PRCTICA 6: VERIFICACIN DEL FUNCIONAMIENTO CORRECTO DE UN

ESPECTROFOTMETRO
INTRODUCCIN
Un espectrofotmetro es un instrumento usado en el anlisis qumico que sirve
para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una
misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la
concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra. Tambin es
utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y
microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin
atmica o espectrofotmetro de masa y visuales.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a
travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha
muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:
1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra
2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est
presente en la muestra
La espectrofotometra de absorcin en las regiones ultravioleta y visible del
espectro electromagntico es, posiblemente, la ms utilizada en la prctica del
anlisis cuantitativo de todas las tcnicas espectroscpicas. Asimismo, puede
resultar de utilidad como tcnica auxiliar para la determinacin de estructuras de
especies qumicas.(Murali,1980)
La qumica es importante para realizar la lectura de un lquido en cualquier
material volumtrico. Para esto deben coincidir la curva (ms bien la tangente de
sta)(la parte central)con el aforo o graduacin. Siempre teniendo la vista
perpendicular a ambas.
El lquido restante del menisco que queda por encima del aforo (en caso de ser
cncavo), generalmente queda en el recipiente una vez vertido el contenido.
(Rand,1969)

CONTROL DE LA EXACTITUD DE LA LONGITUD DE

NO APTO PARA FOTOCOLORMETROS NI AUTOANALIZADORES

ONDA

Frecuencia del control:

El control se podr realizar en espectrofotmetros con selector continuo de
longitudes de onda, no as en fotocolormetros de filtro ni en autoanalizadotes, ya
que en estos no se pueden realizar espectros de barrido.
Definicin: Grado de concordancia entre la longitud de onda que indica el
seleccionador y la longitud de onda de referencia requerida. Se expresa en nm.
Fundamento: Se utiliza el mtodo del punto isosbstico: el rojo Congo tiene la
particularidad que los espectros de las formas cida y bsica del colorante en igual
concentracin presentan la misma absorbancia a una longitud de onda
denominada "punto isosbstico" (PI). Esta longitud de onda es independiente de la
concentracin del colorante y de la temperatura de trabajo por lo cual resulta un
parmetro fijo de referencia. Si el punto isosbstico hallado experimentalmente
difiere del terico, indica que existe un corrimiento en la longitud de onda.
(Frings,1979)

OBJETIVO GENERAL
Realizar pruebas de control de calidad de un espectofotmetro para determinar la
respuesta instrumental del equipo.
OBJETIVO ESPECIFICO
Analizar las siguientes pruebas: proporcionalidad o linealidad fotomtrica,
exactitud de la escala de longitud de onda, presencia de radiacin dispersa, ancho
de banda y exactitud para determinar la respuesta de diferentes equipos
espectofotomtricos.
PROCEDIMIENTO
A) Se determin el volumen mnimo de lectura y se observ el Efecto menisco.
Se ajust el aparato a cero con aire, a una longitud de onda de 500 nm. Se
colocaron 0.2 ml de la solucin dicromato de potasio al 0.08 % y se tom la
primera lectura. Se agregaron 0.2 ml de la solucin nuevamente y se registr la
lectura. Se repiti la adicin de la misma cantidad de solucin tomando las

lecturas hasta que permaneciera constante. Se determin el volumen mnimo de

lectura.
A) Exactitud de la escala de longitud de onda
Se coloc el selector de longitud de onda en 380 nm y se ajust el instrumento al aire
(0 %T) Se ajust a 100 %T con agua destilada y se insert el filtro de didimio en el
portacubetas sin quitar la celda con agua y se ley la transmitancia a las diferentes
longitudes de onda (ver manual, Tabla 2, pg 38)
A.2) Mtodo de solucin qumica colorida. Solucin acuosa de NiSO 4. 6H20 al 20 %.
Se coloc el selector de longitud de onda en 400 nm y se ajust a 100 %T con una
solucin de HCI al 1 %, empleada como blanco de reactivos. Se coloc la solucin
del sulfato de nquel en el portacubetas y se ley la transmitancia de 380 a 600 nm en
intervalos de l0 nm, ajustando a 100 %T con el blanco de reactivos cada vez que
cambie la longitud de onda, tabla 3.
A.2,1) 1. Se adicionaron 25 L de la solucin de rojo de cresol al 1 % en cada uno
de tres matraces aforados de 25 mL.
2. Se aforaron cada uno de los matraces con las siguientes soluciones
a) cido sulfrico 0.5 M
b) Hidrxido de sodio 0.5 M
c) Regulador de citratos 0.5 M pH 4.7
3. Se leyeron las absorbencias de las tres soluciones en un espectrofotmetro,
desde 360 nm hasta 680 nm con intervalos de 20 nm. Se ajust a cero con agua
destilada despus de cada cambio de longitud de onda.
B) Proporcionalidad o linealidad fotomtrica
Se determin la absorbencia a 460 y 550 nm de la solucin de NiSO 4. 6H20 al 20 %
ajustando previamente el aparato al aire y a 100 %T al 1 % (tabla 4, pg 39)
C) Luz dispersa, espuria y errtica o extraa
Se ajust el instrumento al aire (0 %T) y a 100 %T con HCI al 1 %. Se ley la
transmitancia de la solucin estndar de sulfato de nquel al 20 % a 400 nm, para
comprobar que no exista luz extraa a ambas longitudes de onda, se compar con
las lecturas del experimento del inciso A.2. Se considera que existe luz extraa
cuando hay un crecimiento de %T mayor a 3, con respecto a la lectura original a

