Los factores que influyen en la floculacin de la levadura son:
1. Caractersticas genticas de la levadura.
2. La presencia de iones Ca++ en solucin; la cantidad requerida vara de
acuerdo con la cepa. Algunos investigadores han encontrado que otros
iones divalentes tales como Mg y Mn pueden, aparentemente ejercer la
accin del calcio.
3. La temperatura.
4. Cantidad de glucgeno almacenado en la clula.
38
5. El contenido de fsforo mananos, los cuales se han encontrado en la

pared exterior de la clula de levadura al final de la fermentacin, pero
durante la fermentacin no. Una teora dice que existe atraccin
electrosttica entre las cargas negativas del fosfato y las positivas del
calcio, ocasionando la agrupacin de las clulas (Hornsey, 2003)
2.10. Proceso de elaboracin de la cerveza
La cerveza, al igual que otras bebidas similares producidas con cereales,
es sometida a fermentacin pero no a destilacin. Las materias primas
que intervienen en el proceso son agua, lpulo y cebada, suplida a veces
por el maz, el arroz o el azcar (Hough, 1990).
2.10.1. Molienda
Tanto la malta como los cereales sin maltear (trigo, avena, centeno,
maz, arroz), tienen que pasar por el molino que rompe el grano, dando
lugar a la harina y otras partes fijas (Hornsey, 2003).
La molienda consiste en destruir el grano, respetando la cscara o

envoltura y provocando la pulverizacin de la harina. La malta es
comprimida entre dos cilindros pero evitando destruir la cscara lo
menos posible, pues sta servir de lecho filtrante en la operacin de
filtracin del mosto; a su vez el interior del grano en una harina lo ms
fina posible. Estas dos condiciones, cscara entera y harina fina no
podrn respetarse si el grano no est seco (excepcin molienda
hmeda) y muy bien desagregado, una tercera exigencia es un buen
calibrado de la malta. La molienda debe ser tambin regulada segn el
cocimiento posterior (Hornsey, 2003).
39
2.10.2. Proceso en Pailas

En esta parte del proceso se extraen de la malta y eventualmente de los
granos crudos la mayor cantidad de extracto y de la mejor calidad posible
en funcin al tipo de cerveza que se busca fabricar. La extraccin se logra
principalmente por hidrlisis enzimtica, solamente un 10% de la
extraccin es debida a una simple disolucin qumica. Las amilasas
desdoblan el almidn en dextrinas y maltosa, principalmente las enzimas
proteolticas desdoblan las protenas complejas en materias nitrogenadas
solubles, la fitasa desdobla la fitina en inositol y fosfato, etc. Estas
transformaciones enzimticas han sido ya empezadas durante el
malteado a un ritmo menos intenso del que suceder en el cocimiento;
donde debido a la accin de las diferentes temperaturas y la gran
cantidad de agua las reacciones suceden muchas veces en forma
explosiva (Hough, 1990).
Cuantitativamente el desdoblamiento del almidn en azcares y dextrinas
es el ms importante. Las principales reacciones que ocurren durante el
cocimiento por accin de las amilasas son formacin de dextrinas,
formacin de maltosa y en menor proporcin formacin de glucosa
(Hough, 1990).
2.10.3. Filtracin del Mosto
Una vez disueltas las materias solubles por el cocimiento es necesario
separar el mosto de la parte insoluble llamada orujo o afrecho. La
operacin se realiza en dos fases: primero el flujo del mosto y luego la
operacin de lavado del extracto que contiene el afrecho (Verstrepen,
2003). El mosto y el agua de lavado deben ser claros pues si se aporta
durante la operacin demasiadas sustancias mal disueltas, la clarificacin
de la cerveza ser demasiado difcil. La calidad de la cerveza puede ser
tambin alterada por un lavado de afrecho con agua alcalina pues los
polifenoles y sustancias amargas de la cscara de la malta se disuelven
40
muy fcilmente en agua alcalina an ms si se tiene en cuenta que el

lavado se hace en agua a una temperatura mxima de 75 C; sta no
puede exceder ese lmite, pues se corre el riesgo de disolver almidn
presente an en el afrecho, lo que conllevara a problemas de turbiedad y
fermentacin posteriores (Verstrepen, 2003).
2.10.4. Ebullicin del Mosto
La
finalidad
de
la
ebullicin
es
estabilizar
enzimtica
microbiolgicamente el mosto, buscar la coagulacin de las protenas.

La destruccin de las enzimas es realizada para evitar que sigan
desdoblando a lo largo de la fermentacin, las amilasas podran seguir
desdoblando las dextrinas y stas se transformaran enteramente en
alcohol (Hornsey, 2003). La esterilizacin del mosto es obtenida por
simple ebullicin, pues su reaccin es ligeramente cida. La coagulacin
de las materias protenicas debe hacerse lo mejor posible, pues si
subsisten en el mosto ocasionaran problemas en la fermentacin,
provocando fcilmente turbiedad en la cerveza embotellada. La
esterilizacin y la destruccin de las enzimas es fcil de realizar, un
cuarto de hora de ebullicin es generalmente suficiente (Hornsey, 2003).
La coagulacin de protenas es mucho ms difcil, se realiza por etapas,

la primera es la desnaturalizacin que consiste en la ruptura de puentes
de hidrgeno en la molcula de protena, pasando del estado hidratado
al deshidratado, mantenindose en suspensin nicamente por su carga
elctrica; luego de la desnaturalizacin se produce la coagulacin
propiamente dicha por agrupacin de micelios deshidratados; es aqu
donde el pH juega un papel muy importante, pues la coagulacin ser
eficiente si se realiza en el punto isoelctrico; como existen muchas
protenas en el mosto se ha optado por el pH 5.3 como el ms
conveniente (Hornsey, 2003). Durante la ebullicin, la coloracin
tambin aumenta sobre todo por la formacin de melanoidinas, tambin
41
por oxidacin de taninos, estas dos reacciones son favorecidas por el pH

elevado. Por ltimo a lo largo de la ebullicin se forman productos
reductores que contribuyen a la calidad y estabilidad de cerveza
(Hornsey, 2003).
El lupulado del mosto se realiza tradicionalmente durante esta operacin,

es decir, en la paila de ebullicin. El amargor es obtenido por
isomerizacin de los cidos y del lpulo; esta isomerizacin es incompleta
debido principalmente al pH del mosto, el pH ptimo de isomerizacin es
de 9. Existen muchas lupulonas y humulonas en el lpulo; cada uno de
estos compuestos donar su ismero respectivo; el conjunto es conocido
como isohumulonas pues son esencialmente quienes donan el amargor
deseado (Verstrepen, 2003).
2.10.5. Enfriamiento del Mosto
El mosto obtenido por sacarificacin de la malta o de los adjuntos y por
protelisis de las protenas de la malta, es llevado a ebullicin durante
hora y media con el lpulo para otorgarle el amargo, a lo largo de esta
ebullicin la esterilizacin completa es obtenida gracias al pH que oscila
alrededor de 5.3 (Hough, 1990). Los precipitados proteicos son
eliminados por sedimentacin, filtracin o centrifugacin; el mosto es
enseguida enfriado a la temperatura de inoculacin de la levadura, esta
temperatura depende del tipo de levadura empleada y del tipo de cerveza
a fabricar entre 6 a 20C (Hough, 1990). Durante el enfriamiento un nuevo
precipitado de polifenoles-protenas se forma, por un lado por enlaces de
hidrgeno y tambin por la falta de solubilidad de las prolaminas. La
presencia de este nuevo precipitado juega un rol esencial sobre la
formacin de H2S por la levadura (Verstrepen, 2003).
El mosto enfriado, en principio estril, debe ser aireado antes del inicio de
la fermentacin, de no ser aireado la tasa de mortalidad de la levadura
aumentara a tal punto que sta no podra ser reutilizada; la oxigenacin
42
del mosto antes del inicio de la fermentacin permite a la levadura

sintetizar cidos grasos insaturados (olecos, linolecos, y linolnicos), en
ausencia de estos cidos grasos la pared celular esta sujeta a
alteraciones
lo
cual
lo
hace
ms
permeable
los
steres
correspondientes a los alcoholes superiores que ella misma forma

(Klimovitz, 2002).
La composicin del mosto es muy variable en funcin al tipo de cerveza
fabricada, su densidad puede variar entre 2 a 20 grados Plato (P), es
decir que puede contener de 2 a 20g de soluto por 100g de lquido; a su
vez puede ser rico o no en aminocidos y pptidos en funcin de la
importancia de la protelisis y de la proporcin de adjuntos utilizados
(Klimovitz, 2002). La relacin maltosa/dextrinas es igualmente variable de
acuerdo al mtodo de cocimiento escogido. De manera general se puede
decir que el mosto es un medio incompleto, normalmente carente de
aminocidos y cidos grasos insaturados pues es imposible obtener un
crecimiento rpido y completo de levadura; cosa que no sucede si se
tratara de un medio sinttico a base de extractos de levadura (Klimovitz,
2002).
2.10.6. Fermentacin
Hasta esta etapa se ha preparado un lquido complejo y se ha purificado
cuidadosamente hasta el momento de agregar la levadura cervecera para
producir su fermentacin (Hornsey, 2003).
Inicialmente, se agrega al mosto fro, levadura en una cantidad calculada,
para que quede en el mosto de 8 a 10 millones de clulas por cc. Para la
fermentacin de mosto concentrado, se usa un milln de clulas por cc
por cada grado plato del mosto (Hornsey, 2003). La cantidad de levadura
previamente determinada se diluye en el mosto y luego se inyecta a la
lnea de mosto fro durante el enfriamiento. La cantidad total de levadura
43
que se inyecta se calcula teniendo el cuenta el volumen de mosto que va

contener la tina de fermentacin (Hornsey, 2003).
La temperatura inicial de fermentacin puede variar entre 6 a 10 C. Una
vez que se inicia la fermentacin se aprecian como cambios notorios, el
descenso
del
extracto,
la
produccin
de
gas
carbnico
el
desprendimiento de calor; durante la fermentacin se controla el

descenso de la densidad regulando la temperatura con atemperadores
(serpentines o chaquetas), por los cuales circula agua fra o salmuera o
agua glicolada a temperaturas que oscilan entre 1 a 2 C para el caso del
agua y de -5 a -10 C para el caso de la salmuera o el agua glicolada
(Xiao, 2004).
Para recolectar el gas carbnico que se desprende de la fermentacin,
comnmente el tanque est conectado por la parte superior con dos
tuberas; una que va a la intemperie y la otra que va a la planta de
purificacin de gas carbnico. En la planta de gas carbnico, ste es
purificado y licuado con el fin de inyectarlo posteriormente a la cerveza
(Hornsey, 2003).
Cuando se alcanza el extracto lmite o sea hasta donde se le va a dejar
fermentar se abre el fro para conseguir enfriar la cerveza y para que la
levadura se alimente (Xiao, 2004). Se consigue enfriar la cerveza hasta 5
C y se suspende el envi de gas carbnico a la planta, luego se bombea
la cerveza a los tanques de maduracin y se recupera la levadura
(Hornsey, 2003).
A la cantidad de levadura obtenida en cada fermentacin se le denomina
cosecha de levadura, lo normal es obtener 4 veces la cantidad de
levadura agregada (Hornsey, 2003).
Al final de esta cuando los azucares han sido transformados hasta alcohol
y gas carbnico se tendr la cerveza. Despus de la fermentacin la
44
cerveza es separada de la levadura, la cual puede ser utilizada para

