Introduccin a la Biotecnologa 2011

IIB-UNSAM

Introduccin a los
Bioprocesos
Gastn Ortiz
gas.ortiz@gmail.com

Introduccin a los Bioprocesos

Una breve historia



Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y ms tarde las

chinas comienzan a producir alimentos y bebidas
fermentadas.
Sin embargo, pasan casi 7000 aos para descubrir el
origen microbiano de la fermentacin (1856).
Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos
qumicos industriales (1900).
70 aos ms para obtener el primer organismo transgnico
(1972).
Y 5 aos ms para la obtencin de la primera protena
humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)

Introduccin a los Bioprocesos

Que es un bioproceso?
 Es todo proceso industrial que involucra la manipulacin
de organismos vivos o sus componentes celulares para
proveer bienes o servicios

Bienes: (antibiticos, hormonas, fermentos, vacunas,
cidos orgnicos, amino cidos, biocombustibles,
biomasa, etc.)

Servicios (biorremediacin, biolixiviacin, tratamiento
de efluentes)

Introduccin a los Bioprocesos

De acuerdo a su definicin tenemos: Bioprocesos

y biotransformaciones.
BIOPROCESO

Son los procesos mediante los cuales determinados SUSTRATOS

(nutrientes) son transformados por accin biolgica (microorganismos,
clulas, tejidos) en BIOMASA y diversos PRODUCTOS
Biocatalizador

Glucosa + amonio + sales + oxgeno

BIOMASA + PRODUCTOS + calor

Molculas sencillas

Molculas complejas

Fuentes de carbono y energa, fuente de

Nitrgeno y sales

BIOTRANSFORMACIN

Antibiticos, drogas, vacunas, efluente

tratado, vitaminas, cidos orgnicos,
aminocidos, protenas, hormonas,

Son los procesos en los que sustratos naturales o sintticos

son MODIFICADOS por medio de una Actividad Enzimtica
Enzimas,
clulas
inmovilizadas

Sustrato + agua
Molculas complejas
Almidn

Sustrato modificado
Molculas sencillas
Glucosa Fructosa

Un bioproceso se caracteriza entonces por:

Uso de un catalizador biolgico: Enzima,

microorganismos, clulas vegetales, clulas
animales, clulas insecto, hongos filamentosos,
algas, plantas y animales
Uso de un Biorreactor: La reaccin ocurre en
forma controlada
Artificial

Generacin de un Producto o Servicio

Upstream Process

Downstream Process

Introduccin a los Bioprocesos

Aspectos bsicos de un proceso Biotecnolgico
Upstream Processing

Eleccin del
microorganismo.
Preparacin de medio
(Formulacin).
Esterilizacin.
Preparacin del inoculo.

Process

Eleccin del reactor.

Eleccin del sistema de
operacin: Bacth; Alimentado;
Sistema Continuo; etc.
Estequeometra y cintica.
Instrumentacin y control.

Downstream Processing

Recuperacin del
producto por medio de
operaciones unitarias
(fsicas/qumicas)
Acondicionamiento y
estabilizacin del
producto
Formulacin del producto

El microorganismo productor

Tenemos varias posibilidades




Partir del microorganismo productor wild type

Microorganismos modificados genticamente
para tal fin.
Recurrir a sistemas de expresin heterloga

Microorganismos productores wild type

Ventajas


Generalmente suele ser el mejor productor.

(seleccionado por la naturaleza)

La manipulacin gentica es mnima o nula, esto

nos ahora tiempo y dinero.

Posibles desventajas


Puede que no cumpla con las normas GRAS

(Generally recognized as safe)
Su utilizacin pueden presentar dificultades al
momento del escalado y etapas danwstream. Ej
hongos filamentosos.

