06/12/2011

Anlisis microbiolgico de alimentos

Microorganismos marcadores

En realidad
La mayora de los
alimentos
contienen
microorganismos.

Mara Marcela Martnez Miranda

Magister en Microbiologa
Departamento de Ingeniera
Universidad de Caldas

Porqu buscar
microorganismos marcadores?
1. La deteccin de
patgenos puede ser muy
complicada, muy lenta y/o
muy costosa.
2. La investigacin de
patgenos en alimentos
no facilita un enfoque
preventivo.
3. Calidad microbiolgica en
trminos de
microorganismos
marcadores.
Marcela Martnez M.Sc.

Microorganismos marcadores
ndices

Indicadores

Microorganismos cuya presencia

en cantidades o niveles por
encima de ciertos lmites
numricos indica la posible
presencia de patgenos
ecolgicamente relacionados.

Microorganismos cuya presencia

en cantidades determinadas
indica un tratamiento o
procesado de inocuidad
inadecuado.

Marcela Martnez M.Sc.

No es posible el
anlisis de todos
los patgenos y de
todos los
alterantes.
Marcela Martnez M.Sc.

Microorganismos marcadores
Son organismos (o
grupos) que advierten:
manejo inadecuado
presencia de
microorganismos
patgenos

Su deteccin en el
laboratorio es ms
sencilla, rpida y/o
econmica.

Marcela Martnez M.Sc.

Caractersticas de un buen ndice de

contaminacin en alimentos
1. Origen especfico
2. Tcnicas de laboratorio
fiables y rpidas
3. Resistencia a
condiciones ambientales
y al procesado tanto o
ms que los patgenos a
los cuales representa.

Marcela Martnez M.Sc.

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La presencia posible de
patgenos entricos, es decir,
una funcin de ndice para
microorganismos de
importancia para la salud
pblica, como por ejemplo las
shigelas, que se pudieran
haber originado en la zona
donde fueron tratados los
camarones.

Un tratamiento de
inocuidad
insuficiente
cumpliendo de ese
modo una funcin
de indicador

Los principales microorganismos

indicadores en alimentos son:
Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de
proceso:
Aerobios Mesfilos
Psicrfilos y psicrotrficos
Termfilos o termodricos
Mohos y levaduras

Un microorganismo marcador dado

puede funcionar a la vez como ndice y
como indicador.
Por ejemplo, la presencia de cantidades
importantes de E. coli en los camarones
precocinados congelados indica:

Coliformes totales

Indicadores de contaminacin fecal:

Coliformes fecales
E. coli
Enterococos

Marcela Martnez M.Sc.

Otros microorganismos
indicadores
Estafilococos coagulasa positiva
(Staphylococcus aureus)
Recuento de Anaerobios Mesfilos
Recuento de Anaerobios Esporulados
Recuento de Virus entricos

Marcela Martnez M.Sc.

Anaerobios sulfito-reductores

Mtodos de anlisis microbiolgico

Mtodo: cualitativo
PRESENCIA / AUSENCIA en
25 g o mL de muestra.
Salmonella sp.
Vibrio cholerae
Listeria monocytogenes

Mtodo: cuantitativo
Tubos mltiples: NMP/g o mL
de muestra
Recuento en placa: ufc/g o mL
a. Por incorporacin
b. Por superficie

Marcela Martnez M.Sc.

Indicadores de condiciones de
manejo o de eficiencia de proceso

Aerobios
mesfilos

Psicrfilos y
termfilos

Mohos y
levaduras

Coliformes
totales

Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de aerobios mesfilos

(RAM)
Se desarrollan en presencia de aire
a temperaturas medias (25-40C).
Dan lugar a la formacin de colonias
visibles despus de 72 horas a 3O
C ( 48 horas a 37C) sobre un agar
de recuento, incubado en
condiciones de aerobiosis.
Indican:
la calidad sanitaria de un
alimento.
las condiciones de manipulacin.

