articulos Serratia marcescens: DE PATOGENO OPORTUNISTA AL CONTROL DE INSECTOS QUE AFECTAN CULTIVOS AGRICOLAS, Alejandro Ruiz Sanchez '*, Ramén Cruz Camarillo! y Rubén Salcedo Hernandez”, 1. Eleazar Barboza Corona” ‘Escuela Nacional de Ciencias Biolégicas, Institute Politécnico Nacional. México, D. F, “Instituto de Ciencias Agricolas, Universidad de Guanajuato. Carretera Irapuato-Sila0, Km 9. Apartado Postal 311, 36500, rapuato, Gto. México. e-mail: josebar@dulcinea.ugto. mx. Palabras clave: Sorratia marcescens, Bacillus thuringiensis, quitina, quitinasas, proteinas Cry. Key words: Serratia marcescens, Bacillus thuringiensis, chitinases, Cry protein. Resumen Serratia marcescens es una bacteria que produce quitinases (Chi), las cuales hidrolizan los enlaces Glicosidicos p-1,4 de la quitina, Esta bacteria tiene un sistema quitinolitico completo formado de tres clases de enzimas (endoquitinasas, exoquitinasas y quitobiasas) y una proteina que se une a quitina. Varios estudios han mostrado cémo las quitinasas de diferentes bacterias, entre ellas las de S. marcescens, han incrementado el efecto insecticida de las proteinas Cry de Bacillus. thuringiensis. Aun cuando se han expresado vatios genes chi heterdlogos en B. thuringiensis, ninguno ha sido de S. marcescens. Los genes chi de S. marcescens se podrian clonar en B. thuringiensis y aumentar ast su potencia en contra de insectos de importancia agronémica, sobre todo contra aquellas plagas que son poco susceptibies a las proteinas Cry. Abstract Serratia marcescens is a chitinolytic bacterium able to hydrolize the -1,4 chitin glicosidic bonds. This, bacterium has a chitinolytic system constituted of three types of enzymes (endochitinases, exochitinases, and chitobiases), and one chitin binding protein, Several studies have shown that chitinases from diverse bacteria, like S. marcescens, have improved the insecticidal activity of Cry proteins from Bacillus thuringiensis. Even though different heterologous chi genes have been used to transform B. thuringiensis, not chitinase genes from S. marcescens has been used to get a transgenic B. thuringionsis strain. Chitinase genes from S. marcescens cen be cloned in B. thuringiensis for increasing the insecticidal activity of this bacterium, particularly against pest that are less susceptible toward Cry proteins. CARACTERISTICAS GENERALES DE S. de un milagro y que las figuras lloraban sangre. El Marcescens No es sorprendente que en algunas ocasiones se haya escuchado 0 leldo que han aparecido manchas rojas en la zona de los ojos de figuras religiosas. Esto hacia creer que se trataba color rojo también aparecia en ostias y crucifios. Mas tarde se descubrié que las lagrimas estaban conslituidas por una bacteria que tiene la perticularidad de producir un pigmento rojo (Figura 1), ef que se llamé prodigiosina, un compuesto derivado det pitrol (Stainer y col., 1994). Serratia ‘marcescens es una bacteria Gram-negativa, que BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2 31pertenece a la familia Enterobacteriaceae’ (Freeman, 1985), que puede vivir en diferentes tipes de ambiente, con 0 sin oxigeno (anaerobic facultative). Ademas de la prodigiosina, produce lecitinasas, fosforilasas, toxinas extracelulares y quitinasas (Escobar y col., 2001). Por otro lado, Serratia marcescens es una bacteria cosmopolita ‘que se ha encontrado sobre hongos Basidiomicetos y Ascomicetos (Ordentlich y col., 1988), caracoles, insectos, vertebrados, semillas de {rol crustéiceos, suelo, agua y plantas. También se ha aislado en hospitales y clinicas, debido @ que es un patégano oportunista intrahospitalario, que puede ‘ocasionar infeccién en los tractos urinario y respiratorio, y producir meningitis y artrtis (Escobar y col, 2001), Fig. 1. Formula quimica de la prodigiosina, pigmento sintetizado por Sorratia marcescens, responsable del color rojo de Ia bacteria (Stainer of al., 1994), Cuando S. marcescens infecta a un insecto, éste puede morir en un lapso de uno @ tres dias, proporcionando frecuentemente un tono rojo en los cadaveres (Boucias, 1998). Ciertos pardsitos de himenépteros han sido reportados como vectores de esta bacteria, Por otro lado también es capaz de producir cilotoxinas que tienen efecto en las lineas| celulares CHO, Vero y Hep-2. Estas citotoxinas son similares a las producidas