COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.

Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Exactitud relativa recuperacin:

Es la aproximacin entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para el
propsito de esta gua, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de
microorganismo inoculado o nivel de fortificacin.
Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se
hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta
seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentracin microbiana.
Fortificacin de la muestra. Inoculacin de una cantidad conocida del o los microorganismos de
prueba.
Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la
dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando.
Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el
cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperacin.
Lmite de deteccin: Es el numero ms pequeo de microorganismos en una muestra que puede
ser detectado bajo las condiciones de anlisis. El limite microbiolgico de una prueba determina la
presencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de
muestra.
Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.
Mtodo Normalizado: Proceso de medicin robusto donde pequeas variaciones en el
procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados.
Mtodos internacionalmente aceptados y validados.
Nivel de fortificacin o tamao del inculo: Es la cantidad conocida de microorganismos
inoculados a una muestra.
Protocolo para la evaluacin del desempeo: Documento que describe los pasos a seguir
durante la evaluacin del desempeo de un mtodo analtico microbiolgico, cuyo fundamento se
encuentra descrito en el presente documento.
Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecucin de
la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en
situaciones normales.
Evaluacin del desempeo: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un
mtodo normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones
particulares del laboratorio. Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que un
2/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

mtodo analtico validado internacionalmente cumple con su propsito en las condiciones

particulares del laboratorio donde se realiza el anlisis.
Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales obtenidos
por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la misma matriz,
en las mismas condiciones de anlisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos
de tiempo.
Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales
obtenidos por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la
misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medicin (personal) y en diferentes
tiempos (o a intervalos de tiempos ms largos).

DOCUMENTOS APLICABLES

4.1

USP 32, <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods.

4.2

USP 32, <1225> Validation of Compendial Procedures

4.3

USP 32, <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles

4.4

Dulce Toccheto S. Curso-terico-prctico Validacin de Mtodos Microbiolgicos bajo un

Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia. Proyecto TCC/
Bolivia-Mxico. 2007.

4.5

European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological

laboratories. 2002.

4.6

G.A. Leotta, I. Chinen. Validacin de una tcnica de PCR mltiple para la deteccin de
Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiologa. Vol.37, No. 1
2005.

4.7

Gua de Validacin de Mtodos Analticos. Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos

Bilogos de Mxico, A.C. Edicin 2002.

4.8

ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and animal
feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods. First Edition.

4.9

ISO/TR 13843:2000 - Water Quality Guidance on Validation of Microbiological methods.

First Edition.

3/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

4.10

ISO 17994:2004 Water QualityCriteria for Establishing Equivalence between Microbiological

methods. First Edition.

4.11

The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and
Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf
(febrero 2011)

4.12

Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods Committee
Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods
of Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-GuidelinesAppendix-X.pdf (febrero 2011)

DESCRIPCIN DE LA ACTIVIDAD.

5.1

Estrategia para la evaluacin del desempeo de los mtodos de prueba

microbiolgicos.
Para cada mtodo de prueba a evaluar se deber contar con protocolo para la evaluacin del
desempeo particular que describa el mtodo a evaluar, la estrategia particular de evaluacin,
los materiales y reactivos y las especificaciones.
Durante la ejecucin del protocolo de evaluacin se debern documentar las actividades y los
resultados.
Verificar que todos los materiales, medios y reactivos cumplen con los criterios de calidad
conforme se establece en el sistema de gestin de calidad y conforme a la NMX-EC-17025IMNC-2006. Antes de cada validacin deber comprobarse que el equipo utilizado, cumple con
el calendario de mantenimiento y/o calibracin de cada laboratorio.
Con base en el protocolo de evaluacin se deber verificar que se cuenta con todos los
materiales y reactivos, es conveniente contar con un cronograma de las actividades y los
analistas que participaran en la evaluacin del desempeo.
La preparacin del inculo debe ser realizada por un solo analista durante el desarrollo de la
evaluacin del desempeo del mtodo.

5.2

Seleccin y obtencin de la matriz.

Los criterios de seleccin de la matriz se debern describir en el protocolo para la evaluacin
del desempeo de cada mtodo, considerando los siguientes lineamientos:

4/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Se debern elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la metodologa

a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de ella para conocer su
microbiota. Se deber contar con cantidad suficiente de muestra para hacer todos los
anlisis. Las matrices elegidas y su justificacin deben mencionarse en el protocolo de
validacin.

Cuando el mtodo analtico a ser verificado se destina al anlisis de varios tipos de

alimentos, la matriz se escoge con base al cuadro de categoras que aparece en la ISO
16140, y ser aquella donde se esperan las mayores dificultades para la recuperacin
del microorganismo de prueba con respecto de las matrices ms analizadas en el
laboratorio.

5.3

Preparacin del inculo

5.3.1

Determinacin de la concentracin de la cuenta bacteriana en la Fase estacionaria.

Este procedimiento es general y adecuado para la mayora de los microorganismos de prueba,
pueden aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inculos constantes.
Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de
caldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h,
(este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de
microorganismo del que se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a
35C +/- 2C, por 22h a 24h, a partir del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de
ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas de Petri y adicionar agar cuenta estndar,
incubar a 35C +/- 2C, por 18h a 24h, realizar el conteo en cada dilucin para conocer la
concentracin de microorganismos.
Registrar los resultados indicando la concentracin de microorganismos en cada dilucin. Estos
resultados servirn de referencia para la estimacin de la dilucin adecuada a utilizar durante la
fortificacin de las muestras en la evaluacin del desempeo del mtodo de prueba.
Antes de cada prueba deber repetirse la preparacin del inculo de forma idntica que en la
determinacin de concentracin de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inculo
deber ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.
Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubacin, volumen necesario que lleve la concentracin
microbiana, para fortificar cada una de las alcuotas de acuerdo al protocolo de evaluacin de desempeo del mtodo en
particular. Durante su manipulacin se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fra.
Nota 2: Cuando la matriz sea slida, fortificar las alcuotas. Si es lquida se puede fortificar la matriz completa o las alcuotas.

5/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

5.4

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Preparacin de muestras
Registrar la muestra con la siguiente informacin:
Fecha y hora de muestreo,
Tipo de muestra,
Procedencia lugar de muestreo,
Cantidad.
Homogeneizar perfectamente y separar la muestra que se utilizar para el anlisis. Si es
perecedera, el sobrante se debe guardar en refrigeracin. Se recomienda iniciar el anlisis
inmediatamente.

5.4.1

Fortificacin de la muestra.
En condiciones aspticas dividir la muestra cuantitativamente siguiendo el mtodo de prueba.
Inocular la muestra con una concentracin conocida del microorganismo de prueba.

5.5

MTODOS CUALITATIVOS.

5.5.1

Criterios de Aceptacin
Parmetro
Lmite de deteccin
Repetibilidad
Reproducibilidad
Incertidumbre

5.5.2

Criterio de aceptacin
Demostrar que el mtodo es capaz de recuperar
menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las
repeticiones.
No ms del 20 % de las repeticiones con
resultados negativos al inocular menos de 5 UFC
Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen
resultados negativos en no ms del 20 % cuando
realizan al menos 10 repeticiones cada uno.
Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a
las mediciones.

Lmite de deteccin
Demostrar que el mtodo es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de
las repeticiones.
Microorganismo de Prueba: Utilizar al menos aquellos microorganismos indicados como
control positivo en el mtodo de prueba, el tamao del inculo deber ser menor de 5 UFC.
6/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Matriz seleccionada: Verificar por sextuplicado la ausencia del microorganismo de prueba.

Repeticiones: 30 repeticiones.
Clculos:
Lectura =

No. de positivos
100
No. de repeticiones

Ejemplo:
Se desea validar el mtodo para aislamiento de un patgeno; para la determinacin del lmite
de deteccin deber prepararse un inculo de menos de 5 UFC del patgeno.
Al realizar la estimacin de la curva microbiana se determina que en la dilucin 10-7, se obtienen
150 UFC/mL. Antes de la prueba deber preparar un inculo fresco, y realizar diluciones
decimales hasta 10-9, a partir de esa dilucin transferir dos mililitros a cada una de las 30
porciones de muestra. En paralelo verificar el inculo, transfiriendo 1 mililitro de la suspensin a
6 cajas de Petri.
Para la verificacin del inculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los clculos para
determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es vlida si se
inoculan menos de 5 UFC.
Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el mtodo de prueba. Registrar los
resultados de ausencia y presencia.
Ausencia. 5
Presencia 25
Entonces:

Lectura =

25
100 Lectura = 83.33%
30

Conclusin:
Se cumple con el criterio de aceptacin

7/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

5.5.3

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Repetibilidad
Los resultados de mtodos cualitativos se registran comnmente como positivo negativo
presencia-ausencia por lo que la repetibilidad se calcula utilizando los datos obtenidos en la
prueba de limite de deteccin. El criterio de aceptacin es igual o menor al 20%.
Ejemplo:
Usando los datos del ejemplo de lmite de deteccin.
Supongamos que:
Ausencia 5
Presencia 25
Entonces:

Lectura =

5
100 Lectura = 16.66%
30

Conclusin:
Se cumple con el criterio de aceptacin
5.5.4

Reproducibilidad
Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20
% cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.
Las repeticiones debern suceder en momentos diferentes.
Ejemplo:
Analista Uno
Ausencia: 1
Presencia: 9
Analista Dos
Ausencia: 2
Presencia: 8

5.5.5

Lectura =

1
100 Lectura = 10%
10

Cumple el
criterio de
repetibilidad

Lectura =

2
100 Lectura = 20%
10

Cumple el
criterio de
repetibilidad

Se cumple el
criterio de
reproducibilidad

Incertidumbre del mtodo Microbiolgico (Eurachem:2002)

El concepto de incertidumbre no puede ser aplicado directamente a resultados cualitativos en
pruebas microbiolgicas por lo que solo se mencionan las siguientes:
8/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Fuentes de Incertidumbre
Distribucin de los microorganismos en la muestra;
Efecto de la matriz;
Personal operativo;
Mediciones (pesada o medicin de la muestra);
Diluciones y volmenes;
Homogeneizacin;
Calidad de los medios;
Tiempo hasta la inoculacin;
Temperatura de incubacin;

5.6

MTODOS CUANTITATIVOS.
Parmetro
Repetibilidad
Reproducibilidad
Recuperacin
Sesgo
Incertidumbre

5.6.1

Criterio de aceptacin
r < 30 %
R < 30 %
Entre el 90% y el 110% log
La diferencia absoluta
de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log
a) Especificar el mensurando.
b) Identificar las fuentes de incertidumbre

Seleccin de Matrices
Muestras naturalmente contaminadas. Para evaluar la capacidad de un mtodo para
recuperar de forma consistente un microorganismo o grupo de microorganismos de inters, es
importante contar con muestras naturalmente contaminadas, estas debern de ser
comprobadas por el mtodo de prueba por duplicado. Estas muestras debern ser utilizadas
para la comparacin de muestras.
Muestras no contaminadas. Se debe contar con matrices no contaminadas, es decir, que no
cuenten con el microorganismo de inters (en algunos casos pueden producirse artificialmente
mediante esterilizacin).
Se deber comprobar usando el mtodo de prueba por duplicado.
Los resultados de las matrices debern registrarse e incluirse en el informe de validacin.

9/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

5.6.2

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Repetibilidad.
La determinacin de la repetibilidad (r) sirve para verificar el grado de concordancia entre los
resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por el mismo analista, en las mismas
condiciones, en la misma muestra, en intervalos cortos de tiempo.
Analito: Usar una cepa del microorganismo de inters asociado a la prueba.
Nmero de repeticiones: 30 (a excepcin NMP 10 repeticiones)
Nivel de fortificacin: 1 nivel (valor medio)
5.6.2.1 Muestras no contaminadas.
Fortificacin de la muestra. Inocular una concentracin conocida de microorganismos tal que al
concluir el anlisis se recuperen cuentas de aproximadamente el valor medio del intervalo de
lectura.
5.6.2.2 Muestras naturalmente contaminadas.
Verificar por duplicado la concentracin de los microorganismos.
Ejemplo
Cuando el mtodo de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC,
se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 ml de cada dilucin por placa. El inculo en la muestra
debe ser tal que despus del mtodo de anlisis se recuperen aproximadamente 80 UFC
Lmite Inferior log(25)
La diferencia
Diferencia log(25) + 0.5 UFC
entre
log(250)
y
log(25)
entre 2
25
1.40
Lmite Superior log(250)
1
0.5
1.90
79
250
2.40
Lmite Inferior log(15)
La diferencia
Diferencia log(15) + 0.5 UFC
entre
log(150)
y
log(15)
entre 2
15
1.18
Lmite Superior log(150)
1
0.5
1.68
47
150
2.18
Si se considera que se realizar una sola dilucin entonces la concentracin del microorganismo
en la dilucin 10-1 deber ser de aproximadamente 800 UFC, pero considerando que el tamao
de la muestra es de 25 g entonces se deberan inocular aproximadamente 2000 UFC
Nota 3: Todos los inculos deben ser verificados utilizando la tcnica de vaciado en placa,
empleando para el clculo 6 cajas.

10/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Desarrollo
Partiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas,
proceder como se indica en el mtodo de prueba.

