REACTORES ENZIMATICOS EN EL PROCESAMIENTO DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES: Residuos lacteos con B-galactosidasa inmovilizada Julio A, Solis-Fuentes* Carmen Durdn-Dominguez** Resumen En este trabajo se resalta la importancia de la tecnologia enzimdtica como una rama de la biotecnologta, particularmente en lo que se refiere @ enzimas inmovilizadas. Su uso ha posibilitado et procesamiento econdmico de muchos materiales bioldgicos como los residuos de la agroindusiria y de la industria de ldcteos en espectfico. Se hace una revision de las fundamentos tedricos para el diseito de reactores enziméti- 05, ast como de algunos resultados de investigacidn que se reporian en la literatura sobre la B-galactosidasa inmovilizada para el procesamiento de sweros y permeatos de leche. Abstract This paper deals with the application of biotechnology to enzyme technology, parti- culary to immobilized enzymes, Its use for the recycting of biological materials present in wastes has become a bi asset. A revtew of the fundamentals for the design of enzymatic reactors is presented. As an example, the production of inmobilized B-galactosidase and its wtilization for mitk permeates and whey processing is given. Introduccién no de los aspectos mis relevantes de la actual revolucién tecnolégica, ha ido la creciente produccién y uso de enzimas a escala industrial. Se ha estimado que alrededor de 65 000 toneladas de diversas enzimas se produ- on én el mundo durante 1981 y 75 000 toneladas durante 1985 (Murray, 1985). La utilizacién de enzimas en la elaboracion de alimentos es muy antigua; su * Instinto de Ciencias BAsicas. Universidad Veracruzans, ** Depantancato de Alimentos ¥ Biotecnologia, F.QU.N.AM 85uso en la fabricacién de pan, queso y bebidas alcohdlicas es bien conocido desde las civilizaciones mds viejas. Durante Jos tiltimos lustros, se ha venido desarro- Iando un buen ntimero de procesos que involucran a las enzimas como cataliza- dores en Ja produccién de diversos productos. Sin embargo, su uso ha estado Fimitado a algunos productos alimenticios y firmacos. Muchas de esas limitacio- nes han sido salvadas por el uso de enzimas inmovilizadas dadas sus ventajas econémicas y operativas. Ala fecha son pocos los procesos basados en enzimas inmovilizadas que operan en la industria: de éstos, casi todos incluyen reacciones enzimfticas simples como las de hidrdlisis ¢ isomerizacion, Eluso de la B-galactosidasa para hidrolizar la lactosa, es ampliamente estudiado actualmente por miiltiples grupos de investigacién en el mundo, motivados principalmente por encontrar soluciones al problema de intolerancia a la lactosa, al reuso econdmico de sueros y permeatos de leche y a las limitaciones fisicoqui- micas de la lactosa en el desarrollo de algunos productos alimenticios. E] presente trabajo hace una revisién de algunas de las caracteristicas fisico- quimicas, cinéticas y econémicas de la enzima lactasa y de su uso en forma inmovilizada para la hidrdlisis de la lactosa, Ante Ja consideracién de que los residuos de Ja industria lactea estén en México incipientemente aprovechados y para los cuales, en otros paises del mundo, la industria ha adoptado desarrollos tecnolégicos para su reuso econdmico, apoyados éstos en procesos realizados en reactores enzimdaticos con enzimas inmovilizadas. Sin duda la adopcién y crea- ci6n de tecnologfas modernas en México requiere de la difusi6n de conocimientos actuales de la biotecnologfa e ingenieria de Jos alimentos. Enzimas y cinética enzimatica Lasenzimas son protefnas especializadas en lacatdlisis de reacciones bioquimicas. Destacan por ser extraordinariamente especificas con un poder catalftico mucho mayor que el de los catalizadores elaborados por el hombre (Lehninger, 1984). Berzeliuz, Pasteur y Buchner son nombres relevantes en el nacimientoe historia de las ciencias relacionadas con el conocimiento de los procesos fermentativos y de accidn enzimética. En la actualidad se conocen mas de 2000 enzimas diferentes. Los principios generales de la cinética de reacciones quimicas, son aplicables en lo general a las reacciones enzimaticas, con un rasgo importante y diferente: la saturaci6n de la enzima con el sustrato. La teorfa cinética de la accibn enzimatica fue estudiada por Michaelis y Menten, ampliada después por Briggs y Haldane. El andlisis de Michaelis-Menten es fundamental para el andlisis cuantitativo de la cinética e inhibicién de enzimas. 86Este modelo se ha desarrollado para el caso més sencillo de una reaccién en la que existe un solo sustrato. E! modelo supone Ia formaci6n primero de un complejo enzima-sustrato, A-E, mismo que se transforma en un producto P, liber4ndose la enzima durante un proceso con etapas reversibles. La ecuaci6n de Michaelis-Menten es entonces la ecuacién de rapidez 0 veloci- dad para las reacciones catalizadas por enzimas, actuendo sobre un solo sustrato: Vmax S = Yoo -dS/dt O=K 4S en Ja que Km es la concentracién del sustrato cuando Ia velocidad inicial Vo es fa mitad de la velocidad maxima (Vmax). Es de observarse que Km y Ymax no tienen un valor fijo, sino que puede variar con la estructura del sustrato, el pH y la temperatura. La determinaci6n de los parametros cinéticos, Km y Vmax, es fundamental en ¢] estudio de los procesos enziméticos naturales y aplicados, su cuantificacién se realiza experimental mente registrando, para cada caso, la velocidad inicial alean- zada cuando se varfa la concentracién del sustrato. El ajuste de los datos experi- mentales al modelo de Michaelis-Menten se realiza con ayuda de las transforma- ciones del modelo conocidas como de Lineweaver-Burk, de Eadie-Hofstee, de Hanes y Woolf, entre las mayormente usadas. Factores que afectan la actividad enzimatica Efecto de] pH, temperutura e inhibidores La relacién entre el pH y la ectividad de cualquier enzima depende del comportamiento dcido-base de la enzima y del sustrato. Valores extremos de pH comfinmente las inactivan y/o desnaturelizan. En el intervalo de pH en el que la inactivaci6n es reversible el proceso imvolucra una ionizacion reversible de grupos funcionales en el sitio o 4reas activas de la molécula (Richardson e Hislop, 1985). Las enzimas generalmente exhiben un mAximo de actividad en un valor de pH particular. En su mayoria éstas muestran Gptimos de actividad en pHs de 4.5 a 8.0 Al igual que sucede con todas las reacciones quimicas, la rapidez de las reacciones enzimiaticas s¢ incrementa con la temperatura, dentro del intervalo en el que la enzima permanece estable y activa. El modelo de Arrhenius —que en lo general describe este proceso satisfactoriamente- observa desviaciones cuando se aplica a reacciones bioquimicas en las que intervienen enzimas. En los casos 87tfpicos de comportamiento se pueden distinguir uno que esta referido a la activa- cién de la enzima y otro referido a su inactivaci6n (Peterson y Johnson, 1978). A partir del estudio de los inhibidores enzimaticos se ha obtenido informacién de importancia sobre los mecanismos de la catélisis enziméatica, la especificidad de las enzimas por el sustrato, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo y en el mantenimiento de Ja conformacién activa de la molécula de la enzima. Los tipos de inhibicién enzimética mas importantes son: competitiva, acompe- titiva, no-competitiva y por exceso de sustrato. E] mecanismo y efecto de cada tipo ha sido estudiado ampliamente y puede distinguirse experimentalmente (Robert, 1977). Cuando sucede una inhibicién irreversible, se trata propiamente de una inactivacién de la enzima y se da cuando los agentes son capaces de unirse covalentemente y, con ello, modificar permanentemente a un grupo funcional necesario para la catilisis. Enzimas inmovilizadas Métodos de inmovilizactén La inmovilizacién de enzimas no es mas que un modo de mantener por algén medio quimico, fisico o fisicoquimico fijas las moléculas de la enzima dentro de un sistema reaccionante sin que se alteren significativamente sus propiedades cinéticas. Actualmente existen muchos métodos para la inmovilizacién de enzimas, algunos de los mds conocidos son mediante adsorci6n, enlace covalente, atrapa- miento o encapsulacién y enlazamiento cruzado. La figura 1 muestra en un esquema los métodos més usados para la inmovilizaci6n de enzimas. En laadsorci6n la enzimaes retenida en un soporte sélido por fuerzas diferentes alenlace covalente (por ejemplo, enlace iénico, enlaces de hidrégeno o interaccién hidrofdbica). La fuerza del enlace es relativamente débil y sumamente sensible a cambios de pH, fuerza idnica y temperatura. El método tiene la gran ventaja de ser sencillo. Los soportes m4s usados son polimeros orgénicos, sales minerales, 6xidos metélicos y varios metales siliceos o intercambiadores idénicos, DEAE-Sep- hadex y DEAE celulosa. El enlace covalente se logra mediante reaccién de la enzima con algin agente quimico adecuado. Las reacciones de acoplamiento deben ser relativamente especfficas para una clase de grupo funcional: formacién de enlace peptidico, alkilacién, formaci6n de enlace diazo y enlace iso-urea para carbohidratos activa- 88A) Adsorci6n B) Adsorcion y enlazamiento cruzado COO : —= et C) Atrapamiento D) Copolimerizacién dats 946 ) Microencapsulacion F) Intercambio ionico x PPPS 9 TorehTy G) Enlazamiento c7uzado H) Enlace covalente (=) E=ENZIMA R=RADICAL Figura 1. Métodos de inmovilizacién (Peterson, 1978). 89dos en cianobromuro. Antes de que el acoplamicnto tenga lugar, los grupos funcionales sobre el soporte tienen que ser activados. Durante el atrapamiento y encapsulacién las moléculas de enzima se mantienen libres en la solucién, pero restringidas en una c4psula por una red o membrana de gel. La estructura del polfmero que atrapa debe ser lo suficientemente fuerte para prevenir el] lavado de la enzima y a la vez lo suficientemente abierto para dejar penetrar el sustrato y salir el producto. La técnica m4s ampliamente usada es la oclusién de enzimas o células microbianas en poliacrilamida. La acrilamida es polimerizada en presencia de un enlazador cruzado en un medio acuoso conte- niendo la enzima disuelta. El bloque de gel resultante puede ser mec4nicamente dispersado en particulas del tamafio deseado. Para ¢l enlazamiento cruzado Jas enzimas pueden ser inmovilizadas dentro de largos agregados usando reactivos bi o multifuncionales. Aun cuando el método es sencillo, noha sido ampliamente utilizado, debido a Las dificultades enel control del tamaiio y propiedades mec4nicas de los agregados. Enzimas adsorbidas sobre soportes sdlidos han sido enlazadas para incrementar la estabilidad de la enzima inmovilizada. En casi todos los casos el agente de enlazamiento cruzado es e] glutaraldehido, un dialdehido que reacciona con aminas primarias para formar enlaces estables. Propiedades cinéticas de la enzima inmovilizada Las propiedades de un sistema de enzima inmovilizada pueden ser bien diferentes de aquellas que corresponden a sistemas en solucién. Los cambios pueden atribuirse a alteraciones de la enzima por si misma o a Ja naturaleza fisicoqufmica del soporte. Estabilidad La gran mayoria de las enzimas, cuando se inmovilizan, muestran una mayor estabilidad a la que presentan en solucién. Este incremento en estabilidad, puede deberse a una reduccién en la inactivacién conformacional, asfcomoalareduccién al ataque de solutos debido a efectos estéricos. Pueden distinguirse diferentes tipos de estabilidad; de éstos, la estabilidad operacional es el paraémetro de ingenierfa mds relevante. El incremento en la estabilidad, cuando existe, disminuye el costo de operacién al prolongarse los periodos de recarga. La estabilidad operacional se expresa en términos de la vida media de la enzima. Por otra parte, la estabilidad durante el almacenamiento es importante durante operaciones intermitentes. 