por aislados clinicos, y son t6xicas a diferentes lineas colulares de mamiferos. Estos hallazgos deben de tomerse muy en cuenta cuando se hagan estudios relacionados con el uso de S. marcescens en e! control biolégico| (Escobar y col, 2001) articulos QUITINASAS DE S. Marcescens La quitina es un polimero renovable, que ‘ocupa en la naturaleza el segundo lugar en abundancia, sélo superado por la celulosa. Se puede encontrar en protozoarios, crustéceos, insectos y hongos. La quitina esté formada por unidades de N-acetilglucosamina (NAG) unidas por enlace glicosidico B-1,4. Las quitinasas (Chi) son fenzimas que hidrolizan la quitina en ol enlace glicosidico. En general se pueden distinguir los ‘siguientes tipos de quitinasas.(i) Las endoquitinasas que hidrolizan la quitina de manera azarosa en los enlaces glicosidicos_—_internos_liberando principalmente quitobiosa (dimero de NAG) y pequerias cantidades de otros oligosacaridos superiores. (i) Las exoquitinasas, entre las cuales se encuentran las quitobiosidasas, que catalizan la liberacién de quitobiosa a partir del exiremo no feductor de la quitina;_ yas Ne acelilglucosaminidasas quo liberan NAG a partir del extremo no reductor. (ill) Las quilobiasas que actiian sobre la quitobiosa y producen monémeros de NAG (Barboza-Corona y col., 1998) Serratia marcescens es una de las bacterias con mayor capacidad quitinolitica hasta ahora conocidas. Su sistema quitinolitico esta constituido por endoquitinasas, exoquitinasas, quitobiasasy una proteina que se une a quitina (Brurberg y col., 1996) (Fig. 2). Los genes de S. marcescens han ‘sido clonados en varias bacterias como Escherichia coll (Tews y col., 1996; Brurberg y col., 1995; Jones y col., 1986), Pseudomonas fluorescens (Shaikh y Deshpande, 1993), pero hasta ahora, ninguno en Bacillus thuringiensis. Las quitinasas producidas por S. marcescens pueden ser usades en la degradacion de materiales que tengan quitina, tales como el exoesqueleto de los crustaceos, membrana peritrofica de los insectos y en la degradacién de la pared celular de hongos como Sclerotium roltsi (Ordentlich y col., 1988). AI igual que la celulosa, la quitina es quimicamente muy estable, y el 32 BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2teciclamiento del carbono y nitrégeno que contiene ‘es un proceso lento que slo se praduce si hay presencia de enzimas que la degraden. En relacion con el control de insectos, las quitnasas de S. marcescens se han empleado como agentes sinérgicos de las proteinas Cry en el control del gusano soldade (Spadoptera iitoralis) (Regey y col., 1996), y del barrenador de la cafia de azticar (Eidana saccharine) (Downing y col, 2000). En este Espacio periplismico Figura 3. Representacién esquematica del mecanismo de accién de las proteinas Cry » ctistales formados por las proteinas Cry y el posible papel de las quitinasas.( (QD) auitinasas (), Las proteinas Cry son solubilizadas en el estémago medio y liberan las protoxinas, las cuales son digeridas por las proteasas intestinales formandose las S-endotoxinas. Las. quitinasas degradan la membrana peritrofica, Las é-endotoxinas pueden alcanzar mas faclimente los receptores de membrana presentes en el intestino medio al degradarse la quitina. Las S-endotoxinas ejercen su efecto toxico y las lavas mueren, BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2 articulos caso las quitinasas de S. marcescens actin en la membrana peritroficas de las larvas de los insectos, permitiendo que las proteinas Cry tengan un mayor acceso a los receptores del intestino medio, ‘obteniéndose esi una mayor capacidad insecticida, que si actuaran por si solas (Fig. 3). Esto es de particular importancia, especialmente para el caso de los insectos que son poco suscoptibles a Cry. Fig. 2. Sistema quitinolitico de Serratia marcescens. La quitina que se encuentra en el medio es degradada por una endoquitinasa (ChiA) que es secratada por Serratia. marcescens. Esta rompe los enlaces intemos -1,4 de la quitina y se forman oligémeros de N-acetiiglucosamina, los cuales pasan al espacio periplasmico gracias a la ayuda de la protoina porina 2 que se encuentra en la pared celular de la bacteria. Los oligomeros son degradados por una quitobiosidasa (ChiB) que cataliza la formacion de la quitobiosa, Posteriormente Ia quitobiosa es hidrolizeda or