Algunos microorganismos productores wild type

Ac. orgnicos

Alcoholes

Algunos microorganismos productores wild type

Antibiticos

Enzimas

Sistemas de expresin heterloga

Son utilizados para la produccin de protenas

recombinantes
Ventajas




Sistemas preparados para una finalidad determinada

Amplia variedad de hospedadores
Gran variedad de herramientas moleculares disponibles
(vectores, marcadores de seleccin, etc.)

Desventajas


No siempre el producto final posee las mismas

caractersticas que el deseado.

Es por eso que debemos poner nfasis en elegir el mejor

sistema de expresin para nuestro fin

Sistemas de expresin heterloga

A tener en cuenta para la eleccin del sistema de expresin









Productividad (es difcil determinar a priori pero se un buen tip es

comenzar con una bsqueda de bibliografa)
Complejidad estructural
Modificaciones postraduccionales
Bioactividad de la protena de inters
Manipulacin del sistema de expresin
Bioseguridad del sistema de expresin

Sistemas de expresin heterloga

Sistemas de expresin heterloga:

Escherichia coli

Ventajas









Alta tasa de crecimiento

Amplio conocimiento de su gentica y fisiologa
Fcil manipulacin gentica: gran variedad de vectores y cepas disponibles,
alta eficiencia de transformacin, etc)
Fcil de cultivar
Bajo costo de cultivo
Alta acumulacin de protenas recombinantes (30% del total celular).
Lisis y recuperacin relativamente sencilla

Desventajas






No es GRAS
Contaminacin con endotoxinas
Protenas intracelular con formacin de cuerpos de inclusin
No posee modificaciones postranducionales

Sistemas de expresin heterloga:

Escherichia coli

Desventajas
 No todos los genes se expresan eficientemente debido a:








Caractersticas de la secuencia nucleotdica del gen endgeno.

Estabilidad y eficiencia traduccin del RNAm
Diferencias de uso de determinados codones de
Deficiencia en el folding proteico, capacidad limitada de formacin de
puentes S-S.

Toxicidad de la protena recombinante

No es GRAS
Contaminacin con endotoxinas
Protenas intracelular con formacin de cuerpos de inclusin
Generalmente se requiere un refolding de la protena
No posee modificaciones post-traduccionales

Sistemas de expresin heterloga:

Levaduras: (S. cerevisiae, K. lactis y P. pastoris)

Ventajas







Unicelular eucariota, fcil crecimiento y manipulacin

Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales
(glicosilacin, acetilacin, fosforilacin, eliminacin del Met1, procesamiento proteoltico de precursores)
Fcilmente escalable
Bajo o nulo nivel de endotoxinas
Protenas extracelulares e intracelulares

Desventajas



Baja eficiencia de transformacin

Hiperglicosilacin (S. cerevisiae principalmente)

Crecimiento microbiano

En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividen

hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante)
Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.
Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten
interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como
en un reactor:


Estequiomtrico:

Nos permite conocer la concentracin final de microorganismos a

obtener a partir de datos de la composicin del medio de cultivo,
saber si hay formacin de algn producto, etc.

Cintico:

Nos dice con qu velocidad se lleva a cabo el proceso.

Crecimiento microbiano (Estequiometra)

Rendimientos
Dada la ecuacin de crecimiento microbiano
S FCE + N FN + B O2

X Biomasa + P Producto + W H2O + C CO2

Para poder conocer la Estequiometra del proceso es necesario conocer los coeficientes
(S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de:

Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa,
EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de
carbono y energa consumida FCE (glucosa, glicerol, etc)

Por que el signo

negativo ?
Como seria el rendimiento para el nitrgeno ?

Crecimiento microbiano (Estequiometra)

El carbono mol (C-mol)

Si deseamos efectuar clculos estequiomtricos debemos conocer el

rendimiento en moles.


La pregunta es qu peso de clulas (o biomasa) corresponde a "un mol"?.

