Tema 8.

Enzimas II

Bioqumica

TEMA 8

ENZIMAS II
1. Cintica enzimtica
2. Inhibicin enzimtica
3. Reacciones multisustrato
4. Regulacin enzimtica

1. Cintica enzimtica.
Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a
las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, stas
muestran (adems del fenmeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo
caracterstico que no se observa en los catalizadores no enzimticos, se trata de la
saturacin por el sustrato, entendida en trminos de ocupacin de los centros
activos de todas las molculas de enzima.
Estudiar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de una enzima
no es sencillo, si pensamos que lgicamente la concentracin del sustrato disminuye
segn avanza la reaccin. Una simplificacin en los experimentos cinticos consiste
en medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la
disminucin de sustrato ser mnima y sta podr considerarse, por tanto, casi
constante. La Figura 1 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato
sobre la velocidad inicial de la reaccin catalizada por un enzima.

Figura 1.
Cintica enzimtica. Modelo de
Michaelis-Menten.

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Este comportamiento es caracterstico de la mayora de las enzimas y fue estudiado

por Michaelis y Menten en 1913. En la cintica enzimtica de la Figura 1 se
distinguen tres fases:

Para una concentracin baja de sustrato, la velocidad de la reaccin es

directamente proporcional a la concentracin del sustrato (relacin lineal), la
cintica es de primer orden.

Para una concentracin alta de sustrato, la velocidad de la reaccin se hace

prcticamente constante e independiente de la concentracin de sustrato, la
cintica se considera de orden cero.

Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja

de ser lineal, y a esta zona se la denomina de cintica mixta.

La velocidad de una reaccin catalizada (V) nos indica la cantidad de sustrato

consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el Sistema Internacional
se designa por U (unidad de actividad enzimtica) y corresponde a los moles de
sustrato consumidos en 1 min, o bien a los moles de producto formado en 1 min.

U mol S/min mol P/min

La curva que expresa la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad

inicial tiene la misma forma para la mayora de las enzimas; se trata de una
hiprbola rectangular, cuya expresin algebraica viene dada por la ecuacin de
Michaelis-Menten, donde muestra la relacin entre la velocidad inicial (Vo) y la
concentracin de sustrato, S.

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Los trminos Vmax (velocidad mxima) y Km (constante de Michaelis) son dos

parmetros cinticos caractersticos de cada enzima, que pueden determinarse
experimentalmente.
La velocidad mxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad de reaccin se hace
independiente de la concentracin de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad
alcanza un valor mximo. Este valor depende de la cantidad de enzima que
tengamos.
La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentracin de sustrato a la cul la
velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Este parmetro es
independiente de la concentracin de enzima, y es caracterstico de cada enzima
segn el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km tambin indica la afinidad que
posee la enzima por el sustrato, siendo sta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto
menor sea la Km menor ser la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad
de la velocidad mxima, por lo que mayor ser la afinidad del enzima hacia ese
sustrato.
A partir de la ecuacin de Michaelis-Mente podemos explicar matemticamente las
tres fases de la curva de la figura 1.

As:

A baja [S], es decir si Km >>> [S], el trmino Km+[S] podemos aproximarlo a

la Km, quedando un expresin del tipo:
V = k [S]
Esta es una cintica de primer orden, que se caracteriza por una variacin
lineal de la V respecto al tiempo, como tiene lugar en la primera fase.

A altas [S], es decir, Km<<<<[S], despreciaramos Km frente a [S], con lo que

V = Vmax (que sera constante); la cintica es de orden cero y se habra
alcanzado la saturacin por sustrato, como ocurre en la fase final.

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El tramo intermedio, en el que la [S] Km correspondiente a una cintica de

orden mixto y se ajusta a la ecuacin de Michaelis.