Marcela Martnez M.Sc.

las condiciones higinicas de la

materia prima.
Marcela Martnez M.Sc.

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Aplicacin del RAM

El RAM NO es til para:

Alimentos fermentados.

Alimentos
frescos,
refrigerados y
congelados.

Col acida, queso y otros

derivados lcteos.

Materias primas e
insumos.

Alimentos deshidratados y
congelados (Recuento
Microscpico Directo).

Alimentos listos
para consumir.

Alimentos refrigerados
(Recuento de
psicrotrficas).

Alimentos esterilizados
(Recuento Microscpico
Directo).

Marcela Martnez M.Sc.

Existen dos mtodos clsicos para

el recuento de aerobios mesfilos

Marcela Martnez M.Sc.

RAM por el mtodo de siembra a

profundidad

Profundidad 10 -1 (48 h)

10 -2 A (48 h)

10 -2 B (48 h)

10 -3 A (48 h)

10 -3 B (48 h)

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Un RAM elevado indica:

Un RAM elevado puede significar:

En alimentos estables
Materias primas muy contaminadas.
Tratamiento no satisfactorio.
En alimentos perecederos
Materias primas muy contaminadas.
Tratamiento no satisfactorio.
Almacenamiento en condiciones de
temperatura inadecuadas.
Marcela Martnez M.Sc.

1. Excesiva contaminacin
de la materia prima.
2. Deficiente manipulacin
durante el proceso de
elaboracin.
3. La posibilidad de que
existan patgenos, pues
stos son mesfilos.
4. La inmediata alteracin
del producto.
Marcela Martnez M.Sc.

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Psicrotrficos
Por definicin son
organismos que producen
crecimiento visible a 7o C
1o C dentro de 7 a 10
das, independiente de su
temperatura de crecimiento
ptima.
Los organismos
mayormente asociados con
alimentos refrigerados y
que causan dao son
psicrotrficos y no
psicroflicos

Psicrotrficos
Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram
positivos y gram negativos; aerbos; anaerobios y
anaerobios facultativos.
Aeromonas
Bacillus
Clostridium
Lactobacillus
Escherichia
Listeria
Serratia, ect.
Hongos y levaduras

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Psicotrficos patgenos

Psicrotrficos
Mtodos de deteccin

Patgenos
Aeromonas hydrophila
Bacillus cereus (algunas
cepas)
Clostridium botulinum type E,
ByF
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Yersinia enterocoltica

Cultivo durante 10 das

a 7oC para siembra en
profundidad.
Cultivo durante 7-8
das a 7o C para
siembra en superficie
Cultivo durante16 hr a
17O C seguido de 3
das a 7oC

Escherichia coli (algunas

cepas)
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Termodricos

Termodricos

Organismos que
pueden tolerar calor y
por consiguiente
tienen la capacidad
de sobrevivir
pausterizacin. Son
capaces de sobrevivir
el calentamiento de
un alimento a
temperaturas de 60 a
80OC.
Marcela Martnez M.Sc.

Gnero

Alimento asociado

Actinomycetes

Leche

Alcaligenes

Leche

Arthrobacter

Leche

Bacillus

Leche/huevos

Clostridium

Leche

Coryneform

Huevos

Lactobacillus

Leche/carne/jugos

Microbacterium

Leche

Micrococcus

Leche/huevos

Pseudomonas

Huevos

Streptococcus/
Leche/carne/huevo
Marcela Martnez M.Sc.
Enterococcus

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Coliformes
Bacilos Gram negativos
No esporulados
Aerobios o anaerobios
facultativos
Fermentan la lactosa a 35C
con produccin de cido y
gas
Viven en el ambiente y en
animales de sangra caliente
Los coliformes totales
incluyen los fecales
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Son algunas especies que

pertenecen a los gneros:
Gnero

Fuente

Escherichia

Heces (humanas y
animales)

