‘Introduccién a. la HPLCCapitulo 12 Validacion de Métodos 12,1. Objetivos deta validacion 302 12.2 Selectivided o especificidad.... 303 12.3 Lineatidad. Ejemplo 124 Precisién rt 316 Limites de confianza. 318 Bjemplo B19 12.5 Exactitud... 319 Ejemplo 321 12.6 Sensibilidad 321 Ejemplo 323, 12.7 Robustez. 324 Bjemplo 326 Referencias .. 12. Validaci de métodes 30112.1 Objetivos de la validacién Une ver desarlladoun métododeandisispor HPLC, igual quetoda énics analitica, debers validarse, es deci, e debe confirmar y documentar que los resultados por él producidos son confiables. Elobjetivo de este capftulo es el de presenta al analista uns guia prcticay concreta para fencarar una validacin enalitice apoyada con ejemplos, pero ol lector interesado en profundizar estos temas puede recrsir a monogafis espectficas, ai como a textos complementario de andlisis estaditio® En oreferente aos productos farmactuticos los métodos eodifcados en la USP XXTE se consideran vélidos el nico requerimieno es el cumplimiento del est de adecuaci6n {ndicado en cada monografla:en general se inyecta une sustancs dfinida y se verifica 4que le resolucién entre el pico del analitoy dicha sustancia sea superior a cierto valor indicado; ademis, se mide y controlalapreisin (RSD), asimetra del pico y eficiencia (N).y se permite sjustar la fuerza de la fase mévil para cumple estos requerimientos rminimos, Es importante destcar que la validez de estos métodos es ampliamente discuible. Difereacia entre ditntas formas farmacéutias, tipo y calidad de las materias primes empleadas por cada fabricante, hacen necesario validar {a metodologia para cada producto en particular, elaborado o semiclaborad. Evidentement,todonvevométodoanalitic debe validarse para demostrar su idoneidad, pero frecuentemente nos encontramos con metodologias antiguas, aplicadas durante ‘mucho tiempo, con las que tiene poco sentido encarar una validaciGn como si fuera una ‘metodologia desconocida. Para estos casos, puede definire una validacin retraspec- tiva, dondese pueden combinarlosnuevoscrterios de validacin con todalaexperiencia ya adqurida En contrapartida, para dferenciarlade Ia anterior, lamaremos validac ‘prospectiva als que encaramos frente a un producto nuevo. En muchos casos un método analitco es desarrolladoy validado por un grupo de trabajo, Aipicamente et Laborstoriode Desarrollo Analiticoy apicadopor oto grupo, por ejemplo cl Laboratorio de Control de Calidad, Para asegurar que el laboratori de aplicacin sea ‘apaz de eatrepar as vez resultados confables, es convenient realizar unadransferen- cia de validacin. En elcaso de métodos cromatogréticos, la transferencia de validaci6n consist en la comparacin de resultados de las pruebas de adecuacisn y de andlisis en paralelo de, al menos, dos muestra homogéneas de concentraciones conocidas, dentro delsango de acepiacién del producto o dentro del rango de aplicacia dela metodotogta Por otra parte debe considerarse la revalidacién. La revalidacin se hace necesaria con _métodos previamentevalidados, pero que deben volver a evaluatse por variaciones de Algn factor instrumental (cambio de equipo ode alguno de sus componente, del tipo w origen de columna te), de a matiz que contiene la muestra ode la proporein relativa del analito. 302 Tntroducelin ala HPLCEnun ensayo de alidacién deben considerarse los siguientes parémetros, discutidos més adelante: Selectividad Lincatidad Precision Exsctitud Sensibitidad Robustez 12.2 Selectividad o especificidad Este parémetro serefiere a la propiedad del método de producir una sefal medible debida solo la presencia del analito libre de interferencia de otros componentes, en la matriz de la muestra, Estos componentes pueden ser excipientes de un férmaco, productos de > 3182=> _correlacién lineal mejor que p=0.05, (1-0.9993%) Sy? 295011238- = 857,64 x 3427884 24972.85 5-2 Sy = (24972.85 /398.4-407/5)" 17.85 $US, = 857.64 £ 2.776 x 17.85 = . (808.1 ; 907.2) = (318.53 x 3984/5) 15931 $t8,=27.942.776 x 159.3 vm» (1314 ; 187.2) 12- Valldacia de métodos 3512.4 Precision Laprecisi¢n estérelacionada con ladispersi6n de as medidas alrededor desu valor medio © central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidamente a mdltiples alfeuotas de una muestra homogénea. La precisiOn se expresa matemiticamente como la desviaci6n estandar, 0, estimada ‘naliticamente por s 0 més comnmente como la desviacin esténdar relativa (RSD) 0 ccovficiente de variacion (CY). El estimador s de la desviacin estindar se calcula como: { 2 +X? s= (12-10) no-T donde n es el nimero de medidas, X, es el valor medido en el ensayo iy Rel estimador de la media poblacional p, calculado como: (2-11) (12-12) Ambos estimadores, desviaci6n estindar y desviaci6n estindar relativa permiten evaluar I incertidumbre en Ia estimaci6n de la. medida (error aleatori, correspondiente a la dispersin de datos alrededor de la medi). En el caso muestras escasas, que no permiten efectuar més de 2.6 3 determinaciones, la cstimacién de la desviaci6n estindarserfa incierta.En estos casos, puede recurrirse a un “estimador agrupado” l!: seefectian mediciones por duplicado o tiplicado en diferentes muestras y se calcula la desviacion esténdar como: se 1. 1 $3 xx (1213) Nog Jte ‘Siendo N el némero total de determinaciones,g el nimero de muestrasy mel nimero de s V2 => diferencia significativa Ejemplo del estudio de robustez en una valoracién por HPLC Variable Nivel bajo Nivel alto ‘Columna 6em,3 um ép 15 em, 5 um dp pH 30 5.0 Cavdal 1.00 minim 2.00 ml/min ‘Temperatura del homo 30°C 50°C Concentraci6n de Tritilamina | 30 mM mM ‘Concentracion de MeOH 50% 0% ‘Tiempo preparaci6n-inyeccion | 30 minutos Bhs a6 Tatroducciin ala HPLCEs decir, puede estudarse ct efecto producidoaleambiar una columnade 6cmdelongitod ‘y3 umdedigmetro de particu por una columna de 15 emy Sm (enestecaso seintenta estudiar solo una variable, la eficiencia -N-, que puede suponerse a priori aproxima- damente gual en unacolumna cortade dismetro de particulapequefoy en una més larga, ‘de mayor difmetro de particule), por varaciGn de 2 unidades de pH de a fase mévil, de la concentracién de un modificador de fase mévil, et, sobre ls resultados obtenidos ‘concentracin hallads, resoluciGn, asimetra, etc. 12. Vallaacin de métodoe 3aReferencias 1. USP XXII <1225> Validation of Compendial Methods 2) "Validacién de Métodos Analiticos”, Asociacin Espafola de Farmacéuticas de la Industria, Seccién Catalana, setiembre de 1989. 3. Kateman G, Pijpers F, “Quality Controlin Analytical Chemistry”, J. Wiley & Sons, NY,, 1981, 4. Long G., Winefordner ., Anal. Chem. $5(7), 712A, (1983). "Praxis der Validierung”, Sucker Edwyg (1983). 6, MillerJ.C.,MillerJ.N., "Statistics for Analytical Chemisty”, Ellis Horwood Ltd.- John Wiley & Sons, Chichester, 1986, 7. Remington R, Schork M.,"Estadistca Biométrice y sanitaria”, PHI, Madrid, 1974. 8. Hoshino, J. Chromatogr. 316, 473, (1984). 9. Scoble H., Brown P., “High-Performance Liquid Chromatography, Advances and Perspectives", volumen 3, cap. 1, Csaba Horvath, Academic Press, N.Y., 1983. 10. Analytical Chemistry, Fundamental Reviews, American Chemical Society, Wash- ington D.C. 11. Nonzioli A. 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