Reaccin en cadena de

la polimerasa (PCR)
UAI-Estructura y Dinmica
Celular
2008
Dr. Juan Jos Valdez Alarcn

Reaccin en cadena de la ADN polimerasa (PCR)

Desnaturalizacin 95C

Repeticin
del ciclo

ADN polimerasa
termoestable

Alineamiento de
oligonucletidos 30-65C

Extensin 72C

Amplificacin exponencial en la PCR

Si en cada ciclo la cantidad de ADN se
duplica, entonces la multiplicacin de la
molcula molde se puede calcular como

2n

Entonces en 30 ciclos y suponiendo

100% de eficiencia de la reaccin:

230 = 1.07 X 109

Requerimientos para la PCR

cido nuclico molde (ADN o ARN;
total, nuclear, de plstido)
Un par de oligonucletidos
complementarios a una secuencia
blanco
ADN polimerasa termoestable, dNTPs
Termociclador

INGENIO !!!

Componentes de la reaccin

Amortiguador (Tris-HCl 10 mM pH 8.0)

KCl 10-50 mM
MgCl2 1-4 mM
dNTPs 200-500 M
ADN molde 0.1-100 ng
Oligonucletidos 100-500 nM
ADN polimerasa (Taq) 2.5 unidades
Aditivos

Condiciones en el termociclador
1) 2-5 minutos, 95C; desnaturalizacin
inicial
2) 45 segundos, 95C; desnaturalizacin
3) 45 segundos, 60C; alineamiento
4) 1 minuto, 72C; extensin
5) 7 minutos a 72C; extensin final

30
ciclos

Metodologas basadas en la PCR

Marcadores
moleculares
Individuo 1 Individuo 2

Mayor tamao

Menor tamao
Fragmento especfico
Fragmento comn

Metodologas basadas en la PCR

A

RAPD aislados Staphylococcus spp.

kb
12

10

2
1
0 .5
0 .2

kb
12
2
1
0 .5
0 .2

11 12 13

14 15 16

17 18 19

20 21

Metodologas basadas en la PCR

Oligos especficos Staphylococcus spp.

kb
12
2
1

12

10 11

0 .5
0 .2
12
2
1
0 .5
13

14

15 16

17

18

19

20

Diseo de oligonucletidos
Cuando no se conoce la secuencia blanco
Se conocen protenas o secuencias de cidos
nuclicos homlogos
M
A
G
N
E
W I
N
G
Y
ATG-GCT-GGT-AAT-GAA-TGG-ATT-AAT-GGT-TAT
GCC GGC AAC GAG
ATC AAC GGC
GCA GGA
ATA
GGA
GCG GGG
GGG
ATG-GCI-GGI-AAY-GAR-TGG-ATH- AAY- GGI-TAT
I=inosina Y=pirimidina R=purina K=keto M=methyl
W=weak S=strong B=no A D=no C H=no G V=no T