Experimentalmente se vio que la composicin elemental promedio de un
microorganismo es en (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85


De la cual podemos definir una "frmula mnima": CH1.79O0.5N0.2 (en la que
est representado el 95% p/p de la biomasa el otro 5% son sales)

Entoces definimos un C-mol de biomasa como la cantidad de biomasa que

contiene un tomo gramo de Carbono.

Podemos definir 1 C-mol de FCE: Ej 1C-mol de glucosa (C6H12O6) esta

representado por CH20 y pesar 30 g
En general para obtener los gramos de 1C-moles de un compuesto dado
es:
Cn Hf Oq Nm
C Hf/n Oq/n Nm/n
12+ f/n + 16.q/n + 14.m/n

Donde X tiene unidades de (cmol/g) de X

Donde S tiene unidades de (cmol/g) de S

Crecimiento microbiano (Estequiometra)

Ecuacin de crecimiento y balances de materia

Balance de Carbono: Puesto que los rendimientos estn referidos

a 1 C-mol de fuente de Carbono y energa, resulta

Como seria el balance de materia para el Nitrogeno?

Tarea plantear los

balances para el resto
de los componentes
Hidrogeno y Oxigeno

De que factores de pende el rendimiento celular? Ayuda. frmula mnima

de la biomasa: CH1.79O0.5N0.2
Yx/s es f (FCE, FN) y de cmo son estos son metabolizados
De la naturaleza microorganismo y como este aprovecha dichas fuentes

Crecimiento microbiano (Cintica)

Velocidades volumtricas y especificas

Donde

= rx/X

Los rendimientos pueden expresarse como

cocientes de velocidades
Y x/s = rx/rs = /qs

Como se ve r1 (t1) = r2 (t2), esto

nos llevara a pensar que el
microorganismo consume FCE a
la misma velocidad en ambos
tiempos. Esto es engaoso por
que al final del cultivo hay mas
clulas
A diferencia de las velocidades
volumtricas, las velocidades
especifica nos dan idea de lo que
ocurre en el cultivo

Crecimiento microbiano (Cintica)

Ecuacin de Monod dependencia de con el Sustrato limitante
El sustrato limitante es aquel que controlara la velocidad de crecimiento
del microorganismo. Ojo no necesariamente tiene que ser la FCE
Monod estudio la dependencia del con el sustrato limitante y encontr
que la incorporacin de un sustrato limitante a la clula sigue una
cintica del tipo de Michaelis-Menten
Supuestos de Monod
El proceso difusin del sustrato limitante
es rpido comparado con la cintica de
crecimiento
El sustrato es metabolizado por una
nica E que controla la velocidad de todo
el metabolismo
El proceso sigue la cintica de
Michaelis-Menten

Crecimiento microbiano (Cintica)

De que factores depende el ?
La composicin del medio de
cultivo (FCE, FN) afectan al

El sustrato limitante
S >> Ks  = m
S<< Ks  = f (S)

Crecimiento microbiano (Cintica)

De que factores depende el ?
pH

10 g/l FCE

Crecimiento microbiano (Cintica)

Mantenimiento celular

Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como

Y x/s = rx/rs = /qs

Pero esta ecuacin solo nos dice que el consumo de sustrato

solo es posible cuando hay crecimiento.
Pregunta: puede ocurrir consumo de sustrato sin que se
produzca crecimiento (generacin de biomasa)?
Resp. Si por que el microorganismo debe mantener su
homeostasis.
A este consumo de FCE sin crecimiento de biomasa se lo
conoce como mantenimiento celular (propuesto por Pirt)

rs = rs + ms.X
Otra forma de la ecuacin de Pirt

Ecuacin de Pirt

qs = ( / Yx/s) + ms.X

Divido por .X

1/Yx/s = (1
1 / Yx/s) + ms/

Yx/s es el rendimiento mximo terico el que tendra si no hay

mantenimiento celular en tanto que el Yx/s es el real el que mido

Crecimiento microbiano (Cintica)

Mantenimiento celular

Qu factores afectan el mantenimiento?

Ayuda


(qs - ( / Yx/s)) / X = ms

Resp. Todos los factores que afectan al y al Yx/s

Temperatura,
pH
Composicin del medio de cultivo particularmente
naturaleza del sustrato limitante (recordar la
dependencia de con S Monod )
Presin osmtica

Transferencia de Oxigeno. Modelo de la Pelcula

Como llega el oxigeno al

microorganismo?


1debe este disolverse en el lquido

(Burbujas). Ley de Henry

(PO2 = H.C*)


2debe transferirse desde la burbuja al

microorganismo. Ley de Fick

(JO2 = -DO2 .(dC/dX))

El modelo que combina estos dos

principios es el modelo de la pelcula,
este nos dice


Que existe una pelcula estanca de

lquido alrededor de la burbuja en donde
la transferencia de materia sigue la ley
de Fick
La fuerza impulsora de esta
transferencia es la diferencia de
Concentraciones entre el seno del liquido
y la Burbuja

Transferencia de Oxigeno Kla

Fick
Henry
C* = PO2 / H

JO2 = -DO2 . (dC/dL)

Transferencia de Oxigeno.
Factores que afectan al Kla.

Agitacin: si aumenta la agitacin aumenta el Kla por que:

 Disminuye el espesor de la pelcula (pendiente mas pronunciada)
 Disminuye el tamao de la burbuja el rea volumtrica (A)
aumenta.
Viscosidad del cultivo: si aumenta la viscosidad disminuye el
Kla por que:
 Aumenta el espesor de la pelcula
Temperatura: el Kla aumenta con la raz cuadrada de la
temperatura, dado que el coeficiente de difusin aumenta con la
temperatura.
Detergentes: aumentan el Kla dado que disminuyen la tensin
superficial forman burbujas mas chicas aumenta el rea
volumtrica de transferencia
Antiespumantes: estos aumentan la tensin superficial,
burbujas mas grandes, disminuye el Kla

Consumo de Oxigeno

Bueno sabemos que:




El suministro de oxigeno esta dado por Ro2

La velocidades de consumo de un sustrato limitante esta dada por la
ecuacin de Monod.

Al valor al cual C >> Ko se lo conoce como Cc (critico) y tiene un valor

del 15% de C*,en estas condiciones qo2 es independiente del oxigeno
disuelto.

Por lo que para que el microorganismo no note la falta de oxigeno,

es decir no se limite en oxigeno.


El suministro debe igualar durante todo el transcurso del cultivo a la

velocidad de consumo de oxigeno ro2 max o qo2 max.
Para que esto suceda el Kla de nuestro reactor tiene que cumplir con
la siguiente igualdad.

Kla = ro2 max / (C* - Cc)

Transferencia de Oxigeno
Equipo
Tubo de ensayo sin agitacin
Erlenmeyer de 1000 ml, con 10% de su
capacidad y agitacin
Reactor tipo tanque agitado

Kla
10
50-150
100-1000 segn la
agitacin

Tipo Celular

max

Kla apropiado

Cl. Animales

0.01-0.04

1-25

Cl. Vegetales

0.007-0.03

20-30

Bacterias

0.6-1.4

100-1000

Levaduras
Hongos filamentosos

0.2 - 0.6

100-1000

Bioreactores

Como ya se menciono anteriormente, el equipo donde se realiza el

proceso se denomina biorreactor o fermentador,
El mismo debe garantizar un ambiente uniforme y adecuado para el
desarrollo de los microorganismos
Para eso un biorreactor debe poseer:


Sistema de Mezclado:

Sistema de Termostatizacin:

Debe suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo

Sistema de Esterilidad:

Debe mantener constante y homognea la temperatura.

Sistema de Oxigenacin:

Debe mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de

cultivo a fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin.
Minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes.