En muchos casos es de vital importancia

conocer estos parmetros cinticos. En
principio, podran obtenerse de forma
poco rigurosa a partir de la curva de
Michaelis Menten, para lo cual sera
preciso primero obtener el valor de la
Vmax y despus, teniendo en cuenta que
la Km es la concentracin a la cual la
velocidad es la mitad de la velocidad
mxima, podramos obtener su valor. Pero existen mtodos grficos ms fiables que
facilitan el clculo preciso de la Km y la Vmax. Los clculos se hacen en base a
transformaciones matemticas de la ecuacin de Michaelis; una de las expresiones
ms utilizadas es la representacin de Lineweaver-Burk (Figura 2). En esta forma de
clculo se representa 1/V frente a 1/S, esto es la inversa de la velocidad frente a la
inversa de la concentracin (de ah que tambin la representacin sea conocida
como de dobles inversos), as se obtiene una recta cuya interseccin con el eje X es
1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax.

Figura 2.
Cintica enzimtica. Representacin de Lineweaver-Burk.

De esta forma, y una vez hecha la representacin, podemos extrapolar el valor de X

para Y=0, o el de Y, cuando X=0, y obtener haciendo el inverso de los valores (y
teniendo en cuenta el signo) el valor de Km y Vmax.

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La obtencin de la Km y la Vmax de una enzima, es importante no slo porque son

parmetros que la identifican, sino tambin por motivos que, en ocasiones, pueden
ser de vital importancia. Por ejemplo, algunos tipos de leucemia (enfermedad en la
que los glbulos blancos proliferan anormalmente) pueden evitarse por la
administracin de una enzima, la Asparraginasa, que cataliza la reaccin de
hidrlisis de la asparragina (Asn) a cido asprtico (Asp).
Asn + H2O <======> Asp + NH+4
Este descubrimiento condujo a la conclusin de que la Asn presente en la sangre es
un principio nutritivo para el crecimiento de los linfocitos malignos; el problema
apareci cuando se utilizaron distintas fuentes de asparraginasa, descubrindose
que no todas eran eficientes. Al final se encontr la razn. Estas enzimas, de
diferentes fuentes (animal, vegetal o microbiana), tenan diferente Km respecto a la
Asn. Como la [Asn] en la sangre es muy baja, slo aquellas enzimas con el valor de
Km muy bajo (una mayor afinidad por el sustrato) seran capaces de provocar la
hidrlisis de la Asn. As, se comprob al obtener los parmetros que la enzima que
presentaba menor Km para la Asn era la de una bacteria (E. coli), y fue la que se
utiliz para controlar la enfermedad.

2. Inhibicin enzimtica
Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad
cataltica, ralentizando o paralizando la reaccin enzimtica. A estas sustancias se
las denomina inhibidores enzimticos. Teniendo en cuenta que las reacciones
qumicas en la clula estn catalizadas por enzimas, es fcil intuir el papel de
muchos inhibidores enzimticos que actan como frmacos, antibiticos o
conservantes; otros pueden ser txicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina
(acetilsalicilato) es un analgsico que inhibe la enzima que cataliza el primer paso en
la sntesis de prostaglandinas, implicadas en la produccin del dolor.
Se conocen dos tipos principales de inhibicin: la reversible y a la irreversible. La
primera implica una unin no covalente del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede
revertirse. En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma
covalente y permanente.

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Inhibicin reversible: los distintos modelos de inhibicin reversible implican la unin

no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio
de los cuales reducen la actividad enzimtica y en la forma en que afectan a la
cintica de la reaccin. Entre ellos estn la inhibicin competitiva, la acompetitiva y la
no competitiva.

El inhibidor competitivo, es una sustancia similar en estructura al sustrato,

con quien compite por el sitio activo de la enzima.

E+S

K1

ES

K2

E+P

K-1

ES+I

Ki

EIS

Figura 3.
Inhibicin competitiva. Clculo de
parmetros cinticos mediante la
representacin de dobles inversos.

Como
consecuencia,
aunque
la
velocidad mxima no se altera, para
alcanzarla sera necesario poner ms
cantidad de sustrato en el medio de
reaccin, lo que se refleja, en la
correspondiente curva de Michaelis,
como un aparente aumento de la Km (la
enzima en presencia del inhibidor
perdera afinidad por el sustrato). La
representacin de dobles inversos
(Figura 3) permite observar claramente
este tipo de inhibicin.

As cuando se realizan distintos estudios a varias concentraciones de

inhibidor, obtenemos, mediante la representacin de dobles inversos, distintas
rectas que se cortan en el mismo punto (para X=0), indicando que la Vmax no
se altera, pero la Km (y por lo tanto la afinidad) aparentemente s, pues
existen variso puntos de corte para y=0, por lo tanto aparentemente varias
Km, que adems van aumentando con la concentracin del Inhibidor.

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La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concentracin respecto

a la del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor ste bloquear los centros
activos de las molculas de enzima, resultando una inhibicin total. No
obstante, el proceso es reversible si se procura exceso de sustrato, que
desplazara totalmente al inhibidor.

El inhibidor no competitivo puede combinarse tanto con la enzima libre

como con el complejo enzima-sustrato, sin afectar al sitio activo de la enzima.

E+S

K1

ES

K2

E+P

K-1

E+I
ES+I

Ki
Ki2

EI
EIS

Al no unirse el inhibidor al sitio activo, no se afecta la afinidad de la enzima

por el sustrato y en este caso la Km no se altera y la Vmax disminuye, como
puede observarse en la representacin de dobles inversos (Figura 4), el punto
de corte de las rectas ahora esta sobre el eje X, (cuando y=0), mientras que
hay distintos punto de corte con el eje Y, como se aprecia la Vmax disminuye
con el inhibidor.

Inhibicin no competitiva

Con I

1/V
Figura 4.
Inhibicin no competitiva. Clculo
de parmetros cinticos mediante la
representacin de dobles inversos.

Sin I

1/V max

1/Vmax
- 1/Km

1/[S]

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El inhibidor acompetitivo reacciona con la enzima en un punto distinto al

centro activo, pero slo en el caso de que sta est unida al sustrato
formando el complejo ES; de esta forma impide que la enzima desarrolle su
actividad cataltica.

E+S

K1

ES

K2

E+P

K-1

ES+I

Ki

EIS

Figura 5.
Inhibicin acompetitiva.
Clculo de parmetros cinticos
mediante la representacin de
dobles inversos.

Tanto la Vmax como la Km se alteran en la misma proporcin, esto se

manifiesta en la representacin de dobles inversos como rectas paralelas y
por lo tanto con la misma pendiente (Figura 5). Se observa cmo se produce,
una disminucin de la Vmax y curiosamente, tambin, una disminucin
aparente de la Km.

En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la

inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son
sustancias txicas naturales o sintticas.

E+S

K1

ES

K-1

E+I

EI

K2

E+P

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Se trata de sustancias que reaccionan con algn grupo funcional importante para la
catlisis, bloquendolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En
muchos casos la interaccin se produce a travs del sitio activo, impidiendo de
manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarn, que
inhibe irreversiblemente la acetilcolinesterasa, enzimas implicadas en la transmisin
del impulso nervioso, al competir con su sustarato, la acetilcolina (un
neurotransmisor) y la inhalacin del gas causa parlisis rpida de las funciones
vitales.
En la inhibicin irreversible, cuando el inhibidor afecta al sitio activo se observara
una situacin similar a la inhibicin competitiva, una disminucin de la Vmax y un
aumento aparente de la Km, si bien el proceso sera completamente irreversible por
sustrato, incapaz ste de desplazar al inhibidor del sitio activo. La inhibicin
enzimtica por modificacin covalente constituye adems una importante forma de
regulacin metablica, como veremos en prximos apartados.

3. Reacciones multisustrato
En este captulo hemos estudiado reacciones catalizadas enzimticamente en las
que interviene un solo sustrato que se transforma en porducto, se trata un
mecanismo relativamente simple que podra ajustarse a reacciones catalizadas por
algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es importante tener
en cuenta que la gran mayora de las reacciones son multisustrato y suelen dar
varios productos.
Cuando una enzima une dos o ms sustratos y libera mltiples productos, el orden
de los pasos para a ser una caracterstica importante del mecanismo de reaccin.
Hay distintos mecanismos que explican este tipo de reacciones, veamos varios
casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se obtengan dos productos P1 y
P2.
a) Unin ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes
de que el segundo sustrato pueda unirse a la enzima.