90Laestabilidad observadade laenzima inmovilizada por efecto de variablestales como la temperatura y pH del medio de reaccién, 0 como por efecto de agentes desnaturalizantes como la urea, puede también variar con respecto a la actividad de la enzima en solucién. Km y Vmax Los pardmetros cinéticos de la enzima inmovilizada, Km y Vmax, observados son cambiados en relacién a los observados para el catalizador en solucién; estos valores aparentes son el resultado de efectos estéricos, del microambiente de reaccién y de los fenédmenos difusionales que incluye e] proceso global de reaccién. Las limitaciones estéricas sobre la expresién de la actividad de la enzima inmovilizada se dan cuando el sistema reaccionante involucra sustratos y/o pro- ductos de alto peso molecular. Ha sido demostrado, por ejemplo, que diferentes mapas de péptidos se logran cuando una proteina en particular es hidrolizada por una enzima en solucién o inmovilizada en procesos separados. Los efectos del microambiente de reaccién se producen debido a que el ambiente en la vecindad de una partfcula de catalizador es diferente al existente en el seno de la soluci6n que contiene al sustrato. Esto en términos de concentra- cién implica que si, por ejemplo, la enzima estd unida a un soporte polieléctrico, las interacciones electrostaticas provocar4n una distribucién desigual de los iones entre las fases sélida y lfquida. En un soporte polianidnico, la concentracién de iones cargados positivamente ser4 mayor en sus vecindades que en el resto de la solucién. Consecuentemente, el pH en la vecindad del soporte ser mAs bajo y el perfil de actividad de la enzima inmovilizada se correr hacia un valor mAs alto. Con un polimero policatiénico, sucederé la situaci6n opuesta. E] valor de Km puede ser similarmente influenciado si un sustrato cargado es procesado por una enzima unida a un policlectrolito. Cargas iguales entre soporte y sustrato resultardn en un valor de Km aparentemente alto debido a las fuerzas electrostaticas repulsivas. Cargas opuestas bajarin el valor de Km observado, Estos efectos electrostaticos pueden ser contrarrestados mediante un ajuste de la fuerza idnica de la solucién amortiguadora. Los efectos difusionales sobre los parimetros cinéticos de la enzima inmovili- zada pueden ser externos a la particula del catalizador e internos a ella. Los primeros son el resultado de la formacién de una capa estatica de fluido, la capa de difusién de Nernst, alrededor de la particula. El grueso de lacapa tiene un efecto inversamente proporcional a la rapidez o velocidad de difusién de la solucién de los alrededores. De este modo, un incremento en la velocidad de agitacién en un 91proceso por lotes o de la velocidad de flujo laminar en un reactor empacado, reduce la resistencia a la difusi6n y el valor aparente de Km desciende. Las resistencias difusionales internas se deben a la estructura interna de la particula del catalizador en términos del ntimero y tamafio de poro. Tales resisten- cias reducen sustancialmente la actividad de la enzima inmovilizada. Las resisten- cias internas se disminuyen mediante una reducci6n del tamajio de particula. Sin embargo, tal reduccién esté limitada por el efecto que ella ocasiona sobre la caida de presién en el reactor. Reactores con enzima inmovilizada El control de la velocidad global La velocidad de formacién del producto en un sistema continuo con enzimas inmovilizadas, depende globalmente de la cinética de la reaccién y del tipo y caracterfsticas del fendmeno difusional involucrado. De ellos, el proceso mas lento sera el que determine la velocidad de obtencién del producto. Loanterior implica que sien un sistema con enzimas inmovilizadas la velocidad dela reaccién es mayor que la velocidad de difusin de los reactivos y/o productos, el fenémeno difusional sera el que controle la velocidad del proceso global y, consecuentemente, los problemas difusionales, internos 0 externos, deberén ser determinados y resueltos convenientemente. Mateméticamente, la rapidez o velocidad de la reaccién enzimética estaré representada por: -dS/dt=tp=kS? En la que k es la constante especffica de velocidad de reaccién, Ss es la concentracién del sustrato en la superficie del catalizador y n es e] orden de reaccion, Por su parte, el fenémeno difusional estard representado por la expre- sién: -dS/dt=1 p = Km am (So-Ss) En la que km es el coeficiente de transferencia de masa, am el drea de transferencia correspondiente, So la concentracién de] sustrato en el seno de la solucién y Ss la concentracién del sustrato en Ja superficie de la particula del catalizador, en este caso, de la partfcula de la enzima inmovilizada. 92SiK>>km, Ss—+ 0, debido a la alta velocidad con que es consumido por la reacci6n y la lenta difusidn de éste desde el seno de La solucién a la superficie del catalizador, por tanto, el proceso global de formacién del producto estar4 contro- Jado por la velocidad de difusién del sustrato. Los problemas difusionales tanto internos como externos han recibido una gran atencién en el estudio y aplicacién de los sistemas productivos con enzimas inmovilizadas (Engasser y Horvath, 1981; Doraswamy y Shanna, 1984). Los problemas difusionales se presentan con mayor frecuencia en sistemas enziméti- cos de este tipo en los que la actividad de la enzima es alta y donde las caracteris- ticas del sustrato y del producto resultan en una baja difusividad. De hecho, la difusividad en los liquidos tiene valores pequefios, situacién que se amplia si se trata de sustratos con moléculas de gran tamaiio o fluidos con viscosidad alta. Disefio de reactores enzimaticos El diseiio de reactores para procesos catalizados por enzimas se fundamenta en el tradicional de reactores para procesos quimicos con catalizadores heterogéneos. ‘Los reactores enzimaticos pueden operar en lotes durante un proceso discontinuo © también funcionar en procesos de flujo continuo; en este tiltimo caso se distinguen dos variantes extremas: el reactor de tanque agitado continuo (RTAC) y el reactor de flujo pistén (RFP). El reactor por lotes tiene un uso limitado en los procesos con enzima, inmovi- lizada, ya que por lo general se hacen necesarias operaciones adicionales para la recuperacién de la enzima, lo que puede representar una pérdida 0 inactivacién de Ja enzima inmovilizada. Los RTAC y RFP son esencialmete diferentes y representan dos condiciones extremas. Para el primero, el mezclado se considera idealmente perfecto y en RFP e] mezclado es idealmente nulo; como consecuencia de ello, se considera que las condiciones, como la concentracién del sustrato, en cualquier instante t dentro del RTAC son las mismas que en la corriente de salida; mientras que las condiciones en el RFP varian con la distancia existente entre la entrada y la salida del flujo. Es importante sefialar que las condiciones ideales del RTAC son relativamente féciles de alcanzar en la prictica, lo que no sucede con el RFP porque en éste se presentan gradientes de temperatura y velocidad de flujo normalmente a la direccién del flujo y se presenta adems, difusion del sustrato en la direccién axial (Levenspiel, 1972; Brodelius, 1978), Los reactores enzimiticos de lecho fluidifi- cado se consideran intermedios entre las condiciones extremas correspondientes a Jos tipos antes sefialados. Para la eleccién del tipo de reactor que debe de disefiarse en un proceso enzimético especifico, habran de tomarse en cuenta varias consideraciones de 93indole técnica y econémica. Entre otras pueden citarse la disponibilidad y precios de enzimas y soportes, y cuando se trata de enzimas inmovilizadas, la necesidad y posibilidad de recuperacién del catalizador; es evidente que con enzimas inmovilizadas se prefieran los reactores continuos. Entre éstos el andlisis tedrico para casos especificos puede mostrar algunas ventajas intrinsecas. tras consideraciones importantes se refieren a la forma y propiedades cinéti- cas y mec4nicas de la preparacién de enzima inmovilizada. Los esfuerzos cortan- tes provocados por la agitacién pueden destruir o solubilizar la enzima. Por otro lado, la enzima inmovilizada preparada en pequefias particulas puede ocasionar taponamientos o provocar altas caidas de presi6n en reactores de flujo pist6n. Para reacciones con altos requerimientos de oxigeno se recomienda més el uso de un RTAC. En términos generales se puede decir que no hay reglas simples en la seleccién del tipo de reactor para un proceso con enzima inmovilizada en particular, cada caso requiere se tomen en cuenta las particularidades que le son propias. Ecuaciones de disenio En el caso de reacciones enziméticas cuyo mecanismo se supone que se ajusta al modelo de Michaelis-Menten, la cuestién se simplifica a incluir la ecuacién de velocidad en la ecuacién de disefio del reactor. De este modo la velocidad ser4: Vi=-dS/dt= VmaxS/(Km+S)=-1a Para el caso de un reactor por lotes la ecuacién de disefio dada por Levenspiel (1972) es: sustituyendo: ds f VimaxS So Km+S en la que So y S son las concentraciones del sustrato en el inicio y en el tiempo t (tiempo de residencia), respectivamente.Realizando la integraci6n indicada y considerando la conversién en el tiempo tcomo X = (So-SYSo se obtiene: Vmaxt = SoX — Km In ( 1-X ) De igual modo para un RTAC, en el que la ecuacién de disefio es segiin Levenspiel (1972): t=(So-S)/ta en la que Tes la relacién espacio-tiempo del reactor: Vmaxt = SoX + KmX/(1-x) y para un RFP : Vmaxt = SoX ~ Km In (1-X) Cuando durante fa reacci6n se sucede algin tipo de inhibicién, la ecuacién de velocidad que explica el mecanismo del proceso habré de incluir los pardmetros correspondientes. Asi, la ecuacién de disefio, por ejemplo, de un proceso con inhibicién competitiva por producto, en un reactor tipo tanque con agitacién serd: _ 1+ SoX/Ki Vinaxt = X Km a —X sox En laque Kies la constante de inhibicién determinada experimentalmente para el sistema. De igual modo para un reactor de flujo pist6n: Vmaxt = ( 1 - Km/Kj ) SoX — Km ( 1 ~ So/Ki) In(1-X) ‘Si se considera la pérdidade actividad de la enzimacomo un proceso que sucede mediante un mecanismo de reaccién de primer orden, la actividad residual seré E/Ei = e**, en la que ka ¢s la constante especifica de desactivacién de la enzima y Ey Ei, las concentraciones en el tiempo t ¢ inicial de la enzima. Y si se toma en cuenta que T= € V/Q y Vex est4 determinada por la concentracién, carga y actividad inicial de la enzima inmovilizada, en la que € es la fraccién vacfa del reactor, V el volumen del reactor determinado por la densidad p y peso W del catalizador sélido, las ecuaciones se transforman en : 95Para RFP : (W/Q) Boe *d'=( 1 - Km/Ki) SoX - Km (1 - So/Ki) In( 1-X) Y para un RTAC (W/Q) Bea" = x Km(-ESEE! | So La enzima B-galactosidasa Especificidad y fuentes de obtencién Comiinmente conocida como “lactasa”, esta enzima tipicamente cataliza la hidr6- lisis de beta-D galactésidos y alfa-L arabinésidos. La hidrlisis de la lactosa es esquematizada en la figura 2 en la que se muestran los sitios activos de la enzima consistiendo de un grupo sulfhidrilo y un grupo imidazol correspondiendo la reacci6n a un mecanismo SN2. La beta galactosidasa es también capaz de catalizar la s{ntesis de ciertos oligosacdridos vfa las reacciones de transferencia de galacto- silos, éstos se transfieren preferentemente al alcohol primario de la D-glucosa con Ja formacién de varios di y oligosacaridos. La formacién de oligosac4ridos durante la hidrdlisis de la lactosa es un aspecto importante; algunos investigadores han mostrado que Ja formacién de estos aziicares se incrementa con el aumento en las concentraciones de lactosa y que a concentraciones del 5%, los oligosacdéridos formados no ocasionan problema digestivo alguno. K. lactis, por ejemplo, produce una lactasa con una alta especi- ficidad para la formacién de enlaces galactos{dicos beta 1-6; estudios in vitro han mostrado que la lactasa intestinal humana tiene poca actividad ante este tipo de compuestos. Richmond y col. (1981) reportan la caracterizaci6n de seis oligosa- c4ridos formados por la accién de la Jactasa de K. lactis, encontrandose en sus estructuras lineales uno o dos residuos galact6silos con uniones beta 1-6a glucosa, galactosa o lactosa. Mucho del trabajo reportado sobre la B-galactosidasa ha sido hecho sobre la enzima de E. coli. Est4 ampliamente distribuida en la naturaleza, tanto en plantas, como en ciertos 6rganos animales, en levaduras, bacterias y hongos. La B-galac- tosidasa de diferentes fuentes difiere considerablemente en muchas de sus propie- dades; sin embargo, la especificidad de la enzima permanece inalterable. Se han reportado.lactasas de E. coli de 520 000 y 850 000 daltons, consistentes de 4 96Figura 2. Mecanismo de bidrdlisis de lactosa con beta galactosidasa inmovilizada (Richmond