El diseo debe ser tal que permita mantener el cultivo puro (acero pulido reactores
de mas de 100 l o vidrio menor volumen).
Fcil de limpiar y de esterilizar (por calor hmedo preferentemente)
Mantener la asepsia durante el transcurso del cultivo (filtros de aire)

Sistema de Control y Automatizacin:

Debe garantizar las condiciones estables de pH, O2, agitacin y temperatura como
mnimo, tambin puede controlarse el volumen por medio de la alimentacin, nivel
de espuma, etc.

Biorreactores de uso mas frecuentes

Tanque agitado
Ventajas


Alta flexibilidad de operacin

(controlada por agitacin y flujo
de gas).

Desventajas


Mecnicamente complejos
(agitador, eje, sellos, etc.).
En muchas ocasiones provocan
alta cizalladura.
Transferencia de O2 limitada
por el diseo de las paletas
Difciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminacin en
operaciones extendidas

Biorreactores de uso mas frecuentes

Air Lift
Caractersticas

Estructura sencilla.
Agitacin por inyeccin de aire.
Separacin fsica de las corrientes
ascendentes y descendentes.

Adecuado rendimiento de
transferencia de materia y calor.

Bajo shear.
Usos:

Cultivo de clulas animales, vegetales,

procesos con catalizadores inmovilizados,
produccin de protenas unicelulares a
partir de metanol y tratamiento de aguas
residuales.

Biorreactores de uso mas frecuentes

Columna de burbujeo
Caractersticas

Estructura sencilla.
Agitacin por inyeccin de aire.
Bajo shear.
Adecuado rendimiento de transferencia de
materia y calor.
Bajo costo.
Usos:


Produccin de levaduras de panificacin,

cerveza, vinagre, tratamiento de aguas
residuales.

Biorreactores
Agitacin mecnica (Tanques
agitados)

Agitacin neumtica (Airlift, y

Columnas de burbujeo)

Mecnicamente complejos (agitador,

eje, sellos, etc.)

Mecnicamente simples y robustos

En muchas ocasiones provocan alta

cizalladura

Muy baja cizalladura, adecuados para

cultivos frgiles

Carga de gas limitada

por inundacin del impelente
Flexibilidad de operacin (controlada
por velocidad impelente y flujo de
gas)
Difciles de limpiar; mayores
posibilidades contaminacin en
operaciones extendidas
En medios no-Newtoniano se crean
canales de gas a travs de zona
impelente

Posibilidad de admitir altas cargas de gas

(especialmente los airlift)
Limitada flexibilidad. Requieren de un
diseo ms cuidadoso
Fciles de limpiar, posibilitan operacin
asptica extendida
Distribucin ms uniforme de la turbulencia

Sistemas de operacin o de cultivo

Llamamos as al modo de operar el biorreactor, este puede

ser de forma continua o discontinua.
Suponemos mezclado
perfecto

Balance de materia
Velocidad de
acumulacin

Velocidad de
Velocidad de
salida
consumo
Velocidad de
Velocidad de
formacin
ingreso

Acumulacin de volumen
Dependiendo como sean F1 y F2 tenemos tres
tipos de cultivos.
Opera en continuo

Si F1 = F2 Tenemos un Cult. Continuo.

Si F1>0 y F2=0 Tenemos un Cult. Alimentado.

Opera en discontinuo

Si (F1 y F2)= 0 Tenemos un Batch.

Cultivo en batch

Es el cultivo mas simple

Se realiza a volumen constante
La composicin inicial del medio de cultivo determina el curso del cultivo

Ecuacin de diseo de un batch

En un Batch tenemos que

F1 = F2 =0

Por lo que

Entonces el balance de materia nos queda

Como V= cte

Batch
= 0 = cte

Descripcin matemtica del Batch en fase

exponencial

Para que nos sirve todo esto?

Para calcular el tiempo que nos
demandara el proceso.

Descripcin matemtica del Batch limitado en

Oxigeno

Que sucede si el cultivo se nos limita en Oxigeno?

 los microorganismos continan creciendo?

el tiempo del proceso se ver afectado?

Resp. 2: S , el tiempo del
Resp. 1: S, continan creciendo.
proceso ser mayor Por
 En estas condiciones el
qu?
microorganismo continua creciendo
pero quien manda a que velocidad
debe hacerlo es el sustrato limitante
en este caso el Oxigeno

Caractersticas de un cultivo batch

La duracin del cultivo batch depende

esencialmente de las condiciones iniciales del
cultivo.
Una vez inoculado el medio, la concentracin de
biomasa aumenta a expensas de los nutrientes
disponibles.
Cuando el sustrato que limita el crecimiento se
agota, finaliza el batch.
El crecimiento puede cesar tambin por la
acumulacin de algn producto toxico. (esto se puede
solucionar con un cultivo continuo)

Cultivo continuo
Batch

Se inicia
con un
batch

Cult. continuo

Ecuacin de diseo de un cultivo continuo

Cult. continuo

En un C. Continuo tenemos que F1 = F2 = F

Por lo que

= 0 = cte

V= cte

El balance de materia nos queda

Despejando V

En el estado estacionario

Donde D = F / V y es la
velocidad de dilucin.

Balances de materia en continuo

Biomasa

Sustrato: Para el sustrato tenemos

El sustrato limitante es quien controla la velocidad de

crecimiento en el C.C, por lo que podemos escribir la
ecuacin de Monod en trminos de la velocidad de
dilucin D
Combinando los balances de Biomasa y Sustrato tenemos la
dependencia de X con D

Balances de materia en continuo

Combinando los balances de Biomasa y Sustrato en el estado
estacionario, tenemos la dependencia de X con D.
Nos dice que cual ser la concentracin de biomasa en el estado
estacionario

Situacin real
cuando tengo
mantenimiento

Velocidad
ptima de
operacin 80%
del max

Dc
Dilucin critica
cuando el D es
igual al max

Cultivo continuo

Aplicaciones del cultivo continuo



Permite obtener los parmetros de crecimiento max, ms,

Ks, Yx/s, entre otros.

Permite realizar estudios fisiolgicos.

Podemos discriminar los efectos de la velocidad de

crecimiento , de la composicin del medio de cultivo y del pH
y la Temperatura, sobre la fisiologa celular del
microorganismo.

Permite realizar estudios de ingeniera metablica.

Inconvenientes del cultivo continuo



Inestabilidad gentica de la cepa en cultivos extendidos

(perdida de plsmidos)
Riesgos de contaminacin en cultivos extendidos.

Cultivo Batch Alimentado

En este tipo de cultivos el volumen
varia con el tiempo debido a la
alimentacin esto permite mantener
controlada la concentracin Ci
dentro del reactor.

El objetivo de este cultivo es

 Al igual que el continuo es evitar la acumulacin de
productos txicos o inhibitorios
 Controlar la velocidad de crecimiento de forma constante
(alimentado exponencial) o por debajo de cierto valor
(alimentado lineal)
 Incrementar la obtencin de productos como intermediarios
del metabolismo primario y protenas recombinantes
 Maximizar la produccin de biomasa o de protenas
unicelulares.

Productos

Productos de bajo peso molecular: alcoholes,

c. orgnicos, aa, nucletidos, antibiticos, etc.
 Tipo I: Productos finales del catabolismo anaerbico
 Tipo II: Intermediarios del metabolismo primario
 Tipo III: Productos del metabolismo secundario

Productos de alto peso molecular:

polisacridos, protenas, antgenos, enzimas etc.

