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Técnicas Microbiológicas Parte 1 PDF
Técnicas Microbiológicas Parte 1 PDF
El presente libro tiene la finalidad de dar apoyo a las asignaturas relacionadas con el cultivo,
manejo, aislamiento, conservacin e identificacin de microorganismos para los estudiantes de
educacin media y superior del rea biolgica.
Se presentan algunas tcnicas bsicas microbiolgicas el cual tiene como principal objetivo
poner en prctica el mtodo cientfico para despertar el inters y seguir estimulando en algunos
casos al estudiante por esta rama de la ciencia.
Como una aportacin a las estructuras didcticas de este libro, colocamos una serie de
imgenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos
comparar.
GRUPO: _______________________________________________________
CARRERA: _____________________________________________________
ESCUELA: _____________________________________________________
NDICE
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ROJO
AGUA
VERDE
GAS
AMARILLO
2.- El rea de trabajo cuenta con luz natural principalmente y/o luz artificial.
3.- Una campana de flujo laminar para la realizacin del sembrado con instalaciones de luz.
4.- Siempre al inicio y al final de nuestras actividades la mesa se limpiar con una solucin de benzal al 10 % para
desinfectarla, para ello siempre se debe tener una esponja y un atomizador con benzal, adems se debe de tener
un frasco de con benzal para cuando se necesite, este reactivo hay que prepararlo frecuentemente para evitar que
se contamine.
5.- La mesa debe tener dos mecheros con manguera en buen estado y una balanza granataria de 600 g de
capacidad para el pesado de las muestras.
6.- En el cajn de la mesa se debe tener papel aluminio, cucharas de plstico nuevas, esptulas, frasco con
torundas de algodn, hisopos, cuchillos, tijeras, pinzas, tenedores, ligas, (algunos estriles y otros no porque se
pueden esterilizar con alcohol cuando se requieran)
7.- Debe existir un frasco de 2 litros de capacidad con 1 litro de benzal para colocar las puntas de las pipetas que
se estn utilizando durante el anlisis perfectamente etiquetado (PUNTAS DE PIPETAS SUCIAS).
8.- En la mesa procurar distribuir el material que se necesita de tal manera que contemos con el espacio suficiente
para manipular las muestras tanto en el pesado de la muestra como el sembrado, de tal forma que sugerimos
apilar las placas de Petri del lado izquierdo para irlas corriendo al lado derecho.
9.- Debajo de la mesa se tendr un recipiente con una bolsa de plstico para desechar lo que no sirve, nunca las
muestras, estas se guardan hasta que el anlisis y reporte estn terminados.
10.- El rea de trabajo estril no debe tener corrientes de aire para evitar contaminaciones.
11.- El analista debe traer una bata de preferencia blanca, limpia y en buen estado, con el pelo recogido y cubierto
con una cofia, adems de utilizar un cubrebocas y guantes al manipular la muestra.
12.- Se debe de programar la fecha y hora de dar mantenimiento a las instalaciones as como la hora para la
limpieza de este.
13.- El analista debe evitar en lo posible la entrada de personal ajeno al laboratorio o en zonas donde se preparen
medios, reactivos, o rea de sembrado de muestras.
14.- Al final de cada da de trabajo el analista indicar al personal de lavado de material cual es el que tendr que
lavar y esterilizar para ser utilizado nuevamente.
15.- Al desechar las muestras sobre todo las slidas utilizar una coladera para evitar que las partculas slidas de
gran tamao se vayan por el drenaje.
b.- Su estabilidad qumica, le permite mantener el medio al estado slido prcticamente en cultivos de cualquier
bacteria
c.- Su punto de fusin, superior a 80 C, permite cultivar en medio slido bacterias termfilas que se incuban hasta
temperaturas de 65 C.
d.- Su temperatura de gelificacin, inferior a los 39 C, permite mezclarlos en forma lquida.
e.- Su elevado poder gelificante permite su utilizacin a muy bajas concentraciones, generalmente del orden del 1
al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos
f.- Su empleo en concentraciones muy bajas permite la obtencin de medios semislidos en los cuales se pueden
realizar pruebas de movilidad
En algunas ocasiones un medio de cultivo posee algunas otras sustancias como colorantes o inhibidores para
favorecer o inhibir el crecimiento de un microorganismo.
Los colorantes e indicadores son de importancia en la preparacin de la mayor parte de los medios de cultivo
diferenciales pues, pueden actuar de la siguiente manera:
a.- Como agentes bacteriostticos
b.- Como indicadores de los cambios de acidez o alcalinidad
c.- Como indicadores redox en ciertos medios de cultivo.
CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
Segn la NOM los clasifica por:
Son aquellos que contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en
las caractersticas tpicas de las colonias.
d.- Medios para cultivar grmenes anaerbicos.
Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.
e.- Medios de cultivo para medir la potencia de los antibiticos.
f.- Medios de transporte.
Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto
hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes.
g.- Medios para filtracin a travs de membrana.
Pueden ser lquidos o slidos. En el primer caso, se preparan a la concentracin usual y permiten el crecimiento de
microorganismos presentes en la membrana.
Los medios slidos tienen un contenido mnimo de agar para favorecer la difusin de nutrientes del medio de la
membrana.
h.- Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
i.- Medios especiales para cultivo de protozoarios.
C.- Especificaciones
El fabricante debe especificar en cada medio:
a.- Contenido de humedad (medio deshidratado).
b.- Composicin del medio.
c.- Mtodo de preparacin.
d.- Condiciones de presin y temperatura para la esterilizacin del medio preparado (en autoclave).
e.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso.
f.- Caractersticas de desarrollo de los microorganismos en el medio.
g.- Advertencia sobre la conservacin de los medios preparados.
h.- Resultados de las pruebas de estabilidad del medio.
i.- Resultado de las pruebas de viabilidad del medio.
j.- pH del medio preparado.
k.- Fuerza de gel (si procede).
D.- Etiquetado
El etiquetado sobre el envase del medio de cultivo debe ser en idioma espaol, con caracteres claros y legibles, de
conformidad con lo establecido en la Ley General de Salud, su Reglamento en Materia de Control Sanitario de
Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios y las normas oficiales mexicanas que se emitan al efecto,
debiendo incluir adems:
- Nombre comercial del producto.
- Uso.
- La leyenda "Agente de Diagnstico".
- Presentacin.
- Datos de conservacin y almacenaje.
- Fecha de caducidad.
- Nmero de lote.
Figura: 3 Medio slido inclinado, slido en placa y en matraz para vaciado en placa
B.- Por su uso se clasifican en:
a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes
de inters.
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Figura 10 Medio de cultivo donde podemos preparar el medio siguiendo las instrucciones del fabricante
Cepa de referencia
ATCC 25922
ATCC 25923
Resultado
Crecimiento inhibido
Colonias con pigmento amarillo caracterstico y halo de
color amarillo (manitol positivo)
ATCC12228
Colonias blancas, sin halo amarillo (manitol negativo)
S. epidermidis
ATCC 12453
Inhibicin parcial
P. mirabilis
Tabla No. 1 cepas de referencia para control positivo y negativo del agar de sal y manitol.
MTODO DE PRUEBA
La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Coleccin
Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia)
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS
Los medios de cultivo debern almacenarse en un lugar fresco y seco o en el refrigerador
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Fig. 14 Cuando al vaciar nos queden burbujas, estas se pueden romper al hacer pasar la flama del mechero sobre
ellas (Nunca hacer este procedimiento cuando ya se tenga el inoculo de la muestra)
5.- Los medios preparados se deben conservar de preferentemente en el refrigerador y protegidos con bolsas de
plstico.
6.- Todos los medios de cultivo preparados deben llevar fecha de preparacin.
7.- De cada lote preparado de medio de cultivo, incubar dos placas a 35 C durante 48 horas como prueba de
esterilidad.
b.- Medios en matraz para vaciado en placa
Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un
tapn de algodn con gasa y fundir el medio.
1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante.
2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a una
temperatura de 45 2C.
3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio.
4.- Despus de inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido
contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del
inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas y dejar solidificar.
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Fig. 16 Medios de cultivo a temperatura de 45C para realizar la tcnica de vaciado en placa
c.- Medios en matraz para vaciado en placa de mohos levaduras.
Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un
tapn de algodn con gasa y fundir el medio.
1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante.
