3.

4 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA

RESOLUCIN

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin

basado en la distribucin de los componentes de
una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra mvil.

En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido

que fluye a travs de una columna que contiene a
la fase fija.

La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en

una columna generalmente de vidrio, la cual est
rellena con la fase estacionaria.

Luego de colocar la muestra en la parte superior, se

hace fluir la fase mvil a travs de la columna por
efecto de la gravedad.

Caractersticas:
Columnas de vidrio
Dimetros de 1 a 5 cm
Longitudes de 50 a 500 cm
Fase estacionaria slida con de partcula de 150 a
200 m
Tiempo de separacin: varias horas

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las

separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se
fue disminuyendo hasta el tamao de 3 a 10 m, lo cual
gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr
que fluya la fase mvil.

Se ha convertido en la tcnica de separacin ms

ampliamente utilizada, debido a:
Su sensibilidad
Fcil adaptacin a determinaciones cuantitativas
Separacin de especies no voltiles o termolbiles
Aplicacin a sustancias que son de inters primordial
en la industria

De esta manera, naci la tcnica de cromatografa

lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de
instrumental especial que permita trabajar con las altas
presiones requeridas.

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de

fenmeno fsico que provoca la separacin, la
cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:

1.
Cromatografa de adsorcin
La fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamente
slice (slica) y en mucha menor medida almina.

2.

Cromatografa de reparto

En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan

compuestos unidos qumicamente a un soporte slido de
slica. Se la subdivide en cromatografa en fase normal y
fase reversa.

En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar

(como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos
menos polares eluyen primero.

En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido

qumicamente es un hidrocarburo aliftico y se emplean
fases mviles polares. En este caso, las sustancias ms
polares eluyen primero.

3. Cromatografa inica
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio
inico para separar y determinar iones.

4.
Cromatografa de exclusin por tamao
La fase fija est formada por partculas polimricas o de
slice que contienen una red uniforme de poros y llevan
a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamao
molecular.
Las molculas de tamao mayor son excludas y eluyen
primero, mientras que las ms pequeas que penetran
en los poros son retenidas ms tiempo.

INSTRUMENTAL

Un equipo para cromatografa lquida de alta

resolucin puede representarse por el
siguiente esquema:

FASE MVIL

BOMBA

VLVULA DE
INYECCIN

COLUMNA

DETECTOR

REGISTRADOR
INTEGRADOR

Chromatograms

Supelcosil LC-PAH Columns.

Conditions: A: 150mm x 4.6mm, 5.

Conditions: B: 50mm x 4.6mm, 3.

Flow Rate: 1.5 mL/min

Flow Rate: 3.0 mL/min

FASE MVIL

La fase mvil puede ser un solvente puro o una

mezcla de solventes.

Cuando se trata de una mezcla, puede programarse

la bomba para que tome solventes de diferentes
botellas (de vidrio o acero inoxidable) en una
proporcin determinada y realice la mezcla en una
cmara de mezclado. El mtodo se denomina
elucin con gradiente

Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre

el mismo solvente, se denomina elucin
isocrtica

Instrumento de elucin isocrtica

Sistema de elucin con gradiente

SISTEMA DE BOMBEO Y DE INYECCIN

Se utilizan tres tipos de bombas:

Recprocas
De desplazamiento
Neumticas
La introduccin de la muestra puede hacerse de dos
maneras:

Por medio de una jeringa

A travs de una vlvula

El tamao de la muestra es de dcimas de l a 500 l

Inyeccin de la muestra

COLUMNAS

Columnas analticas:

Longitud: de 10 a 30 cm
Dimetro interno: 4 a 10 mm
Tamao de partcula: 5 a 10 m
Eficiencia: de 40,000 a 60,000 platos/m

Precolumnas
Para aumentar la vida de la columna, elimina
materia en suspensin y contaminantes del
disolvente

DETECTOR
Tipos:
a)Los que se basan en una medida de una propiedad
de la disolucin.
Ejemplos: ndice de refraccin, densidad, constante
dielctrica, que se modifica con la presencia del
analito.
b)Detectores basados en la medicin de una
propiedad del soluto, ejemplo: Absorbancia en el UV,
Fluorescencia, Infrarrojo, etc.