Klebsiella

Heces, ambiente

Enterobacter

Heces, ambiente

Citrobacter

Ambiente
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Coliformes como indicadores de

contaminacin fecal

Aplicacin del uso de Coliformes

como indicadores

Se encuentran en el intestino del hombre y de

animales, pero tambin en otros ambientes
como: suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
Son tiles como indicadores de contaminacin
fecal por:
Su frecuencia en heces
Su fcil deteccin en el laboratorio
Sus caractersticas semejantes a algunos miembros
patgenos de la familia Enterobacteriaceae
Marcela Martnez M.Sc.

1. Deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el

manejo y en la fabricacin de los alimentos.
2. Evaluacin de la calidad microbiolgica de un
producto.
3. Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias
e higinicas en el equipo.
4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de
agua utilizados en las diferentes reas del
procesamiento de alimentos.
Marcela Martnez M.Sc.

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Pruebas de determinacin de
Coliformes
1.

Investigacin y recuento en
medio lquido

2.

Se usa el Caldo
lactosado biliado verde
brillante (Brilliant Green
Bile Lactose: BGBL)
Investigacin y recuento en
medio slido

Se utiliza el medio
selectivo agar biliado
rojo-violeta (Violet Red
Bile Agar: VRBA)

Pruebas para deteccin y

recuento de Coliformes
1. Prueba presuntiva
Caldo Lauril Triptosa (CLT).
Caldo Mc. Conkey.
Caldo lactosado bilis verde brillante.

2. Prueba confirmativa:
Medio EC.
Medio bilis lactosa (BLVB)

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Investigacin y recuento en
medio slido

Coliformes fecales (CF)

Coliformes totales
en placas de agar
bilis rojo violeta,
incubadas por 24 h
a 35 C
UFC/g (o/mL) de
muestra.

Origen intestinal
Pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae
Bacilos Gram negativos,
anaerobios facultativos, no
esporulados.
Fermentadores de lactosa a
44.5 C con produccin de gas.
Principalmente Escherichia coli
(90%)

Marcela Martnez M.Sc.

Determinacin de CF

Marcela Martnez M.Sc.

Escherichia coli (coliformes

termotolerantes)
Capacidad para producir
indol a partir de triptfano
Produccin de la enzima glucuronidasa.
Es el ndice de
contaminacin fecal ms
adecuado.

Su determinacin se hace a partir de la segunda etapa

(confirmativa) del mtodo de NMP, cultivando en caldo
lactosado con incubacin
44.5M.Sc.
C.
Marcela a
Martnez

Hay grandes cantidades de

Escherichia coli en las
heces humanas y
animales.
Marcela Martnez M.Sc.

06/12/2011

Determinacin de E. coli

Recuento de Enterobacterias
Familia
Enterobacteriaceae

Mtodos basados en:

Produccin de cido y gas a partir
de la lactosa.

Lactosa + y lactosa Se usan como grupo

indicador en lugar del
grupo de coliformes
totales.

Produccin de la enzima glucuronidasa.

Los procedimientos incluyen:

Filtracin con una membrana que
despus se incuba en medios
selectivos a 4445 C.

Son de origen fecal y

no fecal.

nmero ms probable
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias

como indicadoras en lugar de los coliformes

Qu indica niveles altos de Enterobacteiras en

alimentos procesados?
Tratamiento inadecuado y/o
contaminacin posterior al
tratamiento; ms
frecuentemente a partir de
materias primas, equipos
sucios o manejo no
higinico

1. Los coliformes son un

grupo mal definido
taxonmicamente.
2. Los coliformes solo
tienen en cuenta las
enterobacterias
lactosa positiva.

Multiplicacin microbiana
que pudiera haber permitido
el crecimiento de toda la
serie de microorganismos
patgenos y toxignicos.