2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a una
temperatura de 45 2C y adicionarle 1.4 ml de cido tartrico al 10 % por 100 mL de medio.
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3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio
d.- Medios lquidos en tubo.
1.- Preparar el medio de cultivo (caldo) en un vaso de precipitados y colocarlo en un dosificador regulado a 9 mL y proceder a
colocarlo en tubos de ensaye de 16 X 150 mm con tapn de rosca, previamente etiquetados y conteniendo una campana de
Durham.
2.- Procurar no cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten.
3.- Colocar los tubos en un bote de lmina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder a esterilizar a las condiciones
que indica el fabricante.
4.- Una vez esterilizados, dejar enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el refrigerador para evitar la evaporacin.
5.- Cuando se requiere tubos con otro tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3 mililitros
Falta de frescura del medio por estar bastante tiempo almacenado en el refrigerador el cual genera la
deshidratacin del medio
Efecto germicida de algunas sustancias presentes en el material de vidrio por mal lavado y enjuagado.
Que la calidad del agua destilada utilizada no sea la indicada o que presente ciertas trazas de impurezas.
Diferencias en el ajuste del pH antes de la esterilizacin o disminucin de este despus de la esterilizacin por
efecto del calentamiento o bien por parte del analista.
Aunque los medios sean de buena calidad podra en un momento dado tener sustancias que inhiban el
crecimiento de los microorganismos.
Al vaciar los medios si no se hace a la temperatura sugerida puede tener agua de condensacin y al sembrarlo
puede generarnos colonias extendidas.
Una mala esterilizacin por parte del personal que lo realice ya sea un sobrecalentamiento del medio trayendo
como consecuencia que se desnaturalicen algunas sustancias y en ocasiones pueden perder su poder diferencial
o su consistencia.
Siempre que la tcnica indique esterilizar por separado alguna sustancia se deber de realizar nunca mezclarlos
porque es una causa de error, que pudiera repercutir en el resultado de manera muy significativa.
El esterilizar los medios ms de una vez corremos el riego de perdida de agua por lo que el medio estar ms
duro de lo que debe estar, por lo tanto se deben de pesar solo cantidades necesarias.
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EXPRESIN DE RESULTADOS
Los bioindicadores no deben presentar desarrollo alguno a las 48 horas de incubacin en el bao Mara
INFORME DE LA PRUEBA
Del lote elaborado el 5 % de las cajas d Petri o matraces preparados para el vaciado en placa no deben de presentar desarrollo
alguno. Esta prueba se debe realizar siempre que se prepare material.
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Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios
pticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las tcnicas ms comnmente usadas para
realizar preparaciones para microscopios pticos.
A.- Preparacin en fresco: para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso
que no est fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre
un portaobjetos y cubrindola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al
microscopio de contraste de fases, pero antes debemos limpiar los portaobjetos de la siguiente
manera.
Limpieza de los portaobjetos y cubreobjetos
Es preferible utilizar material nuevo, pero en ocasiones presentan algo de grasa por lo que debemos
desengrasarlos con alcohol y secarlos con un pao fino que no deje pelusa, si no se utilizan en el momento se
deben de envolver con papel higinico, de esta manera quedan protegidos del polvo y nicamente se abre el
paquete en el momento de hacerlos servir.
B.- Preparacin de Frotis:
Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodn y que contenga alcohol.
a) Etiquetar la preparacin, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta ser preferentemente
pegada a la izquierda de la preparacin, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta
llevar el nombre del microorganismos, el nombre de la tincin, el equipo, el grupo y la fecha.
Mtodo A
a) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ah tomar con el asa una
pequea gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. (para este paso no se necesita
que el agua sea estril y que se tenga que esterilizar el asa)
b) Encender el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de
ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la
gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el
inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una pelcula delgada de microorganismos. Flamear el asa para
esterilizarla.
c) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rpidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la
mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operacin una vez ms. El calor deseable es
aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en el dorso de la mano. Dejar
enfriar el portaobjetos antes de teir.
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Mtodo B
a) Si se proporciona un tubo con una suspensin bacteriana, entonces encender el mechero.
b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inculo de la suspensin.
c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d) Colocar el inculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inculo por lo menos 1 cm2, y flamear el
asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.