ycol.1981). Una molécula de lactosa en el Sitio activo de una de beta galactosidasa. Formacién del complejo beta 8 jactosa y Ne glucosa. CHOH oH OH H me on oH CHeOH OH subunidades protefnicas; de K. fragilis de 201 000 con 9 y 10 subunidades; la B-galactosidasa de A. oryzae, extracelular de 90 000 daltons. Las mayores fuentes comerciales incluyen E. coli, A. niger, K. fragilis y K. lactis. La tabla 1 resume las fuentes potenciales mds conocidas de esta enzima. La aislaci6n y purificacién de esta hidrolasa es relativamente sencilla debido a su gran tamafio molecular. El procedimiento en lo general incluye precipitacién de la enzima con acetona, tratamiento cromotografico de pseudo-afinidad y en Sephadex DEAD A-50. Inhibicion de B-galactosidasa Es conocido que la galactosa produce un efecto inhibitorio sobre Ja lactasa, El tipo de inhibici6n que este producto de la hidrdélisis de la lactosa ocasiona es competitiva. Chen y col. (1985) realizaron experimentos cinéticos para estudiar més profundamente la inhibicién de la beta galactosidasa por los productos formados durante la hidrdlisis, y plantearon un modelo de inhibicién multiple de inhibicién competitiva de D-galactosa ¢ inhibicién no competitiva de D-glucosa. El modelo de inhibicién multiple planteado por Chen y col. (1985) concluye 97Tabla L Fuentes potenciales de B-galactosidasa (Richmond y col., 1981) Plantas Durazno Almendra Granos de kefir Rosas silvestres Semillas de alfalfa Café cereza Organos animales Intestino Tejido cerebral y piel Levaduras Kluyveromyces (saccharomyces) lactis Kluyveromyces (saccharomyces) fragilis Candida pseudotropicalis Bacterias Escherichia coli Bacillus megaterium Thermus equaticus Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus belareticus Hongos Neurospora croussa Aspergillus foetidus Aspergillus niger Aspergillus flavus Aspergillus oryzae Aspergillus phoenicis Mucor pucillus Mucor meiber 98que D-glucosa y D-galactosa son mutuamente excluyentes en Ia inhibicién de la hidr6lisis de la lactosa; esto es, que los complejos enzima-glucosa-galactosa no existen en el esquema de reaccidn. Aplicaciones de la enzima en la industria de los alimentos Son conocidos muchos usos y se han reportado algunos otros potenciales de la enzima lactasa en el desarrollo de nuevos productos alimenticios. La tabla 2 resume algunos de ellos. Todos esos usos y muchos otros derivan principalmente de tres hechos importantes en toro a Jos productos l4cteos: uno de cardcter nutrimental, otro de indole ecolégica y uno mas de relevancia tecnoldégica. Tabla2 Uses de lactasa en el desarrollo de nuevos productos (Richmond y col., 1981) Procesamiento de leche baja en lactosa Productos l4cteos bajos en lactosa Yogurt bajo en lactosa Yogurt dulce Concentrados para helados Procesamiento de sueros Fabricacién de edulcorantes 1. Diversos estudios han mostrado que buena parte de la poblacién del mundo presenta incapacidad para metabolizar la lactosa. Este hecho hace a tales indivi- duos intolerantes al consumo de leche y productos lacteos debido a una inherente deficiencia en la lactasa de sus intestinos delgados. La lactosa ingerida y no hidrolizada en el intestino, no se absorbe y se mucve a través del intestino grueso donde la accién bacteriana y los efectos osméticos producen trastornos intestinales como diarrea y flatulencia (Houts, 1988). De ellos ha derivado el amplio desarro- Ilo de nuevos productos, principalmente lacteos, bajos en lactosa. 2. De los cuatro principales residuos de la industria léctea como lo son: a) la leche alterada que no pasa las especificaciones para su venta en el mercado; b) los productos lécteos en iguales condiciones; c) el suero de queseria y ¢l resultante de Ja produccién de caseina; y, d) los permeatos de ultrafiltracién sean de la produc- cién de quesos o de obtencién de protefnas de suero; los dos ditimos, el suero y los permeatos, representan en su conjunto el principal reto a resolver por lasimplicaciones ecolégicas y tecnolégicas que su disposicién y reuso plantean (Jelen, 1983). El suero es el mayor subproducto de Ja industria lactea. Una buena parte de ste, en algunos paises, es secado mediante aspersi6n o procesado para ser usado en muchas aplicaciones en la industria alimentaria 0 para servir como substrato en fermentaciones (Baret, 1987). La parte que no se aprovecha, con frecuencia se descarga como desecho a los cuerpos de agua 0 a los sistema de drenaje industrial © municipal. Adicionalmente, las técnicas de ultrafiltraci6n que son en la actua- lidad una bien establecida tecnologia para recuperar las protefnas del suero y de la leche en la manvfactura del queso, producen residuos I{quidos en grandes cantidades, conocidos como permeatos de leche, cuya composici6n en lactosa es cercana a la de Ja leche que los origina. La tabla 3 compara las composiciones promedio de leche sueros y permeatos. Por todo ello, en la actualidad se hacen constantes esfuerzos para dar una mejor utilizacién a suero y permeatos, siendo la hidrdlisis enzimitica de Ja lactosa en glucosa y galactosa una de las vias mas nuevas y que mejores perspectivas presenta al resolver importantes limitantes fisicoquimicas y nutrimentales que estos residuos presentan. Composicién promedio de reed toon comparados con la de la leche (Jelen, 1983) CONTENIDO % Proteina Grasa Lactosa Minerales Leche 33 3.8 5.0 09 Suero 0.9 <0.05 48 08 Permeatos <0.1 <0.01 48 06 3. Adicionalmente, la lactosa hidrolizada es mas dulce y ms soluble que la lactosa. Este hecho, en principio, ya resuelve la conocida limitacién en el uso de la lactosa para la elaboracién de muchos productos alimenticios (Weetall y col., 1974; Jelen, 1983; Arndt y Webling, 1989). Usos de los sueros y permeatos hidrolizados en los alimentos El suero y permeatos de leche hidrolizados tienen un uso semejante a los corres- pondientes productos sin hidrolizar, con Jas ventajas que representa la lactosa hidrolizada para el consumidor o propiedades del producto. Dichos productos tal 100cual salen del procesamiento hidrolitico son sujetos de otros tratamientos antes de ser comercializados; concentracién para la obtencién de jarabes de permeatos 0 suero hidrolizados, procesamiento enzimatico con glucosa isomerasa y concen- traci6n para la obtencién de jarabes de fructuosa; fermentacién para la obtencién de biomasa o metabolitos de interés comercial; deshidratacién para la obtencién de sueros o permeatos hidrolizados secos, etc. Holsinger y Kligerman (1991) citan algunos ejemplos que muestran yentajas halladas en el desarrollo de productos mediante ¢] uso de los sucros y permeatos hidrolizados: ¢] mds bajo poder edulcorante de los jarabes de glucosa/galactosa son de mayor utilidad al procurar una mayor presién osmética para lograr un menor crecimiento microbiano en los Productos poco dulces. En conservas, por ejemplo, el sabor de frutas no se enmascara como sucede cuando sc utiliza sacarosa. Muchas mas ventajas se han hallado en la elaboracién de yogures, helados, productos de panificacién, etc. Tecnologia de aplicacién de la B-galactosidasa inmovilizada El desarrollo tecnolégico para Ja aplicacidn de la lactasa ha estado soportado en miltiples investigaciones en torno a los procedimientos de inmovilizacién y comportamiento cinético de la enzima. La preferencia en el uso de la enzima en forma inmovilizada a la de la enzima soluble, como se ha dicho, responde principalmente a consideraciones econémicas y de operacidn y todo parece indicar que serd ésa la forma mis utilizada industrialmente en e] futuro cercano, a no ser que se logre una reduccién drastica en el precio de la enzima (Coughlin y Charles, 1980). Lamayoria de las enzimas de interés comercial que han sido inmovilizadas son Jas de las levaduras X. lactis y K. fragilis y de los hongos A. niger y A. oryzae (Finocchiaro y col., 1980). Son multiples los métodos y soportes de inmoviliza- cién experimentados para 1a hidrdlisis enzimatica de la lactosa. Estudios de inmovilizaci6n de X. lactis, por ejemplo, pueden encontrarse en Dahalquist y col.(1973), Ostergaard y Martiny (1973), Giancin y Jakabouski (1974), Pastore y Morisi (1973) y Finocchiaro, Richardson y Olson (1980), Peterson y col. (1989) y Bakken y col. (1989), entre otros. Finocchiaro y col. (1980) presentan la inmovilizacién de Ja enzima sobre ahimina activada con tolilen-2-4 disocianato y encontraron que 1a lactasa inmovi- lizada mediante ese procedimiento increment6 16 veces la actividad catalftica, comparada con a simple adsorcién en Ja aldmina no tratada. Dahalquist y col. (1973) inmovilizaron también una lactasa de levadura, comercial (Maxilact) por una técnica de polimerizacién. La enzima fue inmovilizada con un 20% de acrilamida y N.N-metilen-bis-acrilamida y el sistema se us6 para la preparacién de leche libre de lactosa. 101Giancin y Jakabouski, por su parte, inmovilizaron lactasa de A. niger sobre colageno reconstituido y estudiaron la hidrdlisis de lactosa en sueros 4cidos. Los complejos fueron preparados por penetracién interdifusional poracomplejamiento macromolecular. Estos investigadores observaron una inhibicién parcial irre- versible de 1a enzima en suero Acido no filtrado y reportaron que una posible causa de ello es la presencia de efectos inhibitorios sobre la lactasa. Con respecto a esto tiltimo, Mahoney y Adamchuck (1980), estudiaron el efecto de los constituyentes de la leche, sobre la hidrdlisis de la lactosa por la -galactosidasa de K. fragilis y concluyeron que las proteinas de Ja leche (casefna, protefnas del suero) son fuertes activadores, propiedad que pierden por efecto del calentamiento, A manera de ilustracion en la tabla 4, dada por Coughlin y Charles (1980) se dan algunos métodos y soportes de inmovilizacién para lactasas de diferentes origenes operados en reactores de diferente disefio. En lo general puede notarse, de acuerdo con la tabla 4, un predominio de la inmovilizacién mediante enlace covalente y el vidrio poroso como soporte. . El estudio de los pardémetros cinéticos de las enzimas ha ido paralelo a los ensayos de inmovilizacién. Como se sabe, tales parametros difieren para una misma enzima, de los presentados por la enzima en su forma soluble. La tabla 5, dada por Richmond y col. (1981), presenta datos cinéticos para lactasas de diferentes origenes. En dicha tabla se hace evidente el efecto que diversos fenémenos fisicoquimicos, relacionados con el sistema de inmovilizacién, oca- sionan sobre los valores de Km, Ki y energfa de activacién de la enzima. Es notoria Ja disminucién del valor del Km aparente de la enzima inmovilizada y la variacién en los de Ki y Ea bajo esas dos condiciones. Un informe pionero y fundamental en los trabajos posteriores de inmovilizacién. de la B-galactosidasa es el que contiene los trabajos de Weetall y colaboradores (1974), en el que se presenta la inmovilizacién de B-galactosidasa sobre particulas de vidrio poroso recubiertas con zirconio. Las enzimas fueron unidas covalente- mente al vidrio alquilaminado con glutaraldehido mediante un método acuoso esquematizado en la figura 3. Las enzimas, una fungal y la otra proveniente de levaduras, se caracterizaron determinando los perfiles de pH, constantes cinéticas, perfiles térmicos y vidas medias en soluciones de lactosa y permeato de suero. EI valor del Km aparente para ambas enzimas, as{ como el de Ki, se determi- naron graficamente, a partir de los resultados experimentales siguiendo el modelo de Lineweaver-Burk (1/v contra 1/s). El valor del Km aparente para la lactasa de levadura fue de 0.0714M (contra 0.112M de la enzima soluble) y 0.05 M para la Jactasa fungal (0.04M para Ja lactasa soluble). Las constantes de inhibicién para ambas enzimas se presentan en la tabla 5. 102Der esoye] ap efy O8/0r Brea 408 Bors = uN T-] UTED supo9 OTS swore = {QIZ-OdD un 007 — — serene eens ty — awrwacy = ACT dD SHRI 'S opin Oss -fsuoson Opry why 4 GAGE = cuoNS unuyyu “| WOR SBP SgI< 6800 SmRTAOD — ID Ay opryep. ost eornp ely -pemein|s %SR non WESt rum Supe mscperi owartuezeuy onstyjoD = sae “Ss os av %001 ay9eT oly quisetnap = a1jonq) wre) Sem RS %81 omnsoq9 woD SEDI GUA awaqeAo) = SUUTS2y = eANpeATT 20S-0F 09 “op aseot pats jereynjSeTTeMI (OES 96-08 == Open) %SL uosopezno aon) ~oadsop oly ‘Dsr (pHd'D Sp) owsrUeZEqUa —se>!