Clculos
Calcular el log de las UFC contadas por placa en cada repeticin
A

Repeticin

Placa 1

Placa 2

log(Placa 1)

log(Placa 2)

Repeticin 1

70 UFC

90 UFC

1.85

1.95

Repeticin 2

71 UFC

91 UFC

1.85

1.96

Repeticin 3

80 UFC

80 UFC

1.90

1.90

Repeticin 4

76 UFC

82 UFC

1.88

1.91

Repeticin 5

78 UFC

82 UFC

1.89

1.91

Repeticin 6

77 UFC

88 UFC

1.89

1.94

Repeticin 7

56 UFC

80 UFC

1.75

1.90

Repeticin 8

87 UFC

80 UFC

1.94

1.90

10

Repeticin 9

77 UFC

86 UFC

texto

# "UFC"

# "UFC"

Excel

1.89
=LOG(B2)

1.93
=LOG(C2)

Calcular la desviacin estndar relativa (DSR) y elevar al cuadrado

s
RSD =
x
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Excel

D
log(Placa 1)
1.85
1.85
1.90
1.88
1.89
1.89
1.75
1.94
1.89
=LOG(B2)

E
log(Placa 2)
1.95
1.96
1.90
1.91
1.91
1.94
1.90
1.90
1.93
=LOG(C2)

F
Desviacin Estndar
0.077
0.076
0.000
0.023
0.015
0.041
0.110
0.026
0.034
=DESVEST(D2:F:2)

G
MEDIA
1.900
1.905
1.903
1.897
1.903
1.915
p1.826
1.921
1.910
=PROMEDIO(D2:E2)

H
DSR
0.0406
0.0400
0.0000
0.0123
0.0081
0.0214
0.0600
0.0134
0.0178
=(F2/G2)

Calcular la media cuadrtica de la DSR usando la siguiente frmula

RDS12 + RDS2 2 +... + RDSn2

RSDA =
n
11/23

I
DSR2
0.001651
0.001600
0.000000
0.000151
0.000065
0.000458
0.003600
0.000180
0.000316
=H2^2

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Para determinar la repetibilidad del mtodo se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribucin
normal de Z con 95% de confianza.
Repetibilidad (r)= 2.8 X RSD de repetibilidad
I
DSR2
0.001651
0.001600
0.000000
0.000151
0.000065
0.000458
0.003600
0.000180
0.000316
"=H2^2

5.6.3

J
DSR(a)

K
r

0.0299

0.0836

"=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10)))

"=J2*2.28

Reproducibilidad
La determinacin de la reproducibilidad (R) sirve para verificar el grado de concordancia entre
los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por diferentes analistas, en las
mismas condiciones, en la misma muestra, en diferentes tiempos.
Desarrollo.
Utilizando el mtodo de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes
procedern como se describi para repetibilidad hasta el clculo del cuadrado de la DSR
Ejemplo:
1

Analista

2
3
4
5
6
7
8
9
10

11

Analista

12
13
14
15
16
17
18
19
20

Repeticin
Repeticin 1
Repeticin 2
Repeticin 3
Repeticin 4
Repeticin 5
Repeticin 6
Repeticin 7
Repeticin 8
Repeticin 9

Placa 1
79 UFC
60 UFC
77 UFC
77 UFC
89 UFC
69 UFC
77 UFC
80 UFC
78 UFC

Placa 2
80 UFC
67 UFC
86 UFC
70 UFC
70 UFC
89 UFC
80 UFC
80 UFC
83 UFC

Repeticin
Repeticin 1
Repeticin 2
Repeticin 3
Repeticin 4
Repeticin 5
Repeticin 6
Repeticin 7
Repeticin 8
Repeticin 9

Placa 1
70 UFC
89 UFC
80 UFC
70 UFC
70 UFC
89 UFC
80 UFC
80 UFC
83 UFC

Placa 2
79 UFC
80 UFC
77 UFC
77 UFC
89 UFC
69 UFC
77 UFC
80 UFC
78 UFC

D
Log
(Placa 1)
1.90
1.78
1.89
1.89
1.95
1.84
1.89
1.90
1.89
Log
(Placa 1)
1.85
1.95
1.90
1.85
1.85
1.95
1.90
1.90
1.92

12/23

E
Log
(Placa 2)
1.90
1.83
1.93
1.85
1.85
1.95
1.90
1.90
1.92
Log
(Placa 2)
1.90
1.90
1.89
1.89
1.95
1.84
1.89
1.90
1.89

D.E.
0.004
0.034
0.034
0.029
0.074
0.078
0.012
0.000
0.019

MEDIA
1.900
1.802
1.910
1.866
1.897
1.894
1.895
1.903
1.906

DSR
0.0020
0.0188
0.0178
0.0157
0.0389
0.0413
0.0062
0.0000
0.0100

DSR2
0.000004
0.000354
0.000316
0.000246
0.001511
0.001703
0.000038
0.000000
0.000100

D.E.
0.037
0.033
0.012
0.029
0.074
0.078
0.012
0.000
0.019

MEDIA
1.871
1.926
1.895
1.866
1.897
1.894
1.895
1.903
1.906

DSR
0.0198
0.0170
0.0062
0.0157
0.0389
0.0413
0.0062
0.0000
0.0100

DSR2
0.000394
0.000289
0.000038
0.000246
0.001511
0.001703
0.000038
0.000000
0.000100

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Calcular la media cuadrtica utilizando la siguiente frmula:

RDS12 + RDS2 2 +... + RDSn2

RSDAB =
n
Para determinar la reproducibilidad del mtodo se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la
distribucin normal de Z con 95% de confianza.
Reproducibilidad (R) = 2.8 X RSD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

I
DSR2
0.000004
0.000354
0.000316
0.000246
0.001511
0.001703
0.000038
0.000000
0.000100
DSR2
0.000394
0.000289
0.000038
0.000246
0.001511
0.001703
0.000038
0.000000
0.000100

J
DSR(ab)

0.0309

K
R

"=RAIZ((SUMA(I2:I10,I12:I20)/CONTAR(I2:I10,I12:I20)))

"=J2*2.28

0.0865

5.6.4 Recuperacin
Es la cantidad de UFC que el mtodo de prueba es capaz de recuperar cuando es inoculado un
numero conocido de microorganismos.
Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC,
en cada repeticin y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el
logaritmo del inculo verificado.
Finalmente calcular el % de recuperacin
% Recuperacin= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100
Logaritmo de las UFC inoculadas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

A
Analista

B
Repeticin
Repeticin 1
Repeticin 2
Repeticin 3
Repeticin 4
Repeticin 5
Repeticin 6
Repeticin 7
Repeticin 8
Repeticin 9

C
Placa 1
79 UFC
60 UFC
77 UFC
77 UFC
89 UFC
69 UFC
77 UFC
80 UFC
78 UFC

D
Placa 2
80 UFC
67 UFC
86 UFC
70 UFC
70 UFC
89 UFC
80 UFC
80 UFC
83 UFC

E
Cuenta
80 UFC
64 UFC
82 UFC
74 UFC
80 UFC
79 UFC
79 UFC
80 UFC
81 UFC
=PROMEDIO(B2:C2)

F
log(Cuenta )
1.90
1.80
1.91
1.87
1.90
1.90
1.89
1.90
1.91
=LOG(E2)

13/23

G
Media (log(Cuenta ))

H
Inculo

I
log (Inculo)

J
% Recuperacin

1.89

80 UFC

1.90

99%

"=LOG(H2)

"=G2/I2

=PROMEDIO(F2:F10)

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

5.6.5

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Sesgo

El sesgo es la diferencia absoluta entre el valor conocido como verdadero y el valor obtenido
experimentalmente.
A partir de los clculos de recuperacin, calcular el valor absoluto de la diferencia de la media
de los logaritmos de las cuentas menos el logaritmo del inculo utilizado.
Sesgo=
 

Donde Ve= valor esperado
Vo= valor obtenido
5.6.6

Incertidumbre.

Especificar el mensurando.
Identificar las fuentes de incertidumbre
5.7 Criterios de aceptacin para la evaluacin de mtodos microbiolgicos.
Cuantitativos
Parmetro
Repetibilidad
Reproducibilidad
Recuperacin
Sesgo
Incertidumbre

Criterio de aceptacin
r < 30 %
R < 30 %
Entre el 90% y el 110% log
La diferencia absoluta
de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log
a) Especificar el mensurando.
b) Identificar las fuentes de incertidumbre

Cualitativos
Parmetro
Lmite de deteccin
Repetibilidad
Reproducibilidad
Incertidumbre

Criterio de aceptacin
Demostrar que el mtodo es capaz de recuperar
menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las
repeticiones.
No ms del 20 % de las repeticiones con
resultados negativos al inocular menos de 5 UFC
Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen
resultados negativos menores o iguales al 20 %
cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.
Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a
las mediciones.

14/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

5.8 Elaboracin del protocolo

Elaborar un protocolo de validacin que incluya lo siguiente:
Ttulo
1.Objetivo
2. Campo de aplicacin
3. Mtodo de ensayo
4. Equipo
5. Materiales
6. Reactivos y Medios de
Cultivo

Protocolo para la evaluacin del desempeo del mtodo: el nombre y clave

del mtodo que se pretende evaluar.
Considerar los parmetros de desempeo a evaluar y el analito a
determinar
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validacin
Elaborar un diagrama de flujo del mtodo en cuestin
Mencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificacin
y/o calibracin, si aplica)
Indicar los materiales a utilizar
a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
b) Indicar los medios de cultivo a utilizar
c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inculos

Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento y cantidades de

7. Muestras
muestra estimadas para llevar a cabo la validacin.
Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas.
8. Desarrollo
Detallar las instrucciones para cada uno de los parmetros de desempeo
experimental
a ensayar.
9. Resultados
Formato para el registro de resultados
Establecer para cada parmetro de desempeo la herramienta estadstica
10. Anlisis estadstico
a utilizar para su evaluacin.
11. Criterios de
Establecer los criterios de aceptacin que deben cumplirse con su
aceptacin
respectiva referencia bibliogrfica.
Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.

5.9 Ejecucin del protocolo

Debern documentarse todos los resultados en los formatos descritos en sus protocolos, todos
los registros debern estar firmados por el personal que realiza la actividad y mostrar evidencia
de supervisin.
Cuando se realice un cambio con respecto al protocolo establecido, este deber estar
documentado y autorizado.

15/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

5.10 Elaboracin del Informe

Elaborar un informe de resultados de validacin que incluya lo siguiente:
Ttulo
1.Objetivo
2. Campo de aplicacin
4. Equipo
5. Materiales
6. Reactivos y Medios de
cultivo

7. Muestras

8. Mtodo de ensayo

Informe de resultados de la evaluacin del desempeo del mtodo: el

nombre y clave del mtodo que se evalo.
Considerar los parmetros de desempeo evaluados y el analito
determinado.
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplic la validacin
Listado
de
los
equipos
utilizados
y
su
estado
de
calibracin/verificacin/mantenimiento
Listado de los materiales utilizados.
Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.
Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento, marca, presentacin,
caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo la
validacin.
Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas
utilizadas.
Incluir el diagrama de flujo del mtodo.

9. Desarrollo
experimental

Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los

parmetros de desempeo.
Presentacin de resultados en forma de tablas, sealando fechas de inicio
10. Resultados
y trmino, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz,
unidades y clave de bitcora o registro primario
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptacin considerados y los
11. Anlisis de resultados
resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.
Efectuar una conclusin final en donde se seale que el mtodo se ajusta al
12. Conclusin
uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)
13. Bibliografa
Referencias utilizadas.
Los que aplique:
Registros primarios,
Bases de datos utilizadas
Certificados de equipos,
14. Anexos
Medios de cultivo
Cepas
Formatos de verificacin,
Grficos de control, etc.
Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.
16/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

6.0 NOTIFICACIN DE VIGENCIA

Se otorga un periodo de transicin de 180 das contados a partir de la fecha de publicacin para que
los laboratorios que se encuentren autorizados o en proceso del mismo se apeguen a stos criterios.
Para los laboratorios que soliciten autorizacin posterior a la fecha de publicacin, debern cumplir
stos criterios de inicio.
Estos criterios se aplicarn en todos los procesos de evaluacin que se realicen a los 180 das
naturales, a partir de la fecha de publicacin del documento en la pgina web de la COFEPRIS.

17/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Anexo Informativo 1
Gua Informativa para la fortificacin de una matriz
La fortificacin de muestras se hace por medio de la adicin de diluciones conocidas del
microorganismo a prueba, a partir de su Fase Estacionaria (FE), en la matriz en cuestin, como sigue:
Estimacin de la dilucin de trabajo
A partir de un cultivo del microorganismo de inters en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento).
Hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente que
utilice el laboratorio.
Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar
cuenta estndar.
Realizar las lecturas y clculos de los nmeros de clulas en cada una de las diluciones para establecer
la dilucin que ser usada en la fortificacin de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y
clculo.
Preparacin del Inculo
Preparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados
obtenidos en la estimacin de la dilucin de trabajo, verificar la concentracin del inculo por
sextuplicado.

18/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Anexo Informativo 2
Gua informativa de formatos
Cuadro 1: VALIDACIN PARCIAL DE:

FASE ESTACIONARIA
Analista:
Nombre del microorganismo:
Caldo:

Fecha:

Volumen de caldo:

Intervalos de tiempo de lectura:

Horas

vol. de inculo
en placa

Dilucin

Temperatura y tiempo total de incubacin:

FE en UFC/mL=

Cuenta UFC
Placa 1

Cuenta UFC
Placa 2

Promedio de
cuentas

UFC/mL

Clculos:

Cuadro 2: VALIDACIN PARCIAL DE:

CLCULO DE INCULOS
Analista:
Nombre del microorganismo:

Fecha:

Parmetro de desempeo:
FE en UFC/mL=
Dilucin
de FE

Concentracin
de UFC/mL

Dilucin

Nivel y concentracin a la
que se quiere llegar en
UFC/g mL

Clculos:

19/23

Dilucin
seleccionada

Volumen
necesario

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Cuadro 3: Anlisis de la matriz en estudio (prueba de ausencia del analito).