OBSERVACIN DE UNA PREPARACIN EN FRESCO DE UN MOHO
a) En un portaobjetos limpio coloca una gota pequea de azul de algodn lactofenol
b) Con el asa coloca un poco del micelio del moho y colcale un cubreobjetos. Observa al microscopio a 40 X y
realiza un esquema de lo observado.
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TCNICAS DE TINCIN
Las bacterias no teidas muestran pocos detalles morfolgicos; el diagnstico bacteriolgico generalmente se basa
en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos es
necesario teir la clula el cual resulta de un conjunto de reacciones fisicoqumicos muy complejos, algunas
reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teido en exceso pueden
eliminarse con disolventes adecuados.
La mayora de los colorantes utilizados en microbiologa son derivados de la anilina, los colorantes estn formados
por uno o ms anillos bencnicos conectados por uniones qumicas bien definidas (cromforos) que estn bien
asociados con la produccin de color, tericamente ciertos radicales qumicos poseen la propiedad de absorber la
luz de diferentes longitudes de onda, adems poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unin
a componentes con carga contraria presentes en la clula.
Los colorantes se designan como cidos o bsicos, termino que no indican necesariamente sus reacciones de pH
en solucin, sino ms bien si una parte significativa de la molcula es aninica o catinica. Desde el punto de vista
prctico, los colorantes bsicos tienen estructuras de naturaleza cida.
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensin,
fijacin, tratamiento con colorantes y observacin.
Extensin: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es
lquida se hace directamente y, si es slida, hay que resuspenderla previamente en una gota de
H2O.
Fijacin: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las protenas para
facilitar la accin del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra
repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.
Tincin: Se realiza aadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los
procesos anteriores. Puede ser de varios tipos:
TINCIN NEGATIVA:
Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su
contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
TINCIN SIMPLE:
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tincin negativa, slo
nos permite observar la forma, el tamao y el tipo de agrupacin de las clulas.
Tomar la preparacin y colocarla en el recipiente dispuesto con el colorante que previamente les ha tocado
Tomar el tiempo por 1 minuto y con la pinza de diseccin sacarlo del recipiente.
Fig. 20 Pasos para la realizacin de una tincin simple, donde se pueden colocar varias preparaciones en un
mismo portaobjetos
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Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo
de 100X. (Previamente realizar la tcnica de iluminacin de Khler y enfocar a 10 y 40X)
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Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita vapores,
aplicar calor peridicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparacin y esperar a que se
enfre.
Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersin
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Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que
emita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparacin.
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MICROSCOPIA
El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Es el instrumento que ms
se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de
iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de
miles de veces el tamao original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaos,
formas y composiciones distintas, la mayora de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante
instrumentos.
Un microscopio ptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la
observacin de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es
una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2
mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mnimo a esa
distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la
informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del
espcimen, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la mxima
resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con longitud de onda de 540
nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos
condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no
puede aumentar la resolucin. Existen distintos microscopios pticos generales y de
investigacin que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin del
espcimen, la alteracin fsica de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que se
aplican a la imagen final.
El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminacin; 2. Sistema ptico y 3.
Sistema mecnico.
El sistema de iluminacin corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la
preparacin y esta formado principalmente por la lmpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente
frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema ptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar
la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecnico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y
cambio de las lentes as como el enfoque de la preparacin y esta formado por la base, estativo, tornillos
macromtrico y micromtrico, platina, revolver y portarevolver.
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1) Base
2) Botn de encendido
3) Diafragma de campo
4) tornillo micromtrico
5) Tornillo macromtrico
6) Condensador
7) Diafragma de iris
8) Platina
9) Pinzas
10) Brazo o estativo
11) Objetivo de 4X
12) Objetivo de 10X
13) Objetivo de 40X
14) Revolver
15) Tubo del ocular
16) Ocular
Fig.28 Fotografa de un microscopio ptico con sus componentes:
Funcin bsica de cada parte del microscopio:
a.- Sistema mecnico
Base. Pieza metlica que sostiene a todo el aparato
Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio
Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparacin, la
cual es fijada por dos pequeas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macromtrico y
micromtrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numricas que permiten ubicar fcilmente la
posicin de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparacin en forma de cruz (ejes X y Y) para su
localizacin.
Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.