fermentar ms mosto, posteriormente.
La fermentacin juega un rol esencial en la calidad de la cerveza, en
particular gracias a los productos secundarios como los alcoholes
superiores y steres; es tambin la etapa de la fabricacin ms difcil de
controlar (Xiao, 2004). La levadura que es reutilizada de una fermentacin
a otra no tiene un metabolismo estable; sta se va degenerando.
2.10.6.1. Principales transformaciones que tiene lugar
durante la
fermentacin
2.10.6.1.2. Consumo de oxgeno
Durante la fermentacin, se distinguen dos procesos muy diferentes en el
metabolismo de la levadura. El primero de ellos es el proceso de
crecimiento o multiplicacin celular, el cual es caracterizado por un
incremento en el nmero de clulas. El segundo es el proceso del
extracto, es decir, consumo del extracto y formacin de alcohol (Klimovitz,
2002).
Despus de que la clula se ha adaptado a la presin osmtica del mosto
y los nutrientes han permeado hacia el interior de ella, comienza el
proceso de crecimiento. La multiplicacin requiere energa, est es
proporcionada por los azcares que son metabolizados por una larga
cadena de reacciones enzimticas. Primero que todo, la energa
producida por estas reacciones es usada para el principal propsito de la
vida; la multiplicacin (Klimovitz, 2002).
Para obtener una buena multiplicacin celular, el mosto debe ser aireado.
Es bien sabido que el oxgeno juega un papel muy importante en el
crecimiento celular o mejor, en la formacin de la membrana celular. La
membrana celular est compuesta fundamentalmente por protenas,
carbohidratos y materiales grasos, de los cuales los ms importantes son
45
los esteroles y los glicridos; los glicridos son compuestos en los que el
glicerol est unido a cidos grasos, algunos de ellos insaturados
(Klimovitz, 2002).
La sntesis de los esteroles y de los cidos grasos insaturados son dos de
las pocas reacciones en el metabolismo de la levadura, que requieren
oxgeno molecular (Klimovitz, 2002).
La energa producida a partir de los carbohidratos es acumulada en forma
de ATP; ste puede ser utilizado en la formacin de acetil-CoA (Coenzima
A) la cual reacciona de muchas formas diferentes. Durante la etapa de
crecimiento la clula de levadura utiliza este compuesto activo para la
sntesis de esteroles y de cidos grasos insaturados, consumiendo el
oxgeno; consecuentemente, la cantidad de oxgeno proporcionado al
mosto con la aireacin es decisiva para la multiplicacin celular. Cuando
el oxgeno ha sido consumido, cesa la sntesis de esteroles y cidos
grasos y por lo tanto la acetil-CoA puede ser utilizada en otras reacciones
(Klimovitz, 2002).
Muchos investigadores han asociado con el metabolismo de los lpidos en
la levadura, la formacin durante la fermentacin, de los steres
encontrados en la cerveza, los cuales constituyen un grupo importante
entre los compuestos voltiles de la cerveza debido a su fuerte y
penetrante aroma a frutas (Heggart, 1999).
Los steres son formados por la combinacin de un cido orgnico y un
alcohol con la prdida de agua.
Los steres encontrados en cerveza son normalmente steres del cido
actico. La formacin de steres requiere energa, no es una reaccin
espontnea. El acetato activo o acetil-CoA, que es formado en la levadura
por el cido pirvico, es un compuesto de alta energa (Verstrepen, 2003).
46
El cido actico unido a la coenzima es inestable y puede fcilmente

separarse a cido actico libre, que en presencia del alcohol puede
formar el correspondiente acetato, utilizando la energa del acetil-CoA
(Harper, 2004).
Otros cidos como el pirvico, que tambin son formados durante la
fermentacin, no forman steres muy fcilmente debido a que no se
encuentran unidos a coenzimas en enlaces de alta energa (Harper,
2004).
El cido succnico se encuentra unido a la coenzima A y los cidos son
elaborados por la levadura a partir de sus enlaces con la coenzima A, as
que los steres de estos cidos se encuentran en la cerveza pero a muy
bajas concentraciones. La mayor parte del aroma de la cerveza se debe a
acetatos (Verstrepen, 2003).
La acetilCoenzima A participa en una variedad de reacciones
metablicas, entre las cuales se destacan su oxidacin cclica por la va
del TCA y su papel en la formacin de las unidades fundamentales para la
sntesis de los cidos grasos (Harper, 2004).
La produccin de steres est influenciado por cualquier factor que afecte
tanto la biosntesis como el consumo de acetil Coenzima A.
2.10.7. Maduracin
Es la etapa siguiente a la fermentacin y comprende todo el tiempo que
dure la cerveza en los tanques a baja temperatura antes de ser filtrada.
Comnmente se divide en dos etapas que son reposo y acabado, entre el
reposo y el acabado puede haber una prefiltracin, pre-enfriamiento y precarbonatacin (Klimovitz, 2002).
47
La maduracin se puede hacer:

2.10.7.1. Dos etapas
Reposo y acabado y durante el reposo hacer una segunda fermentacin,
en el paso de reposo a acabado la temperatura es de 2 a 3 C y en
acabado se puede enfriar a -1 C (Klimovitz, 2002).
2.10.7.2. Fermentar hasta el extracto lmite
Este sistema es americano y en el paso de fermentacin a reposo se
efecta el enfriamiento y entre reposo y acabado, pre-carbonatacin,
prefiltracin y pre-enfriamiento y durante la filtracin final se hace tambin
enfriamiento (Klimovitz, 2002).
Los objetivos de la maduracin consisten en acumular o almacenar
cerveza, dejar sedimentar en forma natural la materia amorfa y la
levadura que an tiene la cerveza, refinacin del sabor por eliminacin de
las sustancias voltiles que causan el sabor verde, separacin por
precipitacin de los compuestos que se forman al ser enfriada la cerveza,
es muy importante considerar que la cerveza se enturbia al ser enfriada
despus de haber sido filtrada, otro de los objetivos es completar la
atenuacin lmite que no ha sido alcanzada en la fermentacin y tambin
se busca carbonatar la cerveza (Klimovitz, 2002).
Al recibir la cerveza en un tanque de maduracin es necesario
contrapresionar para evitar la salida de gas y la formacin de espuma. Es
un factor que puede contribuir a la deficiencia de espuma. Durante la
maduracin la cerveza debe mantenerse bajo presin de 0.3 a 0.5
atmsferas para evitar la oxidacin y facilitar la clarificacin (la levadura
con presin tiende a sedimentarse y ms con fro) y se evita el exceso de
48
purga. Al recibo la contrapresin puede ser con aire o con gas carbnico.
Despus se deja bajar la presin con el objeto de efectuar purga y
eliminar aire en la parte vaca del tanque. Luego se cierra y se sostiene
algo de presin porque de lo contrario, se dara una eliminacin de
muchas sustancias voltiles y se afecta el aroma de la cerveza. El tanque
no se llena completamente (Klimovitz, 2002).
Si la maduracin es muy larga o prolongada el sabor se suaviza
demasiado, pierde cuerpo, pierde amargo y queda muy simple.
Con respecto a la temperatura de cerveza en maduracin se especifica
entre -2 y 0 C si se hace segunda maduracin se pasa a la etapa de
reposo de 2 a 3C y cuando se pasa al acabado se enfra a -2C. Si es
mayor de 0C puede presentarse autlisis de la levadura que pasa a
maduracin afectando el sabor, se presentan coagulaciones de las
sustancias que precipitan en fro (proteosas o peptonas - taninos) y por
tanto se obtienen cervezas qumicamente inestables, tambin por esta
temperatura alta no se obtiene una buena clarificacin y por lo tanto
cervezas muy turbias al final de la maduracin que causan problemas en
la filtracin. Al subir la temperatura se puede aumentar el efecto de la
oxidacin (Heggart, 1999).
En referencia al tiempo de la maduracin cuando se hace en una sola
etapa se deja de 2 a 3 semanas. Cuando es en dos etapas el tiempo de la
primera etapa dura comnmente 2 semanas y el tiempo de acabado o
segunda etapa dura aproximadamente una semana. La produccin debe
ser programada de tal manera que la cerveza tenga una maduracin
uniforme (Klimovitz, 2002).
Si el tiempo es corto menos de 15 das es posible que se obtenga un mal
sabor, no precipiten las sustancias que causan estabilidad qumica
deficiente, no se clarifique bien la cerveza originando problemas de
filtracin (Klimovitz, 2002).
49
Al final de la maduracin como se va a llevar a cabo una filtracin y por lo

tanto una eliminacin de la levadura se tendr que proteger la cerveza
agregndole antioxidantes para que se combinen con el oxgeno y evitar
que se combine con la cerveza pudindose emplear cido ascrbico o
bisulfito de sodio o potasio y para mejorar la clarificacin de la cerveza se
emplean clarificantes que pueden ser gelatina, viruta y una mezcla de
bentonita con cido tnico (Heggart, 1999). La clarificacin normal de la
cerveza en maduracin es afectada por maltas muy frescas sin el debido
tiempo de reposo, temperaturas altas en maduracin, alto extracto
fermentable residual, poco tiempo de maduracin, falta de presin positiva
en los tanques de maduracin y tambin por maltas mal modificadas o
con un alto contenido de beta glucanos (Heggart, 1999).
2.10.8. Filtracin
Despus de la maduracin y antes del embotellamiento, la cerveza pasa
de nuevo por una filtracin con tierra diatomcea que elimina los ltimos
restos que puedan quedar de la fermentacin y tambin los restos de
nitrgeno que durante la maduracin han formado una especie de
mucosa, lo que podra provocar ms adelante que la cerveza saliera
turbia (Hornsey, 2003).
2.10.9. Envasado
Antes de llevar la cerveza a la mquina de llenado se inyecta CO2 en los

tanques hasta conseguir la saturacin deseada, para que la cerveza
salga de su recipiente con una buena capa de espuma (Hornsey, 2003).
Para alargar el tiempo de conservacin de una cerveza, sin que cambie

de aspecto, se esteriliza por medio de la pasteurizacin despus del
envasado (las botellas pasan por un tnel con agua a 70C), o con una
50
pasteurizacin flash antes de envasar (durante el recorrido del tanque a

la cadena de envasado la cerveza se calienta hasta 65 C) (Hornsey,
2003).
51
3. JUSTIFICACIN
La calidad de la cerveza en el sentido ms amplio, es la suma de todas
aquellas caractersticas que le permiten a un producto llenar los requisitos
del mercado y atraer a los consumidores para quienes est dirigido; la
calidad tambin es usada para denotar la ausencia de defectos y,
mientras que el trmino se aplica tanto al empaque como al proceso de
elaboracin del producto, slo este ltimo aspecto ser evaluado en este
proyecto.
Las cerveceras generan y recolectan grandes cantidades de informacin
con respecto a caractersticas especficas de la produccin de la cerveza
tanto en producto en proceso como en el producto terminado, la cual
requiere ser analizada de una manera confiable para que se constituya en
una herramienta bsica para el control de su proceso.
Considerando esto, se hace importante la necesidad de conocer el
comportamiento microbiolgico de la cerveza, en cada una de sus etapas
de produccin, para que al obtener los datos, dicha informacin
contribuya a mejorar la calidad, consistencia del producto y confiabilidad
del proceso que se lleva a cabo, para establecer finalmente que los
anlisis realizados son precisos y repetibles, que estn utilizando los
controles proceso adecuados, para que los cerveceros puedan centrar su
atencin en la administracin y mejora continua del proceso.
52
4. OBJETIVOS DEL PROYECTO
4.1. Objetivo general

Evaluar la calidad microbiolgica del producto en proceso en una planta
productora de bebidas alcohlicas.
4.2. Objetivos especficos
Determinar el nmero de clulas de levadura en los tanques de

fermentacin y maduracin durante el proceso de elaboracin del
producto mediante el recuento en cmara de Neubauer
Determinar la presencia de levaduras tipo Saccharomyces y tipo no

Saccharomyces en los procesos de fermentacin y maduracin.
Evaluar la presencia de mutantes de levaduras del proceso

(Respiracin Deficiente (RD) y Variants)
Determinar la presencia de bacterias contaminantes del proceso:

coliformes y cido lcticas.
53
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. Tipo de estudio
Esta investigacin se realiz de manera experimental y se valor la
calidad microbiolgica del producto en proceso, para esto se realiz la
toma de muestras en cada una de las etapas de produccin de la cerveza
Figura 5. Se determin que aunque existen puntos del proceso donde se
pueda presentar contaminacin por factores externos a los de la
produccin propiamente dicha, estos no afectan la calidad del producto
terminado.
Figura 5. Proceso Cervecero
54
El manejo de las muestras se realiz, utilizando material estril (botellas

biolgicas y Frascos Shoot) y su almacenamiento previo a la siembra se
llev a cabo bajo condiciones de refrigeracin para evitar cualquier foco
de contaminacin
ajeno al proceso de las muestras que fueron
evaluadas.
Figura 6. Material para toma de muestras
55
Los resultados obtenidos durante todo el proceso de investigacin, fueron

consignados en el formato previamente establecido por la Empresa
(Anexo 1).
5.2. Anlisis Microbiolgicos del proceso
MUESTRAS
Chase Water
PCA
(Agua de Empuje)
1ml
Mosto
1ml
ANLISIS MICROBIOLGICOS
MAC
RAKA
MYGP
CONKEY
WLN
WLD
RAY
SDM LISINA TTC FRECUENCIA
0.2ml
Diario
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml v
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
Diario
0.2ml
0.2ml v
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
Diario
0.2ml
0.2ml v
0.2ml
0.2ml
0.2ml
0.2ml
C/Propagac.
0.2ml
20ml
250ml
Diario
0.2ml
20ml
250ml
Semanal
Diario
Fermentaciones
24 96 H
Maduraciones
4 6 das
Propagacin en
cada etapa
1ml
BBT
Sifn
Agua Desairada
Tanques y Torres
1ml
100ml
Semanal
Acueducto
1ml
100ml
Semanal
Tierra Diatomcea
0.2ml
0.2ml
Tabla 2. Anlisis Microbiolgicos
56
Semanal
5.3. pH de medios de cultivo, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de

Incubacin
Medio
WLN
pH
5.5 - 5.8
T
Incubacin
Tiempo
Incubacin
25C
5 das
Comentario
Leer a los 3 das y si esta
negativo incubar 2 das ms
Mtodo de
Incubacin
Microorganismo
Levaduras/hongos
Aerobio
/bacterias

WLD
5.5 - 5.8
Raka Ray 5.4 0.2
25C
5 das
Aerobio
Bacterias
25C
7 das
--------------------
Anaerobio
Mic.cido lcticos

Lisina
4.8 0.2 *
25C
7 das
Lev Salvaje no
Aerobio
Saccharomyces
Aerobio
Levadura salvaje
Aerobio
Bacterias

SDM
-----
25C
7 das

Leer a las 48 Horas y si esta
PCA
7.0 0.2
30C
4 das
Bacterias
PCA
7.0 0.2
44C
48 Horas
- - - - - - - - - -- - - - - - - -
Aerobio
Termotolerantes
7.1 0.2
30C
48 Horas
-------------------
Aerobio
Coliformes
Agar Mac
Conkey
Agar Mac
Coliformes
Conkey**
7.1 0.2
44C
48 Horas
------------------
Aerobio
Termotolerantes
MYGP
5.0 - 6.0
25C
4 das
------------------
Aerobio
RD (petite mutans)
WLN
5.5 - 5.8
25C
5 das
-------------------
Aerobio
Variants (verdants)
Tabla 3. pH, Tiempos, Temperaturas y Mtodos de Incubacin

* pH despus de adicionar el cido lctico
** El manual de Oxoid recomienda no incubar ms de 48 Horas el agar
Mac Conkey ya que puede dar resultados confusos. (Sept. 27 de 2006)
5.4. Tcnicas Empleadas
5.4.1. Siembra en Placa
Para el aislamiento e identificacin de los diferentes microorganismos que
pueden crecer en los medios de cultivo mencionados anteriormente, se
57
utiliza la tcnica de siembra en superficie, donde se inocula 0,2 ml de la

muestra a evaluar y se lleva a cabo la homogenizacin de sta utilizando
la esptula de Digralski.
Para llevar a cabo la siembra en el medio Plate count agar, se utiliza la
siembra en profundidad, donde se inocula 1 ml de la muestra y
posteriormente se adiciona el medio de cultivo lquido a una temperatura
adecuada para evitar la muerte de los microorganismos o inhibicin de los
microorganismos, la homogenizacin se realiza de manera manual
haciendo suaves movimientos giratorios de la caja de petri.
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin adecuado para cada medio
de cultivo, se realiza el recuento de unidades formadoras de colonias
(UFC); Estos recuentos dan la pauta de la cantidad de microorganismos
presentes en una muestra, como tambin el grado de contaminacin o
concentracin de microorganismos, en productos industriales (Escobar,
2002).
5.4.2. Filtracin por membrana
La filtracin por membrana se ha convertido en una parte importante de la
tecnologa de la separacin en los ltimos decenios. Su importancia
radica en el hecho de que trabaja sin la adicin de productos qumicos y
conducciones de proceso fciles y bien dispuestas. La membrana
funciona como una pared de separacin selectiva. Ciertas sustancias
pueden atravesar la membrana, mientras que otras quedan atrapadas en
ella. Es un proceso de bajo coste energtico. La mayor parte de la
energa requerida es la necesaria para bombear los lquidos a travs de la
membrana.
Al llevar a cabo el recuento de las UFC slo deben ser
contadas las colonias que se han formado en la membrana y dicho

nmero se divide por el volumen filtrado.
58
5.4.3. Recuento en cmara de Neubauer

5.4.3.1. Levadura en Proceso de Fermentacin y Maduracin
1. Mezclar vigorosamente la muestra a analizar.
2. Tomar 1 ml de muestra utilizando una pipeta graduada y verter en tubo
falcon de 10 ml.
3. Adicionar 9 ml de cido actico al 10% (nicamente para las muestras
de fermentacin)
4. Se mezcla nuevamente la muestra utilizando el vortex.
5. Montar la muestra en la cmara y realizar el recuento en el cuadrante
del centro
6. El recuento de clulas obtenidas se multiplica por los 5 cuadrantes
donde se llev a cabo el conteo, por el factor de la cmara 104 y por el
factor de dilucin utilizado 101.
59
6. RESULTADOS
Los datos utilizados para la construccin de las tablas que aparecen en

este captulo, salvo que se indique lo contrario en el texto, son los datos
promedio de la totalidad de los resultados obtenidos durante el tiempo en
el cual se evalu la calidad microbiolgica de cada una de las etapas de
produccin.
Parmetro
N
Muestras
analizadas
Acueducto
(Enero)
Acueducto
(Febrero)
Acueducto
(Marzo)
Acueducto
(Abril)
Acueducto
(Mayo)
PCA
% DE
UFC/ml
Mac
Conkey
UFC/100cm3
100%
100%
100%
100%
100%
Tabla 4. Agua Acueducto de Cali
Parmetro
Enjuague
tanque 101
Enjuague
tanque 102
Enjuague
tanque 103
Enjuague
tanque 104
Enjuague
tanque 105
Enjuague
tanque 106
Enjuague
tanque 107
Enjuague
tanque 108
Enjuague
N
Muestras
analizadas
PCA
WLN
WLD
UFC/ml
UFC/ml
UFC/ml
20
100%
20
100%
20
(1)
20
0
40
0
80%
100%
95%
% DE
20
(1)
20
0
0
5
0
100%
20
100%
20
100%
20
100%
60
tanque 109
Enjuague
tanque 110
Enjuague
tanque 401
Enjuague
tanque 402
Enjuague
tanque 403
Enjuague
tanque 404
Enjuague
tanque 408
Enjuague
tanque 409
Enjuague
tanque 410
Enjuague
tanque 411
Enjuague
tanque 412
Enjuague
tanque 1
Enjuague
tanque 2
Enjuague
tanque 3
Enjuague
tanque 4
Enjuague
tanque 5
20
(1)
20
90%
0
10
0
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
20
100%
Tabla 5. Enjuagues de Tanques [fermentacin (101 110), Maduracin

(401 412) y Filtracin (1 - 5)]
Figura 7. Enjuague Tanque 103
61
Parmetro
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
Agua de
empuje
Mosto
N
Cocimiento
N
Muestras
analizadas
PCA
UFC/ml
WLN
UFC/ml
WLD
UFC/ml
Mac
Conkey
UFC/ml
% DE
1-5
3
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
8 - 12
9
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
16 - 20
19
5
1
0
0
0
0
0
NA
NA
100%
100%
24 - 28
25
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
32 - 36
34
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
40 44
42
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
48 52
50
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
56 60
60
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
64 - 68
66
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
72 76
73
5
1
0
0
0
0
0
NA
0
NA
100%
100%
80 - 84
100%
Tabla 6. Agua de Empuje y Mosto
62
Parmetro
Propagacin A
Hls
80
Propagacin A
Mac
Conkey
UFC/ml
Raka
Medio
Ray
Lisina
WLN
WLD
SDM
UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml
% DE
100%
120
100%
Propagacin B
80
100%
Propagacin B
120
100%
Propagacin C
80
100%
Propagacin C
120
100%
Propagacin D
80
100%
Propagacin D
120
100%
Propagacin E
80
100%
Propagacin E
120
100%
Tabla 7. Propagacin de Levadura
Parmetro
Fermentacin
24 Horas
N
Muestras
Analizadas
Mac
Conkey
UFC/ml
Raka
Medio
Ray
Lisina
WLN
WLD
SDM
UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml
80
100%
80
100%
80
100%
80
100%
80
100%
80
100%
80
% DE
Fermentacin
48 Horas
Fermentacin
72 Horas
Fermentacin
96 Horas
Maduracin
4 Das
Maduracin
5 Das
Maduracin
6 Das
Tabla 8. Fermentaciones y Maduraciones
63
100%
Figura 8. Medios de Cultivo Utilizados para el anlisis de muestras