S1
E

[ES1]

S2

[ES1S2]

E + P1 + P2

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b) Unin aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos
puede ser el primero en unirse a la enzima.

[ES1]

S1

S2
[ES1S2]

E
S2

[ES2]

E + P1 + P 2

S1

c) Mecanismo ping-pong: en este caso primero se une un sustrato, se libera el

primer producto, y a continuacin se une el segundo sustrato para as liberar
el segundo producto.

S1
E

[ES1]

P1 S2
E*

[E*S2]

P2
E

4. Regulacin enzimtica
Una caracterstica que diferencia las enzimas de los catalizadores qumicos
convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede
ser ms o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulacin:
Nivel de sntesis: implica una regulacin gentica, en este caso se trata de protenas
inducibles que se sintetizan cuando las requiere el organismo, este tipo de
regulacin se estudiar en el Tema 11.
Nivel de actividad: que las molculas de enzima existentes estn ms o menos
activas. Puede llevarse a cabo por factores extrnsecos a la enzima. Dicha
regulacin puede venir dada por una variacin en la concentracin celular del
sustrato o de inhibidor, como se ha indicado en apartados anteriores, o bien, por
cambios de temperatura o de pH, en este caso se debe a que las enzimas poseen
un pH ptimo y una temperatura ptima de trabajo.

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pH ptimo

Actividad (U)

Actividad (U)

T ptima

Temperatura

pH

Ejemplo del efecto del pH o la T sobre la actividad enzimtica

La variacin del pH o la T afectan a la actividad enzimtica, en algunos casos, como

los de la figura los efectos pueden ser bastante drsticos, mientras que en otros
casos el rango de T o pH optimo puede ser mayor, sin que afecten a la actividad.
No obstante, suele ocurrir que una vez superado el ptimo se produzca una
desnaturalizacin irreversible de la enzima
Tambin ocurre que la regulacin puede ser provocada por factores intrnsecos a la
propia enzima; en este caso se habla de enzimas reguladoras, enzimas que por su
propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulacin. Estn
especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a seales
externas. En la clula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios
pasos enzimticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que
determina la velocidad de toda la ruta. La modulacin de las enzimas reguladoras
ocurre mediante diferentes mecanismos:

Enzimas alostricas. Funcionan mediante la unin reversible no covalente de

compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una
activador (modulacin positiva) que acelere el proceso, o un inhibidor (modulador
negativo). Este modulador puede se el propio sustrato de la reaccin (alosterismo
homotrpico) o una otra sustancia (alsoterismos heterotrpico). Normalmente se
trata de enzimas multimricas, de tal forma que la entrada del primer sustrato
facilita (acelera) la entra del siguiente, y normalmente ocurre que el sito activo y
el regulatorio se encuentran en distintas subunidades. En esos casos la cintica
que presenta la enzima es distinta a la clsica de Michaelis-Menten, apareciendo
una sigmoide como muestra la siguiente figura:

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Enzima alostrica

Enzimas interconvertibles. Se trata de enzimas reguladoras en las que el proceso

de control de la actividad se realiza gracias a una modificacin covalente
reversible, en el que estn implicadas tambin otras enzimas que se encargan de
hacer la modificacin, en base a la concentracin celular de determinados
metabolitos. Un ejemplo, claro es el caso de la enzima piruvato deshidrogenasa,
que se estudiar en profundidad en el Tema 14, y que su regulacin implica,
entre otros factores, la fosforilacin /defosforilacin de la enzima. De tal forma
que cuando la enzima es fofosforilada pierde su actividad y cuando se defosforila
recupera su actividad.
Enzima - Pi

Piruvato
deshidrogenasa
quinasa

Inactiva

Piruvato
deshidrogenasa
fosfatasa

ATP

Pi

Enzima

Activa

Tambin son posibles, la regulacin enzimtica mediante protenas reguladoras

que se unen a la enzima, o la regulacin por eliminacin proteoltica de pequeos
segmentos peptdicos, aunque en este caso el proceso es irreversible.