Tornillo macromtrico. Permite el enfoque mayor.
Tornillo micromtrico. Permite el enfoque con precisin.
Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.
Revolver. es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz
de luz en dos haces, cada uno de los cuales se enva por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los
lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separacin entre sus ojos. Los
microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona
debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema
mecnico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micromtrico el
tubo que tiene el ocular fijo y despus se enfoca el que tiene el ocular mvil, pero en este caso sin mover el tornillo
micromtrico, girando el ocular mvil hasta encontrar el foco.
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Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, estn construidos de cristal o fluorita, poseen aumento
propio, apertura numrica y esta diseada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos
de colores y nmeros grabados sobre el tubo metlico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la
disposicin de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 2)
2.- El lado superior izquierdo indica el nmero de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numrica.
4.- El lado inferior la distancia mecnica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qu medio se hace la inmersin del objetivo (tabla 3)
1.-
2.-
Aumento de 10X
3.-
Aumento de 40 X
4.-
Aumento de 100 X
5.-
6.-
Apertura numrica
7.-
Aceite de inmersin
8.-
Anillo inferior
Pardo
Rojo
Anaranjado
Amarillo
Verde claro
Verde oscuro
Azul claro
Azul oscuro
Blanco
Aumentos totales:
El nmero total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el nmero de
aumentos que tiene el ocular por el nmero de aumentos que tiene el tubo y por el nmero de aumentos que tiene
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Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya
sea del condensador o del objetivo.
Microscopio de contraste de fase
Permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas.
Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de
una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de
mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz
principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de
fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud
de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las
partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes
claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios
se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro
porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partculas
individuales ms pequeas en las imgenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es
til para observar autorradiografas, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en
particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sfilis.
Cada uno de los microscopios tiene una funcin determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio
utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, adems en este tipo de microscopio tambin se realiza la tcnica de
iluminacin de Khler.
Figura 32 Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde
Microscopio estereoscpico
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Son aparatos con poca capacidad de amplificacin, pero muy tiles para observar especimenes ms grandes que
los que se pueden observar con un microscopio ptico
Microscopio de fluorescencia
la muestra se tie con una sustancia fluorescente que absorbe la energa de las ondas cortas
de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas ms largas (verde). Se utiliza en
inmunofluorescencia, tcnica en la cual una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo
especfico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo,
este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.
Microscopio de luz ultravioleta
La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las
molculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por
lo tanto puede alcanzar una resolucin de 0,1 m. La microscopia ultravioleta no es muy
diferente del funcionamiento de un espectrofotmetro pero sus resultados son registrados en
fotografas. La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luz
ultravioleta puede daar la retina.
Microscopio de polarizacin
Este microscopio es una simple modificacin del microscopio ptico, contiene un filtro
polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo
polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador.
Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ngulos de rotacin se usa
para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad
que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina
birrefringencia.
Exhiben birrefringencia el msculo estriado o esqueltico y las inclusiones cristaloides de las
clulas intersticiales testiculares.
Microscopio electrnico
Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite
tener un poder de resolucin muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de
0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo).
Es posible con el microscopio electrnico resolver objetos separados por una distancia de 0,003
m, comparado con los 0,25 m de uno ptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un milln
de veces.
A causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados;
incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que,
para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales de
cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o
acetona). Despus de la deshidratacin, la muestra se incluye en una resina y es aqu donde se
realizan cortes finos con un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de
diamante. Una sola clula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si
slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por
lo que se montan clulas enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El
haz de electrones es dirigido sobre la preparacin y los electrones dispersados por el metal
pesado activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. A la primera tcnica se la
denomina Microscopa Electrnica de Transmisin (MET) y a la segunda Microscopa
Electrnica de Barrido (MEB).
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10X y utilizando
micromtrico
los
tornillos
macro
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Fig. 33 Autoclave para esterilizar por calor hmedo, horno para esterilizar por calor seco y flama del mechero para
incineracin.
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Fig. 37 Muestra de una tira de esporas utilizada para diferentes tipo de esterilizacin
Mtodo de la ampolleta:
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Son ampolletas que contiene una suspensin de Bacillus stearothermophylus en medio de cultivo. La temperatura
ptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65C; dentro del medio lquido se
encuentra un indicador que es el prpura de bromocresol. Al utilizarla se debe colocar la ampolleta en el interior del
compartimiento que va a esterilizar el material, despus de terminar la esterilizacin, las ampolletas (sin abrir) se
incuban entre 55 y 65 C durante 24 h, el enturbamiento y la aparicin de un color amarillo indica una esterilizacin
defectuosa, en cambio si el color permanece igual durante varios das de incubacin el equipo esta funcionando
bien. Debe llevarse el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas
condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.
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Fig. 39 Formas de preparacin de tubos de ensaye para esterilizacin por calor seco y hmedo
CAJAS DE PETRI
a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad
de cajas envueltas, fecha, equipo, nmero de equipo de laboratorio y grupo.
Fig. 40 Pasos a realizar para preparar cajas de Petri para ser esterilizado por calor hmedo
PIPETAS
a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy
compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip
b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodn
c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con maskingtape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el nmero de equipo de laboratorio. Con
una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
Fig. 41 Pasos a realizar para la preparacin de pipetas para ser esterilizadas por calor humedo.
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MATRACES
a) Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con gasa, siguiendo las
instrucciones del profesor.
b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de algodn.
c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los
datos sobre el gorro de papel.
Fig. 42 Colocacin del tapn de algodn al matraz y gorro de papel Kraf para matraz para ser esterilizado por calor
hmedo
PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lpiz sealar con una flecha la punta.
b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
Fig. 43 Preparacin de pinzas o tijeras para ser esterilizado por calor hmedo
PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR SECO
TUBOS DE ENSAYE
a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica.
b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.
CAJAS DE PETRI
a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posicin invertida
perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL CONTAMINADO)
b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha.
Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.
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PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura
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PREPARACIN DE DILUCIONES
La utilizacin de la norma en nuestro laboratorio es la de proporcionar las guas generales para la preparacin de
diluciones para el examen microbiolgico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este campo
de aplicacin, estas guas pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y para otros requerirse
otros mtodos diferentes. Sin embargo en todos los casos donde sea posible se recomienda apegarse a estas
guas y modificarse nicamente cuando sea necesario.
La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos
contenidos en la muestra destinada para el anlisis.
La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el nmero de
microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin de la prueba en
el caso de tubos y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Definiciones
Para nuestro trabajo tenemos que:
1.- Dilucin primaria, es la suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del producto
bajo examen y mezclarda con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente.
2.- Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen
de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces
un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de
diluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo.
Procedimiento
1 Preparacin de la dilucin primaria.
1.1 A partir de muestras lquidas:
Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de microorganismos
es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.).
Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de agua de
40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa de la
muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
1.1.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un
tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una
temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
1.1.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo volmenes de 10 u 11
ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describi anteriormente
1.2 A partir de muestras slidas o semislidas.
Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C durante 18 horas
y no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis.
1.2.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica estriles de
tamao adecuado.
1.2.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.
1.2.3 Operar la licuadora de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensin completa y homognea para cada
alimento. An en los equipos ms lentos, este tiempo no debe exceder de 2 a 5 minutos, tambien podemos utilizar
un Stomacher.
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Fig. 50 Esquemas que muestras las diferentes formas de realizar las dilcuiones
La finalidad en la realizacin de diluciones es encontrar conteos en la placa para bacterias de 25 a 250 UFC/ml y
para mohos y levaduras de 10 a 150 UFC/ml
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Fig. 52 Placa que muestra el intervalo de lectura para mohos que es de 10 a 150 UFC y para bacterias de 25 a
250 UFC
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
El aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro se realiza principalmente en un medio slido. Se
inicia por la separacin de una sola clula a partir de una poblacin y requiere tambin que la colonia que surja de
esta clula se mantenga separada de otras clulas o colonias.
El aislamiento de un cultivo puro puede hacerse tambin en medios lquidos, siempre que el organismo predomine
en el material de partida. Por una dilucin en serie de la suspensin en un medio se consigue que en la ltima
dilucin se encuentren unas cuantas que al ser sembradas quedarn separadas.
En la naturaleza generalmente existen poblaciones mixtas de microorganismos, y entre ellas se establecen
interrelaciones, estas se basan en la competencia por el sustrato comn, la tcnica utilizada y el tipo de medio
seleccionado dependen de la naturaleza de la investigacin, en general podemos tener: a) se puede necesitar
tener una cosecha de clulas; b) puede ser necesario determinar el nmero y tipos de microorganismos presentes
en una muestra o c) se puede aislar un tipo particular de microorganismos de una fuente natural.
La siembra en placas, con una serie de condiciones, de una muestra del material, permitir producir colonias a un
grupo seleccionado de formas, pero har que muchos otros tipos pasen inadvertidos. Por esta razn es costumbre
sembrar en placas muestras del material usando tantos medios y condiciones de incubacin diferentes como sea
posible.
El sembrado en placa en un medio slido nos proporciona clulas inmviles o dentro del medio, las cuales estarn
separadas y de ah los podremos tener en un tubo con agar inclinado para su conservacin.
Cultivo puro
Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de una sola clula, generalmente lo realizamos para poder
estudiar las siguientes propiedades.
a.- Aislamiento por estra simple para muestras con poca cantidad de microorganismos
Fig. 53 Placas con agar nutritivo y agar eosina azul de metileno (urocultivo)
b.- Aislamiento por estra cruzada
Inocular con el asa la placa y realizar las estras tal y como se muestra en el siguiente esquema
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Fig.55 Placas de agar sangre sembrada por estra cruzada, en la segunda placa se puede observar el crecimiento
invasivo de un microorganismo mvil.
c.- Aislamiento por extensin con varilla
Para el asilamiento de bacterias, mohos y levaduras podemos realizar la tcnica de extensin con varilla, donde el
inculo sobre la placa con el medio es de 0,1 ml.
La tcnica consiste en colocar el inculo sobre el medio de cultivo, posteriormente se toma una varilla de vidrio o
de acero inoxidable del que tenga la longitud del dimetro de la placa de Petri
Esta varilla se introduce en un frasco con alcohol y se flamea a la flama del mechero por lo menos tres veces para
esterilizarla, se deja enfriar y se esparce el inoculo sobre la superficie del agar
Se deja en posicin vertical derecha por 5 minutos, y se incuba
Colocar 1 mL de la dilucin que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado.
2.-
3.Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6
en el sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporacin del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja.
4.El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente
se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
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5.Dejar solidificar el medio e incubar a 35 C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas, para el caso
de bacterias y para el caso de los mohos y levaduras de 3 a 5 das.
6.Para el caso del Agar de papa y dextrosa se debe de acidificar el medio mediante la adicin de 1,4 ml de
cido tartrico al 210 % esterilizado por filtracin a cada 100 ml de medio para que el pH sea de 3,5, este
procedimeitno se debe realizar cuando el medio este a 45C y ahora si se puede utilizar.
Fig. 58 Aislamiento de cepas silvestres mediante medios selectivos, por medio de halos de inhibicin, produccin
de amilasas o produccin de hidrlisis
El aislamiento nos sirve para obtener la morfologa colonial, microscpica y observar alguna caracterstica como
hidrlisis o hemlisis.
A. MORFOLOGA COLONIAL
Morfologa colonial en placa para bacterias
Una vez sembrada la placa la descripcin de cada una de las colonias debe incluir:
1. TAMAO: Dimetro en mm, los lmites de tamao de las colonias varan desde fracciones de milmetros hasta
10 mm de dimetro. La mayora de los microorganismos forman colonias de tamao limitado al tiempo de
incubacin.
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CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Tanto en los cultivos estticos como continuos pueden establecerse condiciones definidas, y pueden determinarse
sucesiones de distintos organismos y acumulaciones de productos metablicos. A partir de aqu pueden extraerse
los productos producidos por los microorganismos. Los cultivos mixtos pueden obtenerse tambin por la unin de
cultivos puros, tal es el caso de las cepas que producen el Yogurt.
En ocasiones es muy difcil cultivar a los microorganismos sobre todo los parsitos y creciendo en un medio
artificial, sin embargo se han ideado medios adecuados reproduciendo cuidadosamente las condiciones en el que el
microorganismo se encuentra en su medio natural, estos parmetros son el pH, tensin de oxgeno, temperatura,
los nutrientes, etc.