quitobiasas para formar monémeros de Neacetilglucosamina. La proteina._ Ell permite e| paso de la N-acetiiglucosamina al ciloplasma lugar donde seran usadas como fuentes de carbono y_nitrégeno, (Modificado de Brurberg y col, 1986). INTESTING MEDIO. MEMBRANA PERAIROFICA HEMOUINFA, , INTESINO. INTESTINO 7 POSTERIOR ANTERIOR 33PROTEINAS Cry Y QUITINASAS DE B. Thuringiensis Bacillus thuringiensis es una bacteria esporogénica. Gram positiva, y ampliamente conocida en el Ambito agricola debido 2 su uso para el control de plagas que afectan cultivos como la papa, maiz, brécol, y colflor. Dicha bacteria es sorprendente ya que sintetiza proteinas llamadas Cry, las cuales son capaces de formar cristales y aniquilar a diversos insectos susceptibles. Las proteinas Cry forman cristales, esto es importante ya que asegura que al ser ingerido por un insecto, ‘este reciba suficiente dosis para que lo incapacite y permita la germinacién de esporas de B. thuringiensis. La répida proliferacion de bacterias ocasiona septicemia y muerte. Los cristales pueden adoptar diversas formas como os bipiramidales, cxibicos, esféricos, triangulares, ete. La formacién y tamafio de los ctistales depende del control genético de ciertas regiones (promotores fuertes, terminadores de la transcripcién, secuencias Shine Dalgarno) presentes en los propios genes (lamados cry) que sintetizan las proteinas Cry, 0 bien de proteinas auxiliadoras (‘helper proteins”) ‘que ayudan a estabilzar @ Cry después de que se han formado (efecto postraduccional) Bacillus thuringiensis también sintetiza las proteinas Cyt y Vip que son insecticides, y otros compuestos con probable uso biotecnolégico. Algunos ejemplos son las proteasas (enzimes que degradan proteinas), quitosanasas (enzimas que degradan quitosana), quitinasas, _melenina (Pimento presente en la pie! del ser humano), bacteriocinas (antibidticos que atacan bacterias), amilasas (actian sobre almidones), queratinasas (actiian sobre queratina, proteina presente en pelo, Piel y uftas) (Barboza-Corona y Escudero-Abarca, 2002 Con respecto a las quitinasas de B. thuringiensis, éstas se empezaron a estudiar desde la decada de los 70s (Chigalleichik, 1976), articulos principalmente debido @ su probable uso como agente para incrementar Ia toxicidad de las proteinas Cry. Varios grupos se han dedicado a la seleccion de cepas productoras de quitinasas. Por ejemplo, se han estudiado cepas aisladas de México, Tailandia y varias de la coleccién de 8, thuringiensis mantenidas en el Instituto Pasteur de Francia y del Banco Genético de Bacillus en Ohio, Estados Unidos. En general, se ha observado que B. thuringiensis expresa quilinasas solamente en presencia de la quitina como inductor, es decir no lo hace de manera constitutiva. Esta produccion es muy baja comparada con otras bacterias como S, ‘marcescens, e incluso en algunas ocasiones la expresin puede ser tan baja que es muy dificil detectarla. Contrario a lo anterior, recientemente se publicé la deteccién y purifcacion de una exoquitinasa de B. thuringiensis HD-1, la cual se expresa de manera constitutiva (incluso con ‘glucosa) cuya expresién es independiente de la presencia de quitina (Arora y col., 2003). Por otro lado, solamente se ha reportado la clonacién de {res genes chi, uno proveniente de una cepa nativa de Pakistan (B. thuringiensis subsp. pakistani) (Thamthiankul y col,, 2001), otro de B. thuringiensis HD-1 (Arora y col., 2003) y otro de una cepa de México (8. thuringiensis LBIT-82 subsp. kenyao) (Barboza-Corona y col., 2003). Los dos primeros genes producen exoquitinasas y presentan una masa molecular de 71 y 36 kDa, respectivamente, El titimo gen cadifica una endoquitinasa de 74 kDa, Las tres enzimas han quedado agrupadas en la familia 18 de las glicosilhidrolasas. QUITINASAS DE S. marcescens EN B. Thuringiensis Existen varios trabajos en los cuales se ha demostrado que ef uso de quitinasas heterdiogas, como las de S. marcescens, B. lincheniformis, 8. circulans 0 del mismo B. thuringiensis, son capaces e incrementar la actividad txica de las proteinas Cry © Vip en varios insectos plaga como 34 BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2Spodoptera exigua, . iittura, Plutella xylostella y Aedes aegypti (Regev y col., 1996; Wiwat y col., 2000; Arora y col., 2003). Por ejemplo, la adicion de 40 mU [una unidad (U) es la cantidad de enzima necesaria pera liberar en un minuto, 1 umol de N- ‘acetiiglucosamina a partir de quitina coloidal] de quilinasas de B. lincheniformis son capaces de aumentar 8 veces la toxicidad de B. thuringiensis subsp. aizawai hacia Spodoptera exigua (Tantimavanich y col., 1997). Asimismo, cuando se agregaron 0.1. gil de quitinasas de S. ‘marcescens a la proteina Cry16, ta toxicidad contra ‘Spodoptera littoralis se incremento 6 veces (Regev y €0l., 1996). Por otro lado, se ha observado que si se mezclan 19.3 mUlm! de las quitinasas producidas por 8. thuringiensis subsp. kurstaki con esporas y cristales de la misma bacteria, la toricidad hacia Plutella xylostella aumenta 8 veces (Wiwat y col. 2000). Sin embargo, en la mayoria de esos estudios resulta dificil dar una conclusion dofinitiva sobre el efecto sinérgico, especialmente por el uso de extractos crudos, los cuales ademas de las quitinasas pueden llevar otros compuestos como proteasas, exotoxinas © proteinas Vip. Con esta . informacion, surge la necesidad de sobreexpresar genes chi en B. thuringiensis, de tal forma que se fecilile la purificacién de las quitinasas y directa evaluacién con Cry. Ademés, se han reportado ta obtencisn de copas lransgénicas de B. thuringiensis transformadas con genes chi heterdlogos, como los de B. circulans y B. fincheniformis (Lertcanawanichakul_y Wiwat, 2000; Sirichotpakorn y col., 2001). En estos casos la expresion de quitinasas ha sido bala y se ha reducido el nimero de células formadoras de esporas, Por otro lado, como ya se menciond anteriormente, la actividad quitinolitica de Serratia ‘marcescens es muy superior a la observada en otras bacterias incluyendo a B. thuringiensis. Por ejemplo, se ha reportado que S, marcescens WF presenta hasta 20 veces mas actividad de quitinasa articulos que B. thuringiensis subsp. tolworthi (Rojas- Avelizapa y col., 1999). De manera particular, S. marcescens NIMA es una cepa con gran capacidad quitinalitica, la cual presenta mayor actividad (hasta 3 veces) que otras cepas de S. marcescens como, la WF (Rulz-Romero, 1977). Ademés, no se ha reportado la transformacién de 8. thuringiensis con algin gen chi de S. marcescens. Hasta donde sabemos, no existe ningtin estudio donde se haya usado las mismas concentraciones de diversas quitinasas bacterianas y se haya comperado su efecto sinérgico con las proteinas Cry. Es decir, no sabemos si una unidad de quitinasa de S. marcescens es mas efectiva que una de B, lincheniformis, 8. circulans, 0 que del mismo 8, thuringiensis. Suponemos que debido a la gran capacidad quitinolitica de S. marcescens NIMA pudiera ser que una unidad de quitinasa de la cepa NIMA sea mas efectiva que Ia de las otras bacterias; sin embargo, esto tendria que domostrarse. Debido a que S. marcescens es considerado un patégeno oportunista para el ser humano, no es recomendable utilizar quitinasas provenientes directamente de la bacteria. Para resolver lo anterior, hemos pensado en la clonacién de un gen de quitinasa de S. marcescens NIMA. Es importante comentar que ain cuando se han reportado varios genes chi de dicha bacteria, nninguno ha sido de la cepa NIMA. La clonacién de un gen chi de dicha cepa permitiia entre otras cosas poderlo manipular e introducirio en 8, thuringiensis. Consideramos que con las, herramientas que se cuenta actuaimente para la trasformacién de 8. thuringiensis, tales como vectores de expresion estables, promotores fuertes que se expresan en la fase vegetativa o durante la esporulacién, regiones que estabilizan al RNA mensajero y de proteinas auxilidoras. (‘helper proteins"), podrfa facilitarse la clonacién de un gen chi de S. marcescens en B. thuringiensis. Esto podria implicar 1a obtencion de cepas de B. thuringiensis no solo con mayor capacidad insecticida, sino que puedan usarse con otros BioTecnologia 2003 Vol. 8 No. 2 35,propésitos como en el control de hongos fitopatégenos y aprovechamiento de desperdicios de camarén (ricos en proteina-quitina) para la produccién de harinas para consumo animal (Rojas-Avelizapa y col., 1999) Agradecimientos. EI presente trabajo fue realizado gracias al apoyo parcial dol proyecto CONACYT J35306-8. Referencias Bibliograficas. Arora N., Ahmad T., Rajagopal R. and Bhatnagar R, K. 2003. 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