(Propagacin, Fermentaciones y Maduraciones)
64
Clase de Levadura
/Generacin
A
A
A
A
A
A1
A1
A1
A1
A2
A2
A2
A3
A3
A3
A3
B
B
B
B
B1
B1
B1
B1
B2
B2
B2
B2
B3
B3
B3
C
C
C
C
C1
C1
C1
C1
C2
C2
C2
C2
C3
Tanque N
102
107
104
103
108
106
109
105
101
110
107
104
103
102
108
106
109
105
101
110
107
104
103
102
108
106
109
105
101
110
107
102
108
106
109
105
107
101
110
102
103
108
106
105
65
% Petite mutants
0%
0%
0%
0%
0,71%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,75%
0%
0%
0%
0,65%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,69%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,59%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
C3
C3
C4
C4
C4
D
D
D
D
D
D1
D1
D1
D1
D2
D2
D2
D2
D2
D3
D3
D3
D3
D3
E
E
E
E
E
E1
E1
E1
E1
E2
E2
E2
E2
E3
E3
E3
E3
103
107
101
110
102
103
104
109
106
105
107
110
101
108
102
103
104
109
106
107
105
103
101
110
102
103
104
107
102
101
103
107
108
106
101
109
102
103
104
110
106
Tabla 9. Respiracin Deficiente
66
0%
0%
0%
0%
0,81%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0,59%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
N Muestras
analizadas
Parmetro
Agua desairada
Tanque 1
Agua desairada
Tanque 2
Agua desairada
Entrada Torre
Agua desairada Salida
Torre
Agua desireada Salida
Torre
PCA
Mac Conkey
UFC/ml
UFC/100cm3
22
100%
22
100%
22
100%
22
100%
22
100%
Tabla 10. Agua Desairada
Parmetro
Tierra
Diatomcea
(Enero)
Tierra
Diatomcea
(Enero)
Tierra
Diatomcea
(Febrero)
Tierra
Diatomcea
(Febrero)
Tierra
Diatomcea
(Marzo)
Tierra
Diatomcea
(Marzo)
Tierra
Diatomcea
(Abril)
Tierra
Diatomcea
(Abril)
Tierra
Diatomcea
(Mayo)
Tierra
Diatomcea
(Mayo)
N
Muestras
analizadas
WLN
WLD
UFC/ml
UFC/ml
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
% DE
Tabla 11. Tierra Diatomcea
67
% DE
Parmetro
BBT
Tanque 1
N
Muestras
Analizadas
Mac
Raka
Conkey WLN
Ray
UFC/ml UFC/ml UFC/ml
PCA
UFC/ml
80
9.8
100%
80
9.8
100%
80
9.4
100%
80
100%
80
9.2
100%
% DE
BBT
Tanque 2
BBT
Tanque 3
BBT
Tanque 4
BBT
Tanque 5
Tabla 12. Tanques Anlisis BBT`s
Parmetro
Sifn Poker
N
Mac
Raka
Muestras Conkey WLN
Ray
Analizadas UFC/ml UFC/ml UFC/ml
Sifn Costea
30
9.8
% DE
100%
30
9.4
100%
Tabla 13. Sifn (Cerveza sin pasterizar)
Recuentos Celulares Fermentaciones UFC/ml

Promedio
Tanque
Enero
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
1,2E+06
1,7E+06
1,4E+06
1,4E+06
1,3E+06
1,4E+06
1,9E+06
1,3E+06
1,7E+06
2,3E+06
Febrero
1,3E+06
2,2E+06
1,1E+06
1,7E+06
1,6E+06
1,2E+06
1,2E+06
1,8E+06
2,0E+06
1,4E+06
Marzo
Abril
Mayo
2,0E+06
1,8E+06
1,3E+06
2,1E+06
1,5E+06
2,3E+06
1,6E+06
1,3E+06
1,4E+06
1,9E+06
1,8E+06
1,5E+06
2,3E+06
2,6E+06
1,8E+06
2,1E+06
1,5E+06
1,8E+06
2,1E+06
1,7E+06
1,7E+06
1,1E+06
1,2E+06
1,9E+06
2,1E+06
1,1E+06
1,8E+06
1,5E+06
2,2E+06
1,3E+06
Tabla 14. Conteos Celulares Fermentaciones
68
Recuentos Celulares Maduraciones UFC/ml

Promedio
Tanque
Enero
Febrero Marzo
Abril
401
1,2E+04 1,4E+04 1,3E+04 1,9E+04
402
1,7E+04 1,4E+04 1,4E+04 1,3E+04
403
2,0E+04 1,3E+04 1,5E+04 1,6E+04
404
1,8E+04 2,1E+04 2,3E+04 1,3E+04
408
1,3E+04 1,1E+04 1,6E+04 1,2E+04
409
2,2E+04 1,7E+04 1,2E+04 1,8E+04
410
1,7E+04 1,2E+04 2,1E+04 1,8E+04
411
1,1E+04 1,9E+04 1,1E+04 1,5E+04
412
1,8E+04 1,5E+04 2,3E+04 2,1E+04
Tabla 15. Conteos Celulares Maduraciones
69
Mayo
1,7E+04
2,3E+04
1,4E+04
1,9E+04
2,0E+04
1,4E+04
2,2E+04
1,3E+04
1,8E+04
7. DISCUSIN DE RESULTADOS
Tradicionalmente la calidad se ha definido como el nivel de conformidad

de un producto a su diseo o especificaciones. Esta calidad es la que se
puede generar y controlar dentro de la fbrica, logrando de esta manera
acreditar una marca cuya personalidad se caracteriza por una serie de
parmetros, unos de orden legal, otros tpicos del proceso tales como
controles fsico-qumicos, organolpticos y microbiolgicos y unos ms
frutos del diseo de imagen del producto, por esto, para cada una de las
cervezas que elabora, est establecida una norma o parmetro que define
exactamente la calidad que se debe alcanzar; sin embargo, aunque
pueden existir variaciones en las materias primas, mano de obra y el
proceso propiamente dicho, se deben evitar al mximo diferencias entre
los distintos lotes durante el proceso de fabricacin, esto con el fin de
obtener un producto homogneo, lo que implica una estandarizacin del
proceso de produccin; por esto se desarroll un sistema de control en
cada una de las fases del proceso para limitar la presencia de
contaminantes, que terminan afectando finalmente a los consumidores;
para asegurar esto, se hace imprescindible impedir, entre otros, la
presencia de patgenos y de contaminantes indeseables. Ambos
aspectos, en especial el primero, se consiguen mediante la pasterizacin
y otros sistemas de eliminacin (Garca, 2007). Pero para certificar la
inocuidad de la produccin, se requieren distintos procesos de verificacin
y es precisamente en este punto donde se evalu la calidad
microbiolgica del producto identificando algunas de las desviaciones que
se pueden presentar y de esta manera con los resultados obtenidos
brindar un apoyo durante el proceso de elaboracin, para que una vez
finalizada la produccin se asegure que el producto cuando sale al
mercado cumple con las especificaciones establecidas.
Un plan de control incluye la peridica toma de muestras a lo largo de
todo el proceso para su anlisis directo al microscopio y a travs de
70
medios de cultivo adecuados para obtener crecimiento de colonias y

realizar una verificacin ms especializada de las mismas, caractersticas
que no son posibles de identificar en una muestra en fresco (Hornsey,
2003). El control microbiolgico se ocupa del estudio y determinacin de
los microorganismos diferentes a la levadura cervecera cultivada, que
pueden contaminar el producto influyendo en la calidad del producto
terminado (Hornsey, 2003).
Para garantizar que el proceso inicia libre de microorganismos
contaminantes, se evalu la calidad del agua potable suministrada por el
acueducto municipal de Cali, sta se tuvo en cuenta debido a que algunas
de las tuberas de la cervecera se encuentran deterioradas y podran
convertirse en una fuente de contaminacin importante puesto que
pueden aportar una carga microbiana que podra terminar en una
alteracin de todos los procesos llevados a cabo en la cervecera; se
realizaron anlisis microbiolgicos para identificacin de mesfilos y
coliformes los cuales usualmente indican la presencia de otros
contaminantes microbiolgicos. El lmite mximo de coliformes totales es
de 0 UFC/100 cm3 y ninguna muestra debe contener E. coli o coliformes
fecales en 100 cm3 de de agua (Decreto 475), durante todo el transcurso
de esta evaluacin se obtuvo un recuento de cero unidades formadoras
de colonias (UFC/100cm3); estos resultados garantizaban, que el agua
utilizada en la cervecera en los diferentes procesos como enjuagues de
tanques o como agua de dilucin, se mantenan libre de contaminacin
microbiolgica.
Partiendo de este hecho, se evaluaron los enjuagues realizados a los
diferentes tanques que se encuentran en la planta (fermentacin,
maduracin y filtracin) y que son utilizados para almacenamiento de
materia prima y producto, puesto que durante el proceso de elaboracin
de cerveza se producen precipitados, tanto de sales inorgnicas como de
productos orgnicos y adherencias de los mismos a las superficies de los
depsitos, las tuberas y otras piezas del equipo con las que entra en
71
contacto el mosto y la cerveza , el no mantener una adecuada rutina de

limpieza le estara agregando esta contaminacin al producto en proceso
y por consiguiente contaminara tuberas, mangueras y dems (Klimovitz
et al, 2002). Estos precipitados estn constituidos fundamentalmente por
sales de calcio, magnesio, protena desnaturalizada y levadura que en
caso de no ser eliminados durante el enjuague realizado, estaran
proporcionando
nutrientes
proteccin
los
microorganismos
contaminantes (Klimovitz et al, 2002).