/9Ua} oxong WT OOE-OE PUR = RseuRUasy OOS - 00Z Augiuosqy = stuisoy nimy, eunyesodra (uy) ‘ fepmr = soema ap = up}onziACUrUT PunrZUe UL vorsiaauoy ownsng —pepisnde:) odt], §=—eIpauteplA pepianoy PHusayy — POP — suodog = op atuONy YOLOVAY TA SVOLLSUALOVAVO YOAVZITVLVO TAC SVOLLSIAS.LOVAVD (og6t ‘Se17eq5 4 unTYBn0D) soe] ap s{s|9IPTY Bred epezi|AoUMU EsEpyso}IE[e3-4] UoD soperedura saaejnqn) $910}289y pee 103opezt Jp Ripeut —— -2a9UTTUSOp ormein A qxang eeeeen PUUIMjOD §— SEIPOO-~L OST. «HOSE swarenoy = TOFZ=Dd TU sozons wepreminys 206 A sore, =p woo opwzn3 ap sou “Papin oquarunezefus %SE0L —-OMjOS «SD HEED = SHIPOGOS §=— ONL 60S Augiuosqy — eununpy sora 'y DOSE — sO 08 2p sou fOr eeu %OL-09 — -O1DNJoS = UIMUTUEZ-| PUIMJOD —SEIPET-SZ HOST YOD-0Z omaesoy = Orme, aa u'y sopen “yeayn 2Inp A opiog DOs-0F oFns ‘es oO -o10k] 2p J0b eireus %0L-09 — SAUOIOMIOS =—UNU/MUZ-] CUUINJOD ~—-SIPRE —OR-OST_—»--HOB-ST amano) §— 70H7-Od BUY. 08 /op Fipear —_— crise seeeeeee SPD. OO IOP - awmapenoy §— 20NZ-DdeiNpeATT wmeroduey, (myn) k Tom = aoewD9p = uyTOBZTTTAOUTUE eurzvo ef uowz2At0D olemsng = ppeppede) odty = eIpomm EPLA pepArDy DUMDy — 9p opowIN euodos = ap amuany xolovae" ‘TAC SVOLLSTHHLOVAVD YOAVZIIVLVD ‘Tad A SVOLLSTYSLOW UV (ugpEnuAUOD) Bsoyan] ap sisTToupyy eased EpEZTAoUMT BsEprsopE]Ed-_j UOD sopesedura Saze[NGn) $3.10}989y PvIavlTabla 5 Par4metro cinéticos de B-galactosidasa soluble e inmovilizada (Richmond y col., 1981) Origen/Parémetro Soluble Inmovilizada DE LEVADURA Km (ap.)M 0.112 0.0714 Ki (ap.) mM (Galactosa) 0.666 3.2700 Ea kcal/mol 10.500 11.3000 FUNGAL Km (ap.)M 0.040 0.0500 Ki (ap) mM (Galactosa) 1.250 3.2200 Ea kcal/mol nenenee= 6.5400 DEE; COLI Km (ap.) M 0.625 0.1200 Ki(ap.)mM Galactosa) sense — Ea kcal/mol 17.500 16.3000 Reactores con B-galactosidasa inmovilizada Disefio y experiencias industriales La aplicaci6n industrial de la lactasa inmovilizada ha necesitado de la incorpora- cién de otras muchas operaciones y tratamientos a las materias primas para posibilitar y hacer eficiente la acci6n enzimftica sobre el sustrato. Asf por ejemplo, la figura 4 presenta el diagrama de bloques simplificado para la hidrélisis de lactosa del grupo de la compafifa Cornign. Otras experiencias como la de la Milk Marketing Board England and Wales pueden ser encontradas en Dohan y col. (1980). Segtn Coughlin y Charles (1980), bajo consideraciones técnicas, de disetio, operacionales y econémicas, los reactores tubulares empacados con particulas de catalizador, parecen ser la mejor opcién para la hidrélisis de lactosa de leche o suero a gran escala. De éstos, son preferibles aquellos que utilizan un catalizador relativamente barato, de alta actividad y estabilidad como los que se logran con la lactasa de A. niger con actividad 6ptima a pH entre 3 y 5, adecuados para suero 105Figura 3. Mecanismo de inmovilizacién de b galactosidasa sobre vidrio poroso (Doban y col., 1980). 4 LOH Grupo silanol sobre la 1 superficie de la silica, La! Activacién / por paminopropil ~SLO-SH{CHe)a-hte notte S-NH2 + H-C-CHe-CH2-CHe-C-H Carbonitacién con Il I glutaraidehido. L S-N= CH-CH2-CH2 C-H I o Fijacién de la enzima ° | S-CH= N-E Enlace imina 4cido, aun cuando puedan utilizarse para suero dulce y leche. Los reactores de lecho fijo son mas indicados para sustratos filtrados y ultrafiltrados por la frecuen- cia de taponamientos cuando las particulas del catalizador son demasiado peque- fias. Los reactores de lecho fluidificado resuelven esta limitaci6n, pero por lo general requieren el doble de longitud que los de lecho fijo. El proceso de inmovilizacién de lactasa para la hidrdlisis de lactosa en permea- tos y sueros desarrollado por la compaiifa Coming utiliza lactasas de A. niger y de A. oryzae enel tratamiento de sueros Acidos, sueros dulces acidificados, permeatos y permeatos desmineralizados (Bart, 1987). La preparaci6n de la lactasa inmovilizada se efectiia sobre silica porosa segin el proceso delineado por Weetall y colaboradores (1974). El soporte con particulas de tamaiio promedio de 0.50 mm (malla 30/45 US) es morfolégica y quimicamente estable en un amplio intervalo de temperaturas, con buenas propiedades mec4nicas y biodegradables. El tamaiio de particula esté optimizado para reducir los proble- mas difusionales externos y la caida de presién y para maximizar la actividad de Jaenzima. Te + E-NHe 106Figura 4. Diagrama de bloques en la produccién de jarabes de lactosa hidrolizada (Dohan y col., 1979) Linea de Proceso Almacenamiento ‘Suero Pasteurizacon |______________sueropasteurizado Proteinas ioe |______________ permeato Frasinas Calionicas y permeato desmineralizado Hidrdiisis con enzimas inmovilizadas permeato hidrolizado y desmineralizado vaporacion Jarabe de lactosa 5 ——hidrotizada 107Los perfiles de pH de las dos enzimas utilizadas, presentan corrimientos hacia el lado Acido de 0.5 a | unidades de pH. La lactasa de A. niger tiene una actividad de alrededor de 500 u/g a 50 C y pH entre 3.5 y 3.8. Los valores de Km y de Ki son de 0.053 y 0.005M respectivamente. La energia molar de activacién, calcu- lada mediante una grdfica tipo Arrhenius, es de 12 kcal/mol; Ja energia de desactivacién, calculada de la variacién de la vida media de la enzima con respecto a la temperatura, alcanzé las 40 kcal/mol. La lactasa de A. oryzae tuvo una actividad de 400 u/g a 40 C y un pH entre 4 y 4.5; un Km de 0.05 y una K i entre 0.02 y 0.05M; la energia de activacién de 6 kcal/mol y la de desactivacién de 70 kcal/mol. Baret (1987) informa que en base a tales caracteristicas, la lactasa de A. oryzae parece ser la ms adecuada para procesar suero y permeatos debido principalmente a su pH 6ptimo y a que tiene menos problemas de inhibicién por la galactosa, Es de destacar la importancia de la naturaleza del sustrato, de las caracteristicas de disefio del reactor y de la estrategia de operacién. Del primer aspecto puede indicarse que dada la complejidad en Ia composicién de las materias primas que se procesan, en la practica industrial requieren controlar su pureza y contamina- cin, lo que produce costos adicionales considerables. La experiencia del grupo Corning muestra que la presencia de sales y diferentes concentraciones de iones que normalmente se