ambas longitudes de onda, (ver Tabla 5, pg 39)

D) Ancho de la banda (ranura de salida)
Se ley la transmitancia del sulfato de nquel al 20 % a 510 nm, se ajust
previamente el aparato a 0 y 100 %T con HCI al 1 %. Se considera que hay cambios
en el ancho de banda cuando hay decrementos del 3 %T con respecto a la lectura
original (inciso B) (ver manual, Tabla 6, pg 39)
E) Exactitud fotomtrica
En una espectrofotmetro que trabaje en la regin ultravioleta, se determin la
absorbancia de una solucin de referencia de dicromato de potasio. Se ajust el
instrumento al aire y a 100 %T con H 2SO4 0.005 M. La lectura se efectu en una
cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz, (ver Tabla 7, pg 40)
COMPORTAMIENTO INTEGRAL DEL ESPECTROFOTMETRO
a) Prepare por duplicado la curva de calibracin de acuerdo a la siguiente tabla
Tabla No. 1 Preparacin de la curva de calibracin del sulfato de nquel, (ver
manual, pg 37)
Se determin la absorbencia de cada tubo de ambas series, a 400 nm ajustando al
100 % T con el tubo 1 y 1 ' respectivamente, (Tabla 8, pg 40)
RESULTADOS Y ANALISIS
Tabla 1. Determinacin Del Volumen Mnimo De Lectura Y Efecto Menisco
Volumen

Absorbencia

0.2

0.117

0.4

0.121

0.6

0.379

0.8

0.833

1.0

0.833

La luz atraviesa de manera uniforme a un volumen mnimo de lectura de 1mL y presenta

un efecto menisco a 0.8mL de la sustancia de bicromato (0.08%) a 500nm de longitud de
onda.
A) Exactitud de la escala de longitud de onda
Tabla 2. Transmitancias del mtodo de solucin qumica colorida con la solucion de

NiSO4. 6H20 al 20 %
Longitud de onda (nm)

%T

380
390

34.0
24.4

400

24.7

410

32.8

420

51.4

430

75.2

440

89.3

450

96.2

460

99.2

470

102.5

480

106.2

490

107.4

500

108.0

510

107.8

520

106.7

530

103.6

540

104.9

550

103.9

560

102.8

570

100.4

580

97.4

590

93.5

600

88.6

Espectro de Transmision
120
100
80
60
%T

40
20
0

Longitud de onda (nm)

Anexo 1 (espectro de transmision).

Se muestra como pico de lectura a 500 nm con un transmitancia del 108%.
% Inexactitud fotomtrica = (Abs. hallada Abs. referencia) x 100
Abs. referencia

Exactitud de la escala de longitud de onda del espectrofot metro:

%error =

0.3725

x 100 =

Tabla 3. Mtodo de solucin qumica colorida

Longitud de onda

H2SO4

NaOH

Citrato

360

0.523

0.530

0.063

380

0.021

0.296

400

0.022

0.018

420

Metodo de solucion quimica colorida

0.6
0.5

Absobencias

0.4

H2SO4

0.3

Citrato

0.2

NaOH

0.1
0
350 360 370 380 390 400 410 420430
Longitud de onda (nm)

Anexo 2
Corrimiento (nm) = p. isosbstico hallado p. isosbstico terico
El punto isosbstico terico del Rojo Congo es 541 nm.
Corrimiento (nm) = 420 500 = 80 nm
Ya que los limites de aceptabilidad se encuentran en un corrimiento de entre +/- 3 nm y un
intervalo optimo de entre +/-2 nm, se determino que existe un gran corrimiento en la
longitud de onda, mayor a 3 el cual fue de 101.
Se debe tomar en cuenta que las mediciones se detuvieron en ese intervalo por lo cual no
se llego a las mediciones adecuadas para obtener el punto isosbestico real para las tres
disoluciones.
Absobancia de color Rojo. 500560

B) Linealidad o proporcionalidad fotomtrica

Tabla 4. Linealidad o proporcionalidad fotomtrica
Solucin de NiSO4. 6H20 al 20 %
Longitud de onda

(nm)
460
550

0.092

La proporcin de la intensidad de luz que llega al detector, es aproximada a 2:1.