La rutina de limpieza, supone primero un lavado con agua, que va
seguido por rociado a alta velocidad de un fluido germicida como Soda
custica a concentraciones del 3%, a una temperatura de 80^85C, se
realiza un segundo enjuague y se adiciona posteriormente cido ntrico a
una concentracin que oscila entre 2 2.5%, despus se somete a un
ltimo enjuague utilizando una presin aproximada de 80 150 con una
ducha (Khatcher) de agua potable fra, finalmente se realiza un ltimo
enjuague utilizando dixido de cloro, el cual supera varias de las
limitaciones asociadas con residuales libres y asociados del cloro
(Klimovitz et al, 2002). El dixido de cloro es un oxidante ms estable y
fuerte que el cloro y ms efectivo, no slo para desinfectar ms
rpidamente a niveles residuales ms bajos que el cloro, sino para oxidar
muchos materiales y remover olores. No forma trihalometanos o
clorofenoles, y no reacciona con amonaco. Con el dixido de cloro,
dosificaciones ms bajas son requeridas para mantener un residual de
desinfeccin de 0.3mg/L (Hornsey, 2003), por lo tanto ste no solo
esteriliza, si no que a su vez facilita la limpieza.
Es en este punto donde de una manera asptica y con la botella estril
que contiene una cantidad adecuada de tiosulfato de sodio a una
concentracin previamente establecida, el operario tomaba la muestra y la
llevaba al laboratorio, donde era almacenada en la nevera a una
temperatura promedio de 4C, posteriormente, al analizar los resultados
72
obtenidos se encontr que del total de muestras analizadas 3 tuvieron

crecimiento, al hacer el anlisis de causas se encontr que debido a fallas
operacionales la concentracin utilizada en los sanitizantes empleados
para llevar a cabo el aseo se haba realizado de manera incorrecta,
causando este tipo de contaminacin, sin embargo, en las dems
muestras no se evidenci crecimiento de ningn microorganismo tpico o
ajeno del proceso cervecero en los diferentes medios de cultivo utilizados
WLN y WLD, indicando de esta manera que el inicio de los procesos
llevados a cabo en dichos tanques se podan llevar a cabo de manera
adecuada y que si durante una etapa posterior del proceso se llegar a
encontrar algn tipo de contaminacin, sta fuera una variable para
descartar.
El proceso de produccin inicia con el cocimiento del mosto, cuya
composicin determina las propiedades de la cerveza como producto
terminado. Antes de iniciar con el enfriamiento del mosto se pasa por el
tanque agua caliente o agua de empuje, esta operacin se realiza debido
a que el punto letal de algunos microorganismos vara con las especies y
al hacerla pasar a una temperatura promedio de 70C se garantiza la
eliminacin de la mayora de los microorganismos que no pueden
sobrevivir bajo esas condiciones de calor (Hough, 1990); para esta
muestra
fueron
evaluadas
la
presencia
de
mesfilos,
bacterias
termorresistentes y cido lcticas, descartando cualquier posibilidad de

contaminacin y garantizando que el enfriamiento del mosto se iniciara de
una manera adecuada. El mosto tiene que contener la cantidad correcta
de azcares fermentables y nutrientes para la levadura y precursores de
sabor, ste es microbiolgicamente inestable ya que constituye un medio
ideal para la mayora de las bacterias Gram negativas y algunas Gram
positivas tolerantes a los antispticos del lpulo, adems contiene
carbohidratos simples, amino nitrgeno, minerales y micro nutrientes
como vitaminas, por esto nunca se almacena a temperaturas por debajo
de 55 0C por breve que sea el tiempo antes de aadirle el inculo de
cultivo (Hough, 1992). Bacterias como Lactobacillus delbrueckii, y otras
73
formadoras de endosporas, como son termfilas, pueden contaminar el

mosto, multiplicarse rpidamente a temperaturas entre 50 - 650C y
provocar
acidez.
Otras
bacterias,
que
conforman
la
familia
Enterobacteriaceae, al desarrollarse en el mosto producen derivados

sulfurados
fenlicos que afectan el sabor final de la cerveza
(Verstrepen, 2003).
El mejor momento para hacer el muestreo es usualmente en el tanque de
mosto caliente, puesto que es ah donde se mezcla el cocimiento
completo y se determina su volumen (Klimovitz et al, 2002). El mosto
terminado fue analizado para asegurarse que la cerveza tendr el extracto
deseado, el color, el sabor, la espuma y la calidad microbiolgica
requerida para dar inicio al proceso de fermentacin. Al mosto se le
evalu la presencia de mesfilos, coliformes y bacterias cido lcticas,
obteniendo 0 UFC/ml en todos los cocimientos evaluados, indicando de
esta manera que la filtracin, tiempos y temperaturas que se tienen ya
estandarizados,
son
adecuados
para
evitar
la
proliferacin
de
microorganismos ajenos al proceso; sin embargo si se hubiera presentado

algn tipo de contaminacin microbiana, sta podra ser suprimida
durante las etapas siguientes, fermentacin y maduracin (Klimovitz et al,
2002).
La inoculacin de la levadura se lleva a cabo inmediatamente despus del
enfriamiento
del
mosto,
ya
que
ste
puede
contaminarse
microbiolgicamente con facilidad (Hornsey, 2003). Es importante notar

que para poder producir una cosecha de levadura en un estado ptimo
fisiolgico para inoculacin, deben tomarse una serie de pasos
incrementales (Aguilar, 2003). Estos incrementos reintroducen a las
clulas en crecimiento activo a una nueva fuente de nutrientes, de manera
que el cultivo nunca se detenga a consecuencia de una privacin de
nutrientes (Hornsey, 2003). Igualmente, el mantener una concentracin
mnima inicial de por lo menos 106 clulas/ml por P, tiende a reducir el
74
riesgo de una contaminacin microbiana por varias razones; en primer

lugar porque no se queda un exceso de nutrientes sin asimilar por mucho
tiempo y en segundo lugar porque el metabolismo de las levaduras tiende
a bajar rpidamente el pH del mosto a niveles subptimos para muchos
microorganismos que daan el mosto, tales como coliformes y otras
bacterias entricas mencionadas anteriormente (Hornsey, 2003).
Durante los procedimientos de incremento, deben llevarse a cabo pruebas
para asegurarse que la levadura que est siendo propagada este libre de
contaminacin especialmente con bacterias y levaduras salvajes (Heggart
et al, 1999), por esto se evalu la presencia de levaduras tipo
Saccharomyces y tipo no Saccharomyces en medios de cultivo
adecuados
para
evidenciar
el
crecimiento
de
este
tipo
de
microorganismos como lo son el SDM y el medio lisina. La mayora de las

levaduras salvajes o tipo no Saccharomyces pueden amenazar el xito de
una operacin cervecera, ya que pueden competir de manera efectiva
(aerbica, anaerbicamente, o ambos) por los nutrientes del mosto
utilizados por las levaduras cerveceras y producir una variedad de
sabores y aromas indeseables similares a los producidos por bacterias
contaminantes (Verstrepen et al, 2003). Algunas levaduras salvajes
excretan amilasas y/o proteasas, y como resultado pueden reducir los
componentes deseados en el producto final tales como las dextrinas o
protenas, dejando la cerveza opaca, caracterstica indeseada. El
crecimiento de nmero significativo de clulas de levaduras silvestres
tiene el potencial de alterar las caractersticas de floculacin del cultivo de
produccin, lo que a su vez puede resultar en una fermentacin
suspendida (Aguilar, 2005); al observar los resultados que se obtuvieron
se ve claramente que este tipo de microorganismos no afect ninguna de
las propagaciones que se llevaron a cabo durante este tiempo.
As mismo, se evalu para las fermentaciones, la presencia de bacterias
contaminantes del proceso tales como coliformes y cido lcticas,
75
encontrando en todos los casos un crecimiento nulo, y para garantizar el

xito de la fermentacin se analiz tambin la presencia de mutantes de
levaduras del proceso; aspecto muy importante a tener en cuenta puesto
que al ser definida la mutacin de la levadura como el cambio estable,
heredable, en el DNA, que tpicamente resulta en la generacin de una
forma nueva, alternada de gen, y un nuevo fenotipo (caracterstica
observable), podra afectar de manera considerable el proceso de
fermentacin (Philiph, 1985).
Las mutaciones son usualmente detectadas mediante la prdida o
alteracin observable de una funcin particular, tal como la asimilacin de
una fuente de nitrgeno o de carbono. De las muchas mutaciones que
pueden ocurrir y tienen un efecto significativo en la fermentacin, slo tres
son usualmente observadas. Estas son: prdida de la habilidad de
fermentar maltotriosa, prdida de floculencia y deficiencia respiratoria; las
dos primeras son a menudo el resultado de un dao al DNA cromosomal
encontrado en el ncleo de la clula, mientras que la tercera es a menudo
el resultado de un dao gentico al DNA localizado en la mitocondria
celular (Ha et al, 2002). Los cultivos que pierden la habilidad de fermentar
maltriosa, atenan al mosto incompletamente, ya que la maltriosa es un
carbohidrato abundante en el mosto; por otro lado los cultivos que pierden
su habilidad de floculacin tienden a sobreatenuar al mosto, y, a menos
de que sean removidos mediante centrifugacin, pueden resultar en
sabores indeseados de autlisis (Ha et al, 2002). Mutantes cromosomales
espontneos, o variantes, ocurren en promedio en aproximadamente una
en un milln de clulas (Adams, 1998). Como resultado, ests clulas no
producen rpidamente diferencias notables a una fermentacin. El
resultado para estos anlisis fue negativo lo que indic que la
propagacin comenzaba de una manera adecuada, dando paso a la
fermentacin,
la
cual
iniciaba
su
contaminantes.
76
proceso
sin
ningn
tipo
de
La fermentacin es uno de los procesos ms importantes y complejos en

las operaciones de una cervecera. Frecuentemente, el maestro cervecero
enfrenta los retos de cambios en el aroma y sabor a consecuencia de un
inexplicable comportamiento y desempeo de la levadura durante la
fermentacin (Verstrepen, 2003).
Tradicionalmente la fermentacin cervecera es descrita como el proceso
en donde los carbohidratos fermentables son transformados en etanol y
numerosos subproductos y por medio de las interacciones con otros
constituyentes del mosto, muchos de los compuestos de sabor en la
cerveza se desarrollan (Oliveira, 1999).
A pesar de su complejidad, la fermentacin es dependiente en gran
medida de tres parmetros bsicos: la composicin del mosto (nutrientes
para la levadura); la levadura; y las condiciones de proceso (como tiempo,
temperatura, volumen, presin, forma y tamao del tanque, agitacin y
corrientes en el mosto en fermentacin (Kelsall, 1995).
Durante la fermentacin debe hacerse cumplir un estricto control de
calidad para asegurar que sta procede normalmente y que la levadura
est sana, libre de contaminacin y que acta como se espera tanto en
suspensin como en floculacin (Kelsall, 1995).
Los contaminantes tpicos en un proceso de fermentacin de este tipo
crecen en los primeros estados de la fermentacin hasta que los
descensos de pH y la elevacin en la concentracin de etanol le resultan
adversos (Heggart at al, 1999).
Pediococcos y Lactobacilos, pueden proliferar en esta etapa, ya que al ser
los Lactobacilos generalmente insensibles a los amargos del lpulo,
sobreviven en un 5% de etanol, y son capaces de crecer en un rango de
temperatura de 5 - 50C (Funahashi, 1998). Los Lactobacilos son
77
heterofermentativos, y producen cido lctico, cido actico, dixido de

carbono, etanol y glicerol como productos finales (Funahashi, 1998).
Algunos hasta pueden producir diacetilo; mientras que los Pediococcos
son los nicos cocos que se conocen pueden crecer en cerveza; crecen
bien en ambientes anaerbicos o microaeroflicos a temperaturas que van
de 9 25C (Jacques et al, 1999). Al igual que los Lactobacilos, los
Pediococos crecen bajo las condiciones cidas encontradas durante la
fermentacin.
Los
Pediococos
son
fermentadores
homolcticos,
produciendo cido lctico como producto final. Tambin pueden producir