Matriz:

Mtodo de prueba:

Fecha:

Analito:

UFC/mL en FE: _________________

Analista:
Parmetro de desempeo:
Alcuotas de 25 g
1
2
3
4
5
6

Resultado del anlisis

Observaciones

Cuadro 4: Clculos para la obtencin de los datos de la dilucin y el volumen seleccionado de la FE para
fortificar las alcuotas de la matriz en estudio del LD.
Matriz:
Fecha:
Parmetro de desempeo:
Lmite de deteccin
Nivel a confirmar:
LD no declarado: _______ UFC/25g
LD declarado:_______
No. de alcuotas: _____________

Analista(s):
Mtodo de prueba:
Analito: ________________________________________
No. de UFC/mL en FE: ____________________________
Niveles que se prueban:

Cantidad de muestra por alcuota: _________

Nivel: ________
Dilucin seleccionada de la FE:
Concentracin en UFC/mL que corresponde a la dilucin seleccionada:
Clculos:

RESULTADOS:
Dilucin de FE:___________
Volumen de FE:___________

20/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Cuadro 5: Resultados del parmetro de Lmite de Deteccin

Matriz:

Mtodo de prueba:

Fecha:

Analito:

UFC/mL
en
________

No. de replicas del nivel

declarado: 30
FE:

Analista:
Nivel de
fortificacin (N1)

Concentracin
esperada en
UFC/25g

Resultado
(registrar (+) o (-) )

No. total de positivos x 100 /

No. total de alcuotas

1
2

3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15.30
R= resultado, en esta tabla se registran 3 porque se hace la determinacin por nivel para 3 medios de cultivo en el caso de
Salmonella.
N1= nivel declarado en el mtodo de prueba.

21/23

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Anexo Informativo 3
Gua informativa para la construccin de hojas de clculo
Porcentaje de recuperacin
Analista

Repeti
cin

Placa
1

Placa
2

Cuenta
=PROMEDIO(C2:D2)
=PROMEDIO(C3:D3)
=PROMEDIO(C4:D4)
=PROMEDIO(C5:D5)
=PROMEDIO(C6:D6)
=PROMEDIO(C7:D7)
=PROMEDIO(C8:D8)
=PROMEDIO(C9:D9)
=PROMEDIO(C10:D10)

=CONCATENAR("log(",E
1,")")
=LOG(E2)
=LOG(E3)
=LOG(E4)
=LOG(E5)
=LOG(E6)
=LOG(E7)
=LOG(E8)
=LOG(E9)
=LOG(E10)

Cuenta
=AVERAGE(C2:D2)
=AVERAGE(C3:D3)
=AVERAGE(C4:D4)
=AVERAGE(C5:D5)
=AVERAGE(C6:D6)
=AVERAGE(C7:D7)
=AVERAGE(C8:D8)
=AVERAGE(C9:D9)
=AVERAGE(C10:D10)

=CONCATENATE("log(",E
1,")")
=LOG(E2)
=LOG(E3)
=LOG(E4)
=LOG(E5)
=LOG(E6)
=LOG(E7)
=LOG(E8)
=LOG(E9)
=LOG(E10)

=CONCATENAR("Media
(",F1,")")

Inculo

=PROMEDIO(F2:F10)

=CONCATENAR("log
(",H1,")")

=LOG(H2)

%
Recuperacin

=G2/$I$2

Sesgo
Analista

Repeti
cin

Placa
1

Placa
2

=CONCATENATE("Media
(",F1,")")

Inculo

=CONCATENATE("log
(",H1,")")

=AVERAGE(F2:F10)

=LOG(H2)

SESGO

=ABS(G2I2)

Reproducibilidad
Analista

Analista

R
ep
eti
ci
n

R
ep
eti
ci
n

Plac
a1

Plac
a1

Plac
a2

Plac
a2

=CONCATENAR("log(
",C1,")")

=CONCATENAR("log(
",D1,")")

=LOG(C2)

=LOG(D2)

=LOG(C3)

=LOG(D3)

=LOG(C4)

=LOG(D4)

=LOG(C5)

=LOG(D5)

=LOG(C6)

=LOG(D6)

=LOG(C7)

=LOG(D7)

=LOG(C8)

=LOG(D8)

=LOG(C9)

=LOG(D9)

=LOG(C10)

=LOG(D10)

=CONCATENAR("log(
",C11,")")

=CONCATENAR("log(
",D11,")")