C) Luz dispersa

Tabla 5. Transmitancia de la solucin estndar de sulfato de nquel al

20 % a 400 nm
Procedimiento
A.2
C

%T
24.7
25

No existe una luz extraa o longitud de onda distinta a la seleccionada por el

monocromador, que alcanza el detector, ya que no supera el 3% de transmitancia.

D) Ancho de banda
Tabla 6. Ancho de banda.
Longitud de

%T

onda (nm)
510
550

100.3
92%

Existe un cambio mayor al 3% por lo tanto se considera un cambio en el ancho de

banda para el espectrofotometro.
E) Exactitud fotomtrica
Tabla 7. Exactitud fotomtrica. Valores experimentales esperados de la
solucin de referencia de dicromato de potasio
Longitud de onda (nm)
A esperada
Tolerancia aceptada
E (1%, 1cm)
A medida

235
min
0.748
0.740-0.756
24.54
0.792

257
mx
0.865
0.856-0.874
144.2
0.912

313
min
0.292
0.289-0.295
48.62
0.298

350
mx
0.640
0.634-0.646
106.56
0.667

Tabla 8. Verificacin del funcionamiento del espectrofotmetro.

Experimento
Datos obtenidos
Exactitud de la escala de longitud de onda.
E = m- ref
Proporcionalidad o linealidad fotomtrica.
Luz dispersa, espuria y errtica o extraa.
Ancho de la banda (Ranura de salida).
%Error = Am Aref x 100
Exactitud fotomtrica.

Aref

El espectrofotometro (Genesis ) utilizado en la practica ---- tiene exactidudCausas de erros:

Cambio en el ancho de banda.
Alteracin de la respuesta relativa o rendimiento instrumental.
F) Funcionamiento integral del espectrofotmetro.
Tabla 9. Funcionamiento integral del espectrofotmetro
Tubo No.

Concentracin de

A400

Serie ajustada por

NiSO4. 6H20 (M)

a
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

b
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0
9.50x10-03
0.0285
0.0665
0.1045
0.1425
0.152
0.171
0.1805
0.19

regresin lineal
Serie a
0
0.028
0.084
0.202
0.363
0.468
0.570
0.607
0.646
0.670

Serie b
0
0.034
0.159
0.222
0.357
0.532
0.562
0.619
0.658
0.701

0
0.03
0.095
0.24
0.37
0.51
0.54
0.61
0.65
0.68

Curava de calibracion

Curva de calibracion del funcionamiento integral

0.8
0.7

f(x) = 3.6x + 0.01

R = 0.99

0.6
0.5
Abs (400nm)

Serie A
Linear (Serie A)

0.4

Serie B

0.3

Linear (Serie B)

0.2
0.1
0
0

0.05

0.1

0.15

0.2

concentracion (M)

Anexo 3 (curva de calibracion)

c) Cmo se interpretan estos valores para esa curva?
d) Concluya respecto a la linealidad en la respuesta del detector

DISCUSIN:
El efecto menisco que se lee en el espectrofotometro genesis es de 0.8 mL y su volumen
minimo al cual leera de forma correcta sera de 1.0 mL el cual es similar en la mayoria de los
espectrofotometros.
Exactitud de la escala de longitud de onda
Las ventajas del metodo a partir de una solucion colorida, es que la longitud de onda que se
obtienen del colorante es independiente de la concentracin del colorante y de la temperatura
de trabajo por lo cual resulta un parmetro fijo de referencia y

a partir de un valor ya

establecido se puede obtener una exactitud aproximada de la escala de longitud sin

embargo, si no se llevan a cabo las disoluciones de manera correcta los datos obtenidos
marcaran un grado de inexactitud al que se deberia obtener. Y que el espectro de transmision
solo nos dara un valor maximo, aunque si se obtienen dos puede que exista un error, por que

las celdas estan rayadas.

En este espectrofototmetro no existe una luz extraa o longitud de onda distinta a la
seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector, por lo tanto no existe una luz
que interfiera en las lecturas o que aunmente el grado de error en estas de forma
significativa.

Existe un cambio mayor al 3% por lo tanto se considera un cambio en el ancho de

banda para el espectrofotometro.

CONCLUSIONES: _______________________________________________
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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1:Murali Dharan. Control de calidad de instrumentos y equipamientos de
laboratorio. En: Murali Dharan. Control de Calidad en las Laboratorios Clnicos.
Madrid: Ed. Revert S.A; 1980. p. 145-62.
2: Rand RN. Practical spectrophotometric standards. Clin Chem 1969; 15 (9): 83963.
3: Frings CS, Broussard LA. Calibration and monitoring of spectrometers and
spectrophotometers Clin Chem 1979; 25 (6): 1013-7.