suficiente diacetilo para alterar seriamente el sabor y el aroma de la
cerveza (Jacques et al, 1999). Pediococos tambin pueden causar
viscosidad en la cerveza a consecuencia de la produccin de cpsulas de
polisacridos formados por azcares, protenas y cidos nucleicos
(Jacques et al, 1999).
Las muestras tomadas en los diferentes puntos crticos de control a lo
largo de este proceso, se inocularon en un medio que inhibe
selectivamente el crecimiento de las levaduras de cerveza, pero permiten
el crecimiento de contaminantes (WLD), el cual est suplementado con el
antibitico ciclohexamida, las levaduras de cerveza tradicionales son
sensibles al ciclohexamida, mientras que muchos de los microorganismos
de cervecera son resistentes y por ende forman colonias en un medio
diferencial. Otro medio de cultivo utilizado fue Raka Ray, al cual se le
aade Tween 80 (mono-oleato de polioxietileno sorbitan), puesto que este
compuesto es un conocido estimulante para el crecimiento de bacterias
lcticas tales como Lactobacilos y Pediococos (Klimovitz et al, 2002), sin
embargo y pese a que se utilizaron medios altamente selectivos, dichos
microorganismos no fueron identificados en todas las muestra analizadas,
garantizando una ptima calidad del proceso fermentativo que se llev a
cabo.
78
Las levaduras cerveceras son anaerobias facultativas, eso es, pueden

cambiar de fermentacin a respiracin y viceversa. Tambin son de los
pocos selectos organismos eucariticos que pueden sobrevivir (mientras
haya una fuente de carbono fermentable disponible) la prdida total o
grandes alteraciones del DNA mitocondrial asociado con en primer lugar
componentes de transporte de electrones requeridos para la respiracin, y
en segundo lugar con la sntesis de protena mitocondrial, y crecer
indefinidamente como un mutante de deficiencia respiratoria (Heggart,
1999).
Esto puede significar una prdida muy significativa de informacin
gentica para una clula de levadura, ya que el genoma mitocondrial
cuenta con aproximadamente el 15% (rango 5 25%) del DNA total de
una levadura. Esta forma de mutacin es irreversible, y significa que el
nmero de estos mutantes puede incrementarse rpidamente si ocurre
una alta tasa de mutacin y si estos mutantes sobreviven y se reproducen
(Ha et al, 2002). Combinando la naturaleza irreversible de la mutacin y el
hecho que la observacin de las colonias con respiracin deficiente son
menores en tamao que las colonias silvestres cuando son vistas de
manera macroscpica en placas de medio slido MYGP, tales levaduras
son llamadas como positivas - petit o variants, porque los mutantes
estables de deficiencia respiratoria pueden ser aislados. Bajo condiciones
aerbicas, los mutantes de deficiencia respiratoria crecen ms lentamente
que las clulas de tipo silvestre porque no pueden respirar (Klimovitz et al,
2002). Tambin son incapaces de metabolizar fuentes de carbono no
fermentables, tales como lactato, glicerol y etanol. Bajo condiciones
anaerbicas, los mutantes de deficiencia respiratoria pueden crecer a la
misma tasa lenta como las clulas de tipo silvestre, ya que ambas usan
sendas fermentativas (Ha et al, 2002). Efectivamente, los mutantes de
deficiencia respiratoria pueden demostrar tasas normales, reducidas, o
aumentadas de gliclisis; estos mutantes de deficiencia respiratoria
cuando son recubiertos con 1% de 2,3,5 cloruro de trifeniltetrazolium
79
(TTC), pueden ser fcilmente identificadas como colonias blancas a

consecuencia de su inhabilidad de reducir la sal de tetrazolium de incolora
a roja, colonias con suficiencia respiratoria adquieren un color rojo
mientras que las mutantes con deficiencia respiratoria permanecen
blancas (Hornsey, 2003) , al evaluar este parmetro se encontr que esta
caracterstica se presenta en la fermentacin puesto que de las 85
muestras analizadas, slo en 7 se evidenci respiracin deficiente, sin
embargo al observar los indicadores, las muestras no se salen de los
rangos establecidos los cuales permiten hasta un 5% para encontrar este
tipo de mutacin durante el proceso fermentativo.
Otro tipo de contaminantes que se pueden presentar corresponde al
grupo de los coliformes, los cuales pueden crecer en un rango de pH de 4
a 8 (con un ptimo de 6.7), pero no pueden tolerar mucho alcohol, y por
eso slo crecen en las primeras fases de una fermentacin (Heggart,
1999), por este motivo se analizaron muestras que estuvieran dentro de
las 24 48 horas de fermentacin en el medio de cultivo Mac Conkey el
cual arroja resultados 48 horas despus, encontrando 0 UFC/ml y
asegurando que la fermentacin arrancaba sin ningn alterante
microbiano de esta clase, stos a su vez pueden ser utilizados para
decidir si se resiembra la levadura del fermentador, o se descarta.
Se conoce tambin que en los fermentadores, los coliformes pueden
producir etanol, dixido de carbono, cido actico, cido lctico, fenoles,
acetaldehdo, dimetil sulfuro, y otros compuestos que llevan a sabores
extraos en el producto final (Hornsey, 2003), luego el muestreo se
extendi durante todo el proceso que dure la etapa de fermentacin,
analizando de esta manera tambin muestras que se encontraban dentro
de las 72 y 96 horas de fermentacin, antes de que iniciaran su paso a los
tanques de maduracin donde se analizaron muestras que llevaran de 4
a 6 das en este proceso, encontrando finalmente en ambos casos que los
resultados obtenidos correspondan a los que se esperaba inicialmente y
80
que al finalizar dichos procesos se garantizar la satisfaccin de los

estndares de calidad establecidos, puesto que el crecimiento de
microorganismos no cerveceros puede resultar en una cerveza fuera de
estndar, adems de provocar alteraciones organolpticas, dependiendo
del contaminante, que pueden incluir acidificacin, produccin de
diacetilo, sabores fenlicos extraos, olores estercolares, y otros off
flavours (Verstrepen at al, 2003). Sin duda alguna,
la contaminacin
microbiana de la levadura de cultivo puede resultar en muy serias

alteraciones en la calidad y caractersticas esperadas del producto final.
Aunque en este trabajo solo se evalu la calidad microbiolgica, tambin
se realizan pruebas fsico-qumicas que incluyen el chequeo de
parmetros tales como tiempo, temperatura, pH, oxgeno, contenidos de
extracto y alcohol, anlisis de sabor y la concentracin de clulas de
levadura, procedimiento que si se tuvo en cuenta en este estudio debido a
que los conteos celulares durante el transcurso y al final de la
fermentacin deben encontrarse alrededor de 106 clulas/ml, parmetro
que se cumpli en los conteos realizados, esta informacin se puede
utilizar para determinar que la levadura pueda flocular correctamente y a
su vez de paso a una fermentacin secundaria que se lleva a cabo en la
etapa de maduracin (Hough, 1990), donde tambin se llevaron a cabo
conteos, los cuales oscilaban en el rango de 104 clulas/ml por tratarse
del perodo de maduracin, en este punto dichos recuentos son
importantes para determinar que el nmero de clulas en suspensin
presentes antes de la estabilizacin y filtracin, son los ideales y cumplen
con el estndar, ayudando de esta manera a la eficiencia del proceso de
filtracin.
Despus de la maduracin y antes del envasado, la cerveza pasa de
nuevo por una filtracin con tierra diatomcea que elimina los ltimos
restos que puedan quedar de la fermentacin y tambin los restos de
nitrgeno que durante la maduracin han formado una especie de
81
mucosa, lo que podra provocar ms adelante que la cerveza saliera

turbia (Klimovitz et a, 2002), se tomaron muestras de esta tierra
encontrando 0UFC/ml en ambos medios WLN y WLD, garantizando de
esta manera que esta no interfiere en la calidad de la cerveza que llega
a BBT (tanques de cerveza brillante), sino que por el contrario es un
excelente medio filtrante, al analizar las muestras de los BBT por medio
de filtracin por membrana se obtiene crecimiento de levadura en el
medio WLN donde aunque se observa crecimiento en el medio pese a
que ya ha pasado por un filtro anteriormente esta muestra, sin embargo
este crecimiento es permitido porque se trata de levadura cervecera y no
de un contaminante microbiano, no obstante se tienen especificaciones
los cuales indican que para entrar en el rango, el recuento no debe
sobrepasar las 10 UFC/ml y al interpretar estos resultados se encontr
que todos las muestras analizadas alcanzaban a entrar en dicha
especificacin. Las pruebas para determinar la presencia de otros
microorganismos fueron negativas en todos los casos.
Antes de llevar la cerveza a las envasadoras, se inyecta CO2 en los

tanques hasta conseguir la saturacin deseada, para que la cerveza
salga de su recipiente con una buena capa de espuma y no se oxide
fcilmente (Hornsey, 2003). Para alargar el tiempo de conservacin de
una cerveza, sin que cambie de aspecto, la cerveza pasa por una
pasteurizacin despus del envasado (las botellas pasan por un tnel
con agua a 70C), o con una pasteurizacin flash antes de envasar
(Klimovitz, 2002). Una botella antes de pasar por este proceso se
conoce con el nombre de sifn y en este caso tambin se analizaron
muestras para descartar presencia de bacterias acido lcticas,
coliformes o esporulados que hayan podido proliferar en algn momento
del proceso entre la filtracin y el embotellado, pero los resultados
nicamente muestran presencia de levadura en cantidades permisibles o
dentro de especificacin.
82
Finalmente es importante recordar que un control de calidad

microbiolgico rutinario no resolver necesariamente los problemas de
contaminacin. Sin embargo, ayudar a identificar el problema, cuando
ste surja, para que puedan tomarse las medidas apropiadas para
eliminar tal problema (Klimovitz, 2002). Un control de calidad
microbiolgico tambin revelar los problemas que ocasionalmente
surgen en un producto terminado que no sea resultado de una
contaminacin microbiana, permitiendo que se pueda orientar un anlisis
de causas.
83
8. CONCLUSIONES
Se determin por medio del recuento en cmara de Neubauer que el

nmero de clulas viables de levadura durante el transcurso y al final
de la fermentacin son los adecuados para que la levadura pueda
flocular correctamente.
En la etapa de maduracin, se determin que el nmero de clulas en

suspensin presentes antes de la estabilizacin y filtracin, son los
ideales, cumplen con el estndar, ayudando de esta manera a la
eficiencia del proceso de filtracin.
No se evidenci presencia de levaduras tipo Saccharomyces y tipo no