Productos Tipo I (productos finales del

catabolismo anaerbico)

En este grupo tenemos: etanol, acido lctico, actico, butrico,

butanol y otros compuestos asociados a procesos anaerbicos.
Su formacin es consecuencia directa de la degradacin FCE
acoplada a la produccin de ATP por fosforilacin al nivel del
sustrato.(proceso anaerbico)

Siguen una cintica qp = +

 Donde es directamente proporcional al ms y con
1/Yx/s.
Por lo que para este tipo de productos busco:

Que el mantenimiento sea grande, por ejemplo vario temperatura
o tonicidad del medio.
 Que m se lo mas pequeo posible, lo logro por ejemplo limitando
en Nitrgeno al cultivo.
 En definitiva busco un Yx/s bajo de forma tal que todo el sustrato
sea destinado a la formacin de productos

Productos Tipo II (Intermediarios del

metabolismo primario)

En este grupo tenemos: aminocidos, nucletidos, vitaminas y

cidos orgnicos provenientes del ciclo de krebs.
En este caso los procesos de obtencin son aerobios.
A diferencia de los productos tipo I, no existe una dependencia
directa entre la FCE y la obtencin del producto.
Al ser compuestos intermediarios del metabolismo primario,
los microorganismos mas utilizados son los modificados
genticamente y estos se combinan con un buen sistema de
cultivo (generalmente batch alimentado o cultivo continuo).
 Ejemplo: produccin de lisina por Corynebacteriuin
glutamicum mutante en homoserina deshidrogenasa
auxotrofo para metionina y treonina

Productos Tipo II (Ej. produccin de lisina)

La estrategia para obtener
lisina consiste en:

Realizar el cultivo en
condiciones tales que la
concentracin de treonina
libre sea mnima. Cmo se
logra esto?

Limitando el cultivo en
treonina (batch alimentado
exponencial o cultivo
continuo)

Esto nos demuestra lo
importante que resulta la
eleccin del sistema de
cultivo adecuado para
nuestra cepa.

Retroinhibicin
concertada

Auxotrofo

Productos Tipo III (Metabolitos secundarios)

En este grupo tenemos: antibiticos, las toxinas, los alcaloides y las

giberelinas.

Frecuentemente los precursores especficos para la biosntesis de estos

productos son obtenidos por modificacin de metabolitos primarios.
Estos precursores suelen ser limitantes de la biosntesis.


Estos productos requieren un gasto de ATP adicional por lo que es conveniente

que el ms sea lo menor posible.
Por otra parte las fuentes de nitrgeno fcilmente metabolizadas como sulfato
de amonio no son recomendables, en su lugar se utiliza harina de soja.
Los productos de este grupo se forman cuando los microorganismos crecen a
bajos.


Es conveniente contar con microorganismos deficientes en los mecanismos de

regulacin de la sntesis de los precursores.

A altos las enzimas asociadas al metabolismo secundario se encuentran reprimidas

(represin catablica)

Finalmente estos tipos de productos producen un feed back negativo (su

acumulacin inhibe su sntesis)
Pregunta: que sistema de cultivo elijo para este tipo de productos?


El cultivo continuo o bath alimentado, ya que con esto puedo controlar el y mantener
a raya el feed back negativo del producto

Resumen productos Tipo: I, II y III

Producto

II

III

Biomasa

Tipo cultivo

ms?

Sistema de cultivo

Anaerobio

Alto

Bajo

Batch limitado en
nitrgeno
Batch alimentado
Cultivo continuo

Aerobio

Alto o Bajo
(depende del
producto)

Bajo

Batch alimentado
Cultivo continuo

Aerobio

Bajo
(la formacin de
producto consume
energa)

Bajo

Batch alimentado
Cultivo continuo

Bajo

Alto
(siempre y cuando a m
altos no forme
productos).
Ej. efecto crabtree en
S. cereviciae

Batch alimentado

Aerobio

Productos de alto peso molecular

En este grupo tenemos: polisacridos, protenas,

antgenos, enzimas, etc.

Es importante entender la cintica de formacin le estos
productos, para ello definimos:


La concentracin intrnseca de nuestro producto i (enzima,

antgeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X)

Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.protenas, UE, etc y X son los g.biomasa.

Por otra parte la velocidad neta de formacin de nuestro producto ser igual
a lo que se forma menos lo que se degrada.

La variacin de la concentracin intrnseca en el tiempo es:

Tenemos dos factores que afectan a Ri

La velocidad neta de produccin

La velocidad con la que se diluye (.Ri)

Productos de alto peso molecular

Para maximizar su produccin

Entonces
Es decir quiero un crecimiento balanceado, en donde
la velocidad de produccin debe ser igual a la de
dilucin



Cmo lo logro?
Experimentando a varios
D en un continuo
K. lactis limitado en lactosa
D (h-1)

Ri (UE/mg.biomasa)

0,1

8,25

0,25

18,3

Enzima inducible en
K. Latis

Downstream Processing
1. SEPARACI
SEPARACIN CELULAR

remoci
remocin del
componente m
ms
abundante

Es muy importante la elecci

eleccin del
PASO INICIAL, ya que es el que debe
eliminar la mayor
mayora de los
contaminantes. Los pasos
subsiguientes son empleados para
eliminar los contaminantes de menor
importancia

Intracelular

2. DISRUPCI
DISRUPCIN CELULAR

3. REMOCI
REMOCIN DE RESTOS CELULARES
Y DESECHOS

Extracelular
4. CONCENTRACI
CONCENTRACIN

5. PURIFICACI
PURIFICACIN DE ALTA RESOLUCI
RESOLUCIN

6 ACABADO

Downstream Processing
1. Remocin celular: centrifugacin y filtracin.
2. Disrupcin celular y separacin de restos celulares:

Homogenizadores: La tcnica ms recomendada para alta escala son los

homogeinizadores (Gaulin homogenizer).

Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco.

La concentracin celular no afecta la eficiencia

Es necesario refrigerar (4-5C)

Los modelos ms grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias)

Molinos de perlas

Las clulas se rompen mediante la abracin generada por pequeas perlas de vidrio
(0.3-0.4mm )

concentracin de clulas afecta la eficiencia, la concentracin ptima 30-60% peso

hmedo

Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h

Ruptura qumica o enzimtica

Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)

Downstream Processing
3. Separacin de restos celulares

centrifugacin (no adecuada)

Ultrafiltracin (300,000 500,000 o mayor)

Microfiltracin (0.1 m.)

Particin en dos fases acuosas

CDR (cell Debris Remover: Whatman)

4. Concentracin

Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.

Tcnica preferida : Ultrafiltracin

particin lquido-lquido. Extraccin con solventes

Precipitacin (sulfato de NH4)

Evaporacin o destilacin

Downstream Processing
Purificacin de alta resolucin

5.

Cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC)

Cromatografa de intercambio inico de alta
resolucin
Cromatografa de afinidad
Cromatografa metal quelante (IMAC)

Acabado

6.

Esterilizacin y estabilizacin del producto

Deshidratacin, liofilizado, estabilizacin (sales)

Downstream Processing
Cmo elegimos las operaciones y la secuencias ?

Utilizando de las reglas de oro de la purificacin



REGLA 1 Elegir procesos de separacin basados en diferentes

propiedades fsicas, qumicas o bioqumicas
REGLA 2 Separar las impurezas ms abundantes primero
Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso.
Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial

REGLA 3 Seleccionar un procesos que permita aprovechar al

mximo las diferencia entre las propiedades fisicoqumicas del
producto y los contaminantes.
Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales
impurezas
 REGLA 4 Realizar las separaciones ms caras y difciles al
final
KEEP IT SIMPLE!


Bibliografa

Microbiologa Industrial. Rodolfo Ertola,

Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone.
Encyclopedia of Bioprocess Tech [Vols 1-5,
Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation]
- M. Flickinger, S. Drew (Wiley, 1999)
Bioprocess Engineering Principles. Pauline M.
Doran
Cat. de Biotecnologa - Bioprocesos II UNQUI
Cat. de Ingeniera bioqumica UNLP