3. Las Enterobacterias
son mas resistentes
que los coliformes.
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Mtodos para el recuento de

Enterobacterias
Mtodo de
recuento

Se encuentran en las heces

de los humanos y animales
de sangre caliente.
Animales de produccin:
vaca, cerdo, oveja, caballo,
gallina y pato.

Recuento en
placa
Recuento en
medio lquido

Mtodo de
ausencia
presencia

Estreptococos fecales
Enterococcus

Confirmacin con
prueba de oxidasa

VRBG Agar

Marcela Martnez M.Sc.

Son importantes en
situaciones donde se sabe
que hay contaminacin
fecal y no se detectan
coliformes.

Marcela Martnez M.Sc.

06/12/2011

Uso de Enterococcus como

indicadores en alimentos
Aunque se encuentran
en cantidades menores
que E. coli, son mas
resistentes.
Se consideran
indicadores en alimentos
procesados, como
lcteos y crnicos, en
los cuales E. coli no
puede sobrevivir.

Especies de Enterococcus
Grupo

Especies

Hbitat

Enterococcus faecalis
Grupo 1

Enterococcus faecium
Enterococcus durans

estn normalmente
presentes en las heces de
humanos y animales

Streptococcus bovis
Grupo 2

Streptococcus equinus
Enterococcus avium

no se encuentran
comnmente en las heces
humanas

Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Clostridium sulfito reductores

Recuento de esporas de Clostridium

sulfito reductores

Bacterias Grampositivas,
esporuladas, anerobias,
reductoras de sulfitos.

Se pesan 10g o ml y se homogenizan

con 90ml de peptona 0.1%

Se realizan diluciones seriadas en

9ml peptona 0.1%

Se utilizan como
indicadores de
contaminacin fecal
antigua.
Clostridium perfringens es
de origen fecal y tambin se
encuentra ampliamente
distribuida en la naturaleza.
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

Choque trmico para formacin de

esporas

Siembra en fondo en agar SPS

Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10
minutos para hacer luego el choque trmico y activar las esporas.
Marcela Martnez M.Sc.
Para finalizar el choque trmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.

Se siembra 1ml en fondo de la dilucin

que ha sido sometida a choque trmico
Marcela
Martnez M.Sc.
y se agrega el medio SPS
caliente.

06/12/2011

Mohos y levaduras

Incubacin en anaerobiosis

Marcela Martnez M.Sc.

Mohos y levaduras en alimentos

Importantes en alimentos
cidos y en los de baja
actividad de agua:
Frutas frescas

hongos filamentosos

Unicelulares

Se llevan a incubar las cajas en cmara

de anaerobiosis por 72 horas a 37 C,
con sobre generador de anaerobiosis e
indicador atmosfrico.

Crecen ms lentamente que las bacterias en los alimentos no cidos que

conservan humedad.

Las levaduras crecen mas rpidamente que los mohos, pero con frecuencia
junto a ellos.

Mohos son aerobios estrictos.

Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentacin).

Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de mohos y levaduras

Se desarrollan en
condiciones de aerobiosis.
A temperaturas que varan
entre 20 y 30C.

Jugos

Crecen ms lentamente
que las bacterias.

Vegetales
Quesos
Cereales
Alimentos salazonados
Encurtidos
Alimentos congelados y
deshidratados
Marcela Martnez M.Sc.

Medios de cultivo para mohos

Agar de Sabouraud

Los medios de cultivo

deben favorecer su
desarrollo pero no el de las
bacterias.
Marcela Martnez M.Sc.

Recuento de mohos y levaduras

Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC 100 UFC
Se reportan indistintamente mohos y levaduras

Agar papa dextrosa

Agar extracto de malta
Agar Czapek-Dox
Agar Micosel o micobitico
BHI + antibiticos
BHI
Marcela Martnez M.Sc.

Marcela Martnez M.Sc.

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La misin de la vida es descubrir la vocacin y luego

entregarse a ella con todo el corazn
Marcela Martnez M.Sc.

Buda

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