Saccharomyces durante las etapas de propagacin, fermentacin y
maduracin, que pudieran afectar la calidad del proceso y del
producto.
Se evalu la presencia de mutantes de levaduras de proceso (Variants

y Respiracin Deficiente (RD), este ltimo tipo de microorganismos se
encontr en fermentaciones, sin embargo, los resultados de los
anlisis cumplen los rangos o parmetros establecidos.
Se evalu en el proceso la presencia de microorganismos mesfilos,

coliformes y bacterias cido lcticas, obteniendo 0 UFC/ml en todos
las fases evaluadas, indicando de esta manera que tiempos y
temperaturas de los procesos de coccin, la filtracin y los controles
proceso que se tienen ya estandarizados, son adecuados para evitar
la proliferacin de microorganismos contaminantes.
84
9. RECOMENDACIONES
Durante los meses en que se valor la calidad microbiolgica del

producto en proceso, los resultados encontrados fueron consistentes
debido a que no se evidenci presencia de microorganismos
contaminantes, sin embargo hubo presencia de mutantes de levadura
(respiracin
deficiente)
que
pesar
especificaciones, es recomendable
de
estar
dentro
de
llevar a acabo un estudio de la
levadura utilizada en el proceso, realizando diferentes ensayos para

verificar su variabilidad a travs del tiempo, as como su capacidad
fermentativa o posible deformacin del genotipo de la cepa utilizada.
Se sugiere evaluar la tcnica de filtracin por membrana realizando un

estudio que incluya diferentes volmenes en el momento de filtrar con
el fin de recuperar un mayor nmero de contaminantes, lo que llevara
a analizar un mayor nmero de muestras, esto debido a que
posiblemente la cantidad filtrada no es suficiente para identificar el
crecimiento de microorganismos que podran causar un inadecuado
perfil sensorial al causar off flavours.
Se aconseja realizar un estudio comparativo con diferentes marcas de

cervezas tanto nacionales como internacionales, para evaluar la
influencia que tiene los diferentes tipos de levadura utilizada y que
finalmente influyen en el perfil sensorial de cada una de las marcas.
85
10. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Adams, A; Gottschling, D; Kaiser, C & Stearn, T. 1998. Methods in
yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. New
York: The Laboratory. Chapter 1.
Aguilar, B & FranYios, J. 2003. A study of the yeast cell wall composition
and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.
Letter in Applied microbiology, 37: 268 274 pp.
Aguilar, B. Solis, J. FranYois, J. 2005. Estudio de la variacin de la
composicin de los polisacridos contenidos en la pared celular de la
levadura Saccharomyces cervisiae. Universidad de Guadalajara. Mxico.
Revista digital cientfica y tecnolgica. www.e-gnosis.udg.mx [Consulta en
lnea: Abril 20 de 2007]
Bely, M; Rinaldi, A & Dubourdieu, D. 2003. Influence of assimilable
Nitrogen on Voletiles Acidity production by Saccharomyces cerevisiae
during high sugar fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering.
Vol 96 N 6. 507-512 pp.
Decreto 475. 1998. Normas tcnicas de calidad del agua potable.
Ministerio de Salud Pblica. 13 - 14 pp.
Escobar, M. 2002. Fundamentos de Microbiologa. Ed. Ceja. Pontificia
Universidad Javeriana. Bogot. 268 272 pp.
Funahashi, W. Suzuki, K. Ohtake, Y. & Yamashita, H. 1998. Two novel
beer spoilage Lactobacillus species isolated from breweries. J Am Soc
Brew Chem 56, 6469 pp.
86
Garcia, J. & Francesc, X. Aplicaciones industriales y control de calidad

sensorial en un grupo cervecero multifactora. Escuela Universitaria de
Ingeniera Industrial de Terrassa. [Consulta en lnea: Mayo 19 de 2007].
Ha, C.H. Lim, K.H. & Chang, H.I. 2002. Anlisis of alkali soluble glucan
produced by Saccharomyces cerevisiae wild type mutants. Appl
Microbiol Biotechnol. 58: 370 377 pp.
Harper, H; et al. 2004. Harper: bioqumica ilustrada. Ed. El Manual
Moderno. 16a ed. Mxico. Captulos 3, 4 y 5.
Heggart, H; et al. 1999. Factors Affecting Yeast Viability and Vitality
Characteristics: A review. Technical Quarterly. Vol. 36 N 4. 383 406 pp.
Hough, J.S. & Burgos, G. 1990. Biotecnologa de la cerveza y la malta.
Ed.
Acribia.
Zaragoza,
Espaa.
55
70
pp.
Hough, J.S. Briggs, D.S. Stevens, R & Young, T.W. 1992. Malting and
Brewing. Science. Vol I and II. New Cork. 4-16 pp.
Hornsey, I. 2003. Elaboracin de cerveza: microbiologa, bioqumica y
tecnologa. Ed. Acribia. Zaragoza, Espaa. Captulos: 2,4, 6.
Ingledew,W; Sosulski, F & Magnus, C. 1996. An assessment of yeast
foods and their utility in brewing and enology. Journal of American Society
of Brewing Chemistry. Vol 44. 166-170 pp.
Jacques, K; Lyons, T & Kelsall, D. 1999. The Alcohol Textbook. 3rd
Edition. Nottingham University press. Chapters 1, 3, 5, 6, 20 y 21. 386 pp.
Kandler, O. 1983. Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria.
Antonie Van Leeuwenhoek. Chapter 49. 209-224 pp.
87
Kelsall, D. 1995. The management of fermentations in the production of

alcohol. In: The alcohol textbook Nottingham University Press. Nottingham
UK. 89-101 pp.
Klimovitz, R; et al. 2002. El Cervecero en la Prctica. Masters Brewers
Association of the Americas. St. Paul, Minnesota. Captulos 3, 5, 6, 9, 10,
15 y 17
Klis, F; Hellingwerf, K & Brul, S. 2002. Dynamics of the cell wall
structure Saccharomyces cerevisiae Microbiol. Mol. Biol. Rev 239 256
pp.
Oliveira, S; Paiva, T; Visconti, A & Giudici, R. 1999. Continuous
alcoholic fermentation process: model considering loss of cell viability.
Bioprocess Engineering. Vol 20. 157-160 pp.
Philiph, S. 1985. Genetic analysis of petite mutants of Saccharomyces
cerevisiae: transmissional types. Department of Genetics, The Ohio State
University, Columbus, Ohio 43210 [Consulta en lnea: Junio 03 de 2007]
Sendra, J. & Carbonell, J. 1999. Evaluacin de las propiedades
nutritivas, funcionales y sanitarias de la cerveza, en comparacin con
otras bebidas. Instituto de agroqumica y Tecnologa de los alimentos
Consejo superior de investigaciones cientficas. 18, 26, 33, 44 49 pp.
Verstrepen, K; et al. 2003. Flavor Active Esters: Adding Fruitiness to
beer. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol 96 N 2. 110 118
pp.
88
Xiao, J; Zhou, Z. & Zhang, G. 2004. Ant colony system algorithm for the
optimization of beer fermentation control. Journal of Zhejiang University
Science. 5(12):1597-1603 pp.
89
11. ANEXOS
11.1. Medios de cultivo
11.1.1. Wallerstein Laboratories Nutrient Mdium (WLN y WLD)
WLN: Medio de cultivo utilizado para la diferenciacin de levaduras,
levaduras salvajes y bacterias.
WLD: Este medio es ms selectivo puesto que lleva cicloheximida para
inhibir el crecimiento de levaduras
Frmula
g/L
WLN Wallersteins
medium (Oxiod)
nutrient 80,0
WLD (Medio diferencial)
80.0
Cicloheximida
0.133
pH = 5,5 5,8 (Si es necesario ajustar el pH utilizando cido clorhdrico)

Autoclavar a 121C por 15 minutes.
Atemperar el medio a 50C antes de servirlo en las cajas de petri
11.1.1.2. Interpretacin
Saccharomyces cerevisiae puede crecer como una colonia blanca, verde plido
o azul verdosas, la interpretacin se realiza de una manera sencilla, si el
crecimiento de las colonias es espaciado y poco abundante.
Otras especies de Saccharomyces y otros gneros de levaduras salvajes
generalmente se distinguen fcilmente del tpico crecimiento que tiene la
levadura en WLN, porque la morfologa de las otras colonias es notablemente
diferente
(arrugadas,
levantadas,
speras,
polvorolientas),
su
color
generalmente difiere tambin, pasando de blanco por sombras de azul, a verde.
90
11.1.1.3. Estimacin de Variants

La levadura tpica crece con un aspecto cremoso, verdes con un
pequeo centro amarillo
o pequeas colonias verde oscuro. Las
colonias son de 2 - 3 mm, levantados y las orillas son enteras.

Todas las colonias que difieren de esta descripcin (por ejemplo, orillas
no enteras, el tamao de la colonia ms pequeo, el color, las colonias
brillantes, blancas y ms oscuras), puede ser considerada para ser
variantes de la levadura tpica.
Estas variaciones (mutaciones), a diferencia de la deficiencia respiratoria,
son desconocidas, y por lo tanto, los efectos en la calidad de cerveza son
tambin desconocidos.
Sin embargo, asumiendo que pueden ser perjudiciales en la calidad de la

cerveza, una especificacin de <5% de variantes es permitida dentro del
proceso.
11.1.1.4. Clculo
Contar el nmero total de colonias
Contar el nmero total de colonias variantes (variants)
Nmero total de colonias variantes x 100
Nmero total de colonias
= % variants.
11.1.2. Raka Ray

Medio selectivo para el aislamiento y de bacterias cido lcticas que
pueden crecer en el proceso. Lactobacillus y Pediococous se discernirn
en este medio.
91
Varios de los componentes de este medio (extracto de hgado, extracto

de levadura y N-acetilglucosamina) se han incluido para que se de una
mejor recuperacin de bacterias cido lcticas.
Sorbitan mono-oleato es incluido como un estimulante para bacterias
cido lcticas en general. La fructosa presente le sirve como la fuente
esencial de carbohidrato para Lactobacillus fructivorous mientras que la
maltosa presente es tomada por Lactobacillus que no puede utilizar la
glucosa, la cual puede ser utilizada por Pediococous
La selectividad incrementada por la adicin de 3 g/L de de 2
phenylethanol para inhibir el crecimiento de microorganismos Gramnegativos y 7 mg de cycloheximide para inhibir levaduras.
Frmula
g/L
Raka-Ray Agar
(Oxoid code: CM 777)
77,1
Suplemento por Litro