encuentran presentes cn las materias primas para la hidrdlisis de lactosa, no tienen efecto adverso en la operacién y estabilidad de la enzima por Jo que la necesidad de desmineralizacién, por ejemplo, de los permeatos, debe estar ms relacionado con la aplicacién ulterior del producto final. En cuanto a las caracteristicas de disefio del reactor por lo general se operan dos tipos de ellos, de lecho fijo, que puede considerarse funciona idealmente como flujo-pistén (RFP), y el otro como reactor de tanque agitado continuo (RTAC). Las figuras 5 y 6 comparan el comportamiento en la operacién de estos dos tipos de reactores elaboradas con datos experimentales reportados por Baret (1987) para lactasa inmovilizada en vidrio recubierto con zirconio. Las curvas estén dadas en funcién del grado de conversién y el tiempo normalizado de residencia. Desde un punto de vista cinético, el reactor de flujo-pist6n parece ser el mas eficiente al minimizar la cantidad requerida de lactasa inmovilizada y el volumen del reactor; no obstante, este tipo de reactores son mas sensibles a la presencia de sélidos suspendidos presentes en la alimentacién. La contaminacién microbiana es un aspecto todavia no del todo resuelto en la operacién de reactores para hidrdlisis de lactosa, debido principalmente a que las materias primas generalmente procesadas, son medios de cultivo ricos para el crecimiento microbiano. La solucién a ello esté restringida por la escasa libertad para el uso de inhibidores microbianos y el uso de condiciones severas de temperatura. Ello, es satisfactoriamente salvable mediante pasteurizacién en el caso de que la principal fuente de contaminacién se localice en la corriente de 108Figura 5. Curvas teéricas de operacién hidrdlisis de lactosa en RFP con beta-galactosidasa inmovilizada. x 99 0 0 70 50 40 W/Q = p/ Vmax((1-KnVKI)SoX - Km(1-So/K1)In(1-X)) 10 oO —— a ° 5 10 15 20 25 30 35 W / 1000 Q (g-miny/l ——1% 45% 5 10% —» 15% e lactosa Lactasa de A. niger sobre vidrio recubierto con Zirconio. Km=0.0528, K]=0.0054, Eo=500 wg (Baret, 1987) Figura 6. Curvas tedricas de operacién hidrélisis de lactosa en RTAC con beta-galactosidasa inmovilizada. ° 200 400 600 800 1000 W / 1000 Q (g-min)/ 1% 45%, 10% «= 15% delactosa + Lactasa de A. niger sobre vidrio recubierto con Zirconio, Km=0,0528, Kl=0.0054, E0=500 ug (Baret, 1987) 109alimentaci6n. Baret (1987), da el resultado obtenido con el uso de agentes bacteriostaticos como ¢] dcido acético, derivados hologenados, sales de amonio y polfmeros de biguanidina, entre otros. La optimizacién de las condiciones de procesamiento, as{ como el estudio de los efectos econémicos en términos de los costos del procesamiento, han sido un objetivo presente en las investigaciones en esta materia. Harju y Heikonene (1980), Coughlin y Charles (1980), Doban y col. (1980), Baret (1987) y Yang y Okos (1989), entre otros, examinaron las condiciones de operacién para la hidré- lisis de la lactosa con el fin de optimizar el proceso para su aplicacién industrial. En lo general se ha visto que cuando se eleva la temperatura, e] decremento en la vida media de actividad es mds pronunciado que el aumento en la actividad de la enzima inmovilizada, de este modo, la maxima actividad se alcanza a temperaturas relativamente bajas. El suero desproteinizado es cinéticamente el mejor substrato, pero en relacién a la estabilidad de la enzima, el suero ordinario es igualmente bueno. Las graficas 7 y 8 muestran algunos de los resultados logrados por Coughlin y Charles (1980) y Yang y Okos (1989) para los costos por libra de lactosa procesada en diferentes tamafios de planta y bajo diferentes temperaturas de operacién en reactores de flujo piston conla B-galactosidasa inmovilizada sobre vidrio poroso y en resinas de fenol-formaldehido (Duolite ES-762), respectivamente. Figura 7. Efecto de la capacidad de la planta sobre el costo de procesamiento en la bidrdlisis de lactosa. Costo de procesamiento as 3 Capacidad de planta (Ib de lactosa/dfa) Costa en cts. de dolar/tb de lactosa Lactasa de A. niger sobre videio poroso en RFP para suero. (Coughlin y Charles, 1980) 110Figura 8. Efecto de la temperatura sobre el costo de procesamiento en la hidrélisis de lactosa. Costo de procesamicnto 14 5 30 36 40 45 50 55 Temperatura grados C Coste en cis. de dolar/b de lactosa Lactasa de A, niger en fenol-formaidehida en RFP de 10000 Ib de suero/dia X=0.80 (Yang y Okos, 1989) ‘Conclusiones El conocimiento bdsico y la tecnologia para el disefio y operacién de reactores con enzima inmovilizada ha alcanzado un amplio desarrollo en los tltimos afios. La gran especifidad propia de las reacciones enzimiaticas, as{ como la alta eficiencia que se logra cuando éstas se suceden en reactores empacados, los hacen adecuados para el manejo y tratamiento de multiples materiales biolégicos. De entre esos materiales bioldgicos, los residuos liquidos de la agroindustria, y de la alimentaria en especffico, encuentran en esta tecnologfa una amplia perspectiva de uso para posibilitar su aprovechamiento, reciclamiento o tratamien- to antes de su devoluci6n al medio ambiente. En una regién como la del Estado de Veracruz, donde el procesamiento de alguna de su variada produccién agropecuaria, comoes el caso de los lacteos, café, cafia de azticar, etc., inevitablemente, hasta ahora, producen l{quidos residuales de gran riqueza biolégica y grave contaminacién, la alternativa biotecnol6gica, aqui planteada a manera de ejemplo, puede resultar factible y conveniente. Laconclusién sumaria surge casi como recomendacién esponténea : fortalever Jos grupos de investigacién que en el pafs operan en base a esta lfnea; y propiciar el surgimiento y desarrollo de nuevos grupos en las instituciones de educacién superior ubicadas en la regi6n veracruzana. 1Bibliografia Amat, E.A.y Webling. R-L. (1989). “Development of bydrolyzed-isomerized syrups from cheese why ultrafiltration permeate and their utilization in ice cream’. J. Food. Sci., 54(4).. Pp. 880-884. Atkinson, B. y Mavituna, L. (1985). Bichemicat Engineering and Biotechnology Handbook. ‘The Nature Press. BUA. 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