=LOG(C12)

=LOG(D12)

=LOG(C13)

=LOG(D13)

=LOG(C14)

=LOG(D14)

=LOG(C15)

=LOG(D15)

=LOG(C16)

=LOG(D16)

=LOG(C17)

=LOG(D17)

=LOG(C18)

=LOG(D18)

=LOG(C19)

=LOG(D19)

=LOG(C20)

=LOG(D20)

Desviacin
Estandar
=DESVEST(E2
:F2)
=DESVEST(E3
:F3)
=DESVEST(E4
:F4)
=DESVEST(E5
:F5)
=DESVEST(E6
:F6)
=DESVEST(E7
:F7)
=DESVEST(E8
:F8)
=DESVEST(E9
:F9)
=DESVEST(E1
0:F10)

Desviacin
Estandar
=DESVEST(E1
2:F12)
=DESVEST(E1
3:F13)
=DESVEST(E1
4:F14)
=DESVEST(E1
5:F15)
=DESVEST(E1
6:F16)
=DESVEST(E1
7:F17)
=DESVEST(E1
8:F18)
=DESVEST(E1
9:F19)
=DESVEST(E2
0:F20)

22/23

MEDIA
=PROMEDIO(E
2:F2)
=PROMEDIO(E
3:F3)
=PROMEDIO(E
4:F4)
=PROMEDIO(E
5:F5)
=PROMEDIO(E
6:F6)
=PROMEDIO(E
7:F7)
=PROMEDIO(E
8:F8)
=PROMEDIO(E
9:F9)
=PROMEDIO(E
10:F10)

MEDIA
=PROMEDIO(E
12:F12)
=PROMEDIO(E
13:F13)
=PROMEDIO(E
14:F14)
=PROMEDIO(E
15:F15)
=PROMEDIO(E
16:F16)
=PROMEDIO(E
17:F17)
=PROMEDIO(E
18:F18)
=PROMEDIO(E
19:F19)
=PROMEDIO(E
20:F20)

DSR
=G2/H
2
=G3/H
3
=G4/H
4
=G5/H
5
=G6/H
6
=G7/H
7
=G8/H
8
=G9/H
9
=G10/
H10

DSR
2
=I2^
2
=I3^
2
=I4^
2
=I5^
2
=I6^
2
=I7^
2
=I8^
2
=I9^
2
=I10
^2

DSR
=G12/
H12
=G13/
H13
=G14/
H14
=G15/
H15
=G16/
H16
=G17/
H17
=G18/
H18
=G19/
H19
=G20/
H20

DSR
2
=I12
^2
=I13
^2
=I14
^2
=I15
^2
=I16
^2
=I17
^2
=I18
^2
=I19
^2
=I20
^2

DSR(ab)

=RAIZ((SUMA(J2:J10,J12:J20)/CO
NTAR(J2:J10)))

=K2*
2.8

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS.
Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Repetibilidad
Repetici
n

Placa
1

Placa
2

=CONCATENAR("log(",
B1,")")

=CONCATENAR("log(",
C1,")")

=LOG(B2)

=LOG(C2)

=LOG(B3)

=LOG(C3)

=LOG(B4)

=LOG(C4)

=LOG(B5)

=LOG(C5)

=LOG(B6)

=LOG(C6)

=LOG(B7)

=LOG(C7)

=LOG(B8)

=LOG(C8)

=LOG(B9)

=LOG(C9)

=LOG(B10)

=LOG(C10)

Desviacin
Estandar
=DESVEST(D2:E
2)
=DESVEST(D3:E
3)
=DESVEST(D4:E
4)
=DESVEST(D5:E
5)
=DESVEST(D6:E
6)
=DESVEST(D7:E
7)
=DESVEST(D8:E
8)
=DESVEST(D9:E
9)
=DESVEST(D10:
E10)

23/23

MEDIA
=PROMEDIO(D2:
E2)
=PROMEDIO(D3:
E3)
=PROMEDIO(D4:
E4)
=PROMEDIO(D5:
E5)
=PROMEDIO(D6:
E6)
=PROMEDIO(D7:
E7)
=PROMEDIO(D8:
E8)
=PROMEDIO(D9:
E9)
=PROMEDIO(D10:
E10)

DSR
=F2/G2
=F3/G3
=F4/G4
=F5/G5
=F6/G6
=F7/G7
=F8/G8
=F9/G9
=F10/G
10

DSR2
=H2^
2
=H3^
2
=H4^
2
=H5^
2
=H6^
2
=H7^
2
=H8^
2
=H9^
2
=H10
^2

DSR(a)

=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR
(I2:I10)))

=J2*2
.8