Sorbitan mono-oleato
10,0ml
Cicloheximida
0,007 g
2 Phenylethanol
3,0 g
pH 5,4 0,2
Autoclavar a 121C por 15 minutes.
Atemperar el medio a 50-55C y aspticamente adicionar 3ml de
phenylethanol por litro y posteriormente distribuir en las cajas de petri.
11.1.2.1. Incubacin
Una vez realizada la siembra, incubar las cajas en jarras de anaerobiosis
a 25C por 4 das, verificar la formacin de colonias, si no se observa
crecimiento se dejan 3 das ms.
92
Las bacterias cido lcticas crecen como colonias brillantes, cremosas.
La confirmacin positiva de bacterias cidas lcticas se debe realizar
utilizando la coloracin de Gram (positivo) y la prueba de Catalasa
(negativo).
11.1.3. Agar Mac Conkey
Medio para la deteccin y numeracin de Enterobacterias. Este medio es
diferencial para la deteccin de coliformes
Este medio contiene adems de otros componentes, lactosa, sales
biliares, cristal violeta y rojo neutro como indicador.
El cristal violeta presente en el medio sirve para inhibir el crecimiento de
microorganismos Gram-positivos
Las propiedades diferenciales del medio, se lleva a cabo por accin de los
cidos producidos por la fermentacin de la lactosa, reaccin evidenciada
gracias a la presencia del indicador rojo neutro y la absorcin de ste por
las colonias para ocasionar las colonias color rojo ladrillo.
Frmula
g/L
Mac Conkey Agar No. 3 (Oxoid)
51.1
Los coliformes se desarrollarn en este medio con colonias que van
desde rosadas oscuras a colonias rojas. Las bacterias Gram-positivos
bacteria son inhibidas en este medio y por lo tanto no pueden crecer.
Otras especies de Gram-negativos pueden crecer pero su color es casi
translcido.
93
Streptococcus faecalis
y algunas otras levaduras salvajes pueden
crecer sobre este medio.
11.1.4. Plate Count Agar (PCA)

Este es un medio de cultivo til para la enumeracin de una gran variedad
de bacterias, ya que no es ni selectivo ni diferencial y general es utilizado
para recuperar una gran gama de microorganismos que puedan estar
presentes en una muestra para propsitos de enumeracin. En este
medio pueden crecer un alto rango de bacterias y levaduras salvajes.
Frmula
g/L
Plate Count Agar (Oxoid)
17,5
pH = 7,0
11.1.5. Malt Extract, Yeast Extract, Glucose, Peptone Broth (MYGP)

Medio utilizado para el crecimiento de levaduras y levaduras salvajes y en
cervecera para realizar el test de respiracin deficiente.
Frmula
g/L
Extracto de malta
Extracto de levadura
Glucosa
10
Peptona
Bacto-Agar
30
Las clulas de levadura con respiracin deficiente a menudo aparecen

como pequeas colonias en este medio, estas levaduras carecen ciertas
enzimas respiratorias y han sido asociadas con el crecimiento pobre y la
produccin desfavorable del sabor durante la etapa de fermentacin, as
como viabilidades ms bajas de levadura.
94
Para ser utilizado en el test de respiracin deficiente en levaduras, es

necesario adicionar el medio Triphenyl Tetrazolium Cloride Agar (TTC),
utilizando la tcnica doble capa de agar.
La prueba realizada en este medio depende del hecho si esas enzimas

respiratorias estuvieron presentes, es decir si la levadura tuvo una
respiracin adecuada, entonces al adicionar el medio TTC, la sal sin color
que contiene el tetrazolium es reducida a la forma insoluble (trifenil) y
forma un pigmento rojo.
11.1.6. Triphenyl Tetrazolium Cloride Agar (TTC)
Frmula
g/L
Triphenyl
chloride
tetrazolium 0,5
Glucosa
5,0
Bacto-Agar
15,0
Respiracin Normal o suficiente las colonias se tornan de rosado a rojo.
Respiracin deficiente, las colonias (petites) permanecen blancas.
11.1.6.1.2. Clculo:
N = Nmero total de UFC (Rosadas o Rojas)
Nv = Nmero total de UFC con Respiracin deficiente (Blancas)
N x 100 = X
N + Nv
100 X = % RD
95
11.1.7. Schwarz Differential Medium (SDM)

Medio para la diferenciacin de levaduras tpicas del proceso cervecero
de levaduras salvajes.
El complejo Silfito-fucsina inhibe las levaduras de cervecera si se utiliza
en una concentracin de 0.3 - 0.35%.
El medio es, por lo tanto, selectivo para el crecimiento de la mayora de
las levaduras salvajes, y
la apariencia de las colonias de levaduras
salvajes puede es fcilmente detectable.

Frmula
g/L
Extracto de malta
3,0
Extracto de levadura
3,0
Glucosa
10,0
Peptona
5,0
Fucsina Bsica
0,47
Sulfito de sodio
2.92
Dextrina
0,11
Bacto-Agar
20,0
No se Autoclava porque puede ser inhibida la accin del complejo sulfitofucsina, pero se debe calentar y una vez empiece a hervir se debe dejar
por 15 minutos para garantizar la adecuada esterilizacin.
Incubar las cajas de petri una vez servidas durante toda la noche a 30C
antes de ser utilizado para realizar algn anlisis.
El medio cambia su color inicial durante el perodo de incubacin,
tornndose rojo oscuro.
96
La presencia de colonias rosadas fcilmente discernibles de cualquier

descripcin (por ejemplo, suaves, mucoides, arrugadas), indica la
presencia de levaduras salvajes.
11.1.8. Medio Lisina

Este medio contiene lisina como la nica fuente de nitrgeno, lo cual lo
hace ideal para la diferenciacin Saccharomyces sp, de levaduras tipo no
Saccharomyces sp
Al sembrar las muestras en este medio es importante que todo el
nitrgeno que pueda venir de otra parte sea eliminado, por esto es
importante realizar previamente las diluciones con solucin salina.
Algunas bacterias pueden crecer sobre el medio lisina, por eso es
importante confirmar la morfologa tpica de las levaduras salvajes a
travs del microscopio.
Frmula
g/L
Lisina medio
65
Lactato de potasio 50%
10 ml
cido Lctico 10%
1 ml
La apariencia tpica de una levadura salvaje se diferencia de otras
colonias por la presencia de una especie de neblina en el fondo del
medio, diferencindolas de otras levaduras que no se han desarrollado.
Esto indicara la presencia de levaduras de tipo no Saccharomyces.
97
11.2. Muestra de Clculo

11.2.1. Muestra de clculo para obtener resultados en el medio WLN
en las muestras de BBT y Sifn.
N = Nmero de UFC
X = Nmero de cuadrantes en los que se dividi la caja para realizar
conteo
20 = Volumen de muestra filtrado.
N x (X) = UFC/ml
20
Ejemplo: Resultado Promedio Tanque 1 BBT
N = 49
X= 4
20 = Volumen de muestra filtrado.
49 x 4 = 9.8 UFC/ml
20
Especificacin: b 10 UFC/ml
11.2.2. Muestra de clculo para obtener Porcentaje de Petite mutants
(Respiracin Deficiente)
N = Nmero total de UFC (Rosadas o Rojas)
Nv = Nmero total de UFC con Respiracin deficiente (Blancas)
N x 100 = X
N + Nv
98
100 X = % RD
Ejemplo: Tanque 102 Generacin de Levadura C4

N = 123
Nv = 1
123 x 100 = 99.19%
123 + 1
100 99.19 = 0.81 % RD
Especificacin: 5% de RD
11.2.1. Muestra de clculo para resultados siembra en superficie

N = UFC/ml x 5
Multiplico por 5 debido a que el volumen sembrado corresponde a 0.2ml
Ejemplo: Enjuague tanque 103
N = 4 UFC/ml x 5
UFC/ml = 20
99
11.3. Formato para la recoleccin de Resultados Obtenidos
ANLISIS MICROBIOLOGICO DEL PRODUCTO EN PROCESO - CERVEZAS

CDIGO
FECHA
MUESTRA
HORA
TANQUE
N
COCIMIENTO
EDAD
VOL. DE
MUESTRA
PCA
(UFC/ml)
Mac
Conkey
(ufc/ml)
100
WLN
(UFC/ml)
WLD
(UFC/ml)
Raka
Ray
(UFC/ml)
ID
SDM
(UFC/
ml)
Lisina
(UFC/
ml)
WLN
Varia
nts
MYGP
RD
D.E/F.D.E.
OBSERVACIONES
101

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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

VALORACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DEL PRODUCTO

MARIA PAULA TORRES TORRES

PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO

VALORACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DEL PRODUCTO

MARIA PAULA TORRES TORRES

VALORACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA DEL PRODUCTO

MARIA PAULA TORRES TORRES

Dra. ngela Umaa Muoz. M.Phill

Dr. Lus David Gmez. MSc.

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

2.1.1. Levadura cervecera..3

Crecimiento y Multiplicacin celular...6

2.2.1. Curva de crecimiento microbiano....6

Bacterias lcticas como contaminantes..20

2.8.1. Metabolismo Homofermentativo y Heterofermentativo.20

Factores que afectan el rendimiento del alcohol...24

2.9.1. Cambios de pH durante la fermentacin.24

2.10.4. Ebullicin del Mosto......29

Objetivos del proyecto..41

4.1. Objetivo general..41

5.1. Tipo de estudio42

almacenamiento previo a la siembra se llev a cabo bajo condiciones de

Palabras Claves: Valoracin de la calidad, Produccin de cerveza,

microorganisms, yeast variants

procedimientos de organizacin, documentacin y autorizacin que

afectar la calidad del proceso de elaboracin y de esta manera establecer

Saccharomyces cerevisiae tiene como caracterstica que al final de

Fuente: El cervecero en la prctica, 2002.

La clula est constituida aproximadamente por:

2.1.1.3. Composicin de la clula de la levadura

Fuente. El cervecero en la prctica, 2002

del cultivo) o concentracin de biomasa microbiana (gramos de clulas

su desarrollo; en estas condiciones los individuos necesitan

adaptarse a ese medio ambiente generando abundante actividad

2.2.1.2. Fase logartmica

2.2.1.3. Fase estacionaria

Es posible llegar a tener cadenas celulares cuando una madre tiene

hidrfobas (repele el agua) lo que hace que se aglomeren. Esta propiedad

La presencia de azcares (como la manosa) o de protenas tipo lectina en

diferentes, etc). Sin embargo nos es muy comn que se presenten

2.6. Levaduras salvajes

Se considera como levadura salvaje o silvestre cualquier espcimen

Forma de las clulas (redondas, ovales, alargadas, etc)

Forma de agrupamiento de las clulas (aisladas, cadenas, etc).

Algunas de las levaduras salvajes ms comunes en cervecera son:

requieren de sta para ser sintetizados. Parte de esta energa es obtenida

Glucosa + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ ------------ 2 Piruvato + 2ATP + 2NADH+

opera tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis

Fuente: The alcohol textbook 3 edition page 61.

Figura 2. Ruta Embden Meyerhof Parnas para la utilizacin de la glucosa.

Los hechos principales de la fermentacin son:

2.7.2. Ciclo de cidos tricarboxlicos (Ciclo de Krebs)

Fuente: Harper: Bioqumica ilustrada, 2004.

Algunos compuestos intermedios del ciclo TCA son usados por la

durante la gemacin de la levadura, una clula hija puede formarse sin

heterofermentadores, carentes de aldolasa, no pueden descomponer el

Fuente: modify of carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria, 1983.

Estas rutas para el metabolismo de carbohidratos llevadas a cabo por las

2.8.2.1. Nitrgeno: varios aminocidos y vitaminas son necesarias para

heterofermentativas poseen enzimas proteasas y pueden degradar las

presencia de sustancias extraas y/o en altas cantidades (Jacques et al,