Para los requerimientos de sales minerales y factores de crecimiento al medio se le adiciona extractos de algn
tejido, yema de huevo, sangre, plasma, etc.
Una vez recibida la muestra es necesario seleccionar el medio de cultivo primario adecuado para el tipo de
muestra, determinarle la temperatura de incubacin, condiciones de anaerobiosis o aerobiosis para su desarrollo.
Actualmente se recomienda usar slo medios enriquecidos y la realizacin de una coloracin de Gram del
aislamiento para la seleccin de otros medios para la identificacin del microorganismo. La mayora de los
microorganismos crecen a 35 C 2 C, el crecimiento de la mayora de los microorganismos se ve potenciado por
una atmsfera de 5 10 % de CO2, pero si slo se tiene una incubadora de aire ambiental se puede mantener los
cultivos es jarra de anaerobiosis.
Cultivo en placa Petri
Se conoce como cultivo en medio slido a la que se hace en una caja Petri o tubo de ensaye con medio slido
inclinado. Cuando es en placa puede ser por estra cruzada, por estra simple o estra masiva esto depende del
objetivo del cultivo.
Cuando es por estra masiva se puede sembrar por medio de un hisopo, donde el inculo se esparce
minuciosamente en ngulos rectos respecto de la estra primaria, luego la placa se gira 90, y el inculo se esparce
para cubrir toda la superficie. En ocasiones cuando se tienen muestras con poca carga microbiana y utilizando un
medio selectivo se puede sembrar por estra simple, es ms el mtodo se puede volver cuantitativo si se utiliza una
asa calibrada de 0,01 ml de volumen y la forma de sembrar es la siguiente.
Fig. 64 Placa A estra simple, Placa B y C estra masiva y Placa D estra cruzada.
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Fig. 65 Cultivo en medio slido vertical, esquema del cultivo por picadura y en estra simple en agar slido inclinado
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
Por estras
Se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia con el asa estril y sobre la
superficie del medio se desliza sta en forma de estras.
Por picadura
Se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se
introduce en el medio picndolo longitudinalmente.
Cultivo por punto
Esta tcnica de cultivo, generalmente se utiliza cuando necesitamos una gran cantidad del moho.
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Fig. 68 Cultivo en medio liquido en matraz para mohos en agitacin y sin agitacin
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Fig. 71 Agitadora
En la naturaleza existen microorganismos que llevan a cabo la respiracin anaerobia en la cual no interviene el
oxgeno, sino que se emplean otros aceptores finales de electrones, muy variados, generalmente minerales y, a
menudo, subproductos del metabolismo de otros organismos. Un ejemplo de aceptor es el SO42- (anin sulfato),
que en el proceso queda reducido a SH2:
Para cultivar a los microorganismos anaerbicos se utilizan varios mtodos debido a que hay microorganismos
anaerobios estrictos y otros micoraerofilicos y los mtodos ampliamente utilizado son el cultivo en estufa con
atmsfera de CO2 controlado o la jarra de anaerobiosis, en donde se introducen los tubos o placas y
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Tipos de crecimiento:
Produccin de pigmentos
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Mediante la evaluacin de las caractersticas de las colonias descritas y la accin en el medio, se puede hacer una
identificacin preliminar de las diferentes bacterias aisladas en un cultivo primario. Estas caractersticas son tiles
para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificacin de los
microorganismos.
NOTA:
-Para cultivar a los microorganismos anaerbicos se utiliza una jarra de anaerobiosis, en donde se introducen los
tubos o placas y posteriormente se coloca un sobre al que previamente se le ha cortado una esquina y se le ha
adicionado 10 ml de agua destilada con una pipeta y se cierra inmediatamente.
-El sobre contiene una pastilla de borohidruro de sodio y otra de carbonato de sodio para generar H2 y CO2
- La jarra se puede meter a la incubadora sin riego de sufrir dao alguno, pues esta hecha de policarbonato
-Se puede colocar un indicador para verificar si existen condiciones de anaerobiosis
-El indicador utilizado para que se efectu la reaccin es el paladio
El bioindicador para verificar la las condiciones de anaerobiosis es:
Testigo de crecimiento aerbico es: Micrococcus luteus ATCC 9341
Testigo de crecimiento anaerbico es: Clostridium novii ATCC 9690
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