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08/12/2013

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MÉTODOS HISTOLÓGICOS

GISELA GARCÍA CRESPO. Profª Titular

Facultad de Ciencias Veterinarias

Histo

Creado por Ysrael Villamarín Dibujo: Jan Acevedo

MÉTODOS HISTOLÓGICOS
• Los métodos o técnicas histológicas se puede definir como: la serie de procedimientos especiales a los que se somete el material que se va a estudiar bajo el microscopio (Histológicamente)

METODOS HISTOLÓGICOS
• DIRECTOS( En vivo) • INDIRECTOS (Postmorten) • COLORACIÓN

MÉTODOS DIRECTOS
• ESTUDIO DONDE SE EMPLEAN PROCEDIMINETOS QUE NO AFECTAN LA BIOLOGÍA CELULAR, O PERMITEN OBSERVAR LOS CAMBIOS QUE SUFRE ANTE DETERMINADOS PROCEDIMIENTOS.

METODOS INDIRECTOS
• PROCEDIMIENTOS QUE REQUIEREN MAYOR TIEMPO PARA PODERLOS EJECUTAR, A VECES REQUIEREN DE UNA FIJACIÓN PREVIA. • SON PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTMORTEN.

Entre estos procedimientos contamos...

METODOS HISTOLÓGICOS
• CULTIVOS CELULARES Se cultivan células fuera del organismo que les dio origen.
Requiere un medio apropiado: aséptico (sin agentes nocivos), temperatura, pH, humedad, nutrientes, etc. Ej: HeLa, linfocitos, etc.

CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS CELULARES

METODOS HISTOLÓGICOS
• AUTORRADIOGRAFIA:Técnica por la cual un objeto radiactivo produce una imagen de sí mismo sobre una película fotográfica. La imagen se denomina autorradiografía

Autorradiografía

METODOS HISTOLÓGICOS
• CENTRIFUGACIÓN ULTRACENTRIFUGACIÓN Se obtienen células o componentes subcelulares específicos de acuerdo a su gradiente de sedimentación Ej.: glóbulos rojos, glóbulos blancos; mitocondrias, retículo endoplasmático, etc.

METODOS HISTOLÓGICOS
• INJERTOS O TRANSPLANTES
– Homo-injertos: se realizan en la misma
especie
• Auto-transplantes ( el mismo individuo)
• Alo-injertos (diferentes individuos) – Isotransplante

Homotransplante

Alotransplante

METODOS HISTOLÓGICOS
– Hetero-injertos o xeno-injertos: se efectúan
entre especies diferentes

Xenotransplante o heterotransplante

Xenotransplante o heterotransplante

METODOS HISTOLÓGICOS
• Disociación

• Escisiones
• Iluminación especial

METODOS HISTOLÓGICOS
• Disociación

• Escisiones

METODOS HISTOLÓGICOS
• Maceraciones • Inyecciones

METODOS HISTOLÓGICOS
• Reconstrucciones

METODOS HISTOLÓGICOS
• Fotografías • Videos • Dibujos

METODOS HISTOLÓGICOS
• DIRECTOS • INDIRECTOS • COLORACIÓN

METODO DE COLORACIÓN
• SE BUSCA CONTRASTAR COMPONENTES CELULARES O EXTRACELULARES A TRAVÉS DE SUSTANCIAS CROMÓGENAS.

TEORÍAS DE LA COLORACIÓN
FÍSICA QUÍMICA FÍSICO-QUÍMICA

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES
CLASIFICACIÓN POR SU ORIGEN
• NATURALES • ARTIFICIALES

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES
CLASIFICACIÓN POR SU ORIGEN
• NATURALES

COLORANTES
NATURALES
VEGETALES

• hematoxilina, azafrán, orceína.

COLORANTES
ANIMALES • carmín (cochinilla)

COLORANTES
ARTIFICIALES
PIGMENTOS

• rojo rutenio, verde brillante, azul de Prusia. • Derivados de la anilina • (destilación de la hulla)

Colorantes. Clasificación química
• Colorantes Básicos • Colorantes Ácidos • Colorantes Neutros

...

Procesamiento Histológico
Fases o procesos:

• • • • • • •

Toma de la muestra Fijación Repicado Inclusión de la muestra Corte al micrótomo Coloración Montaje

Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra – Identificación • Especie • Raza • Número • Etc.

Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra – Tamaño

Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra
– Tamaño: 0,5 a 1 cm

FIJACIÓN

PRINCIPIO DE LA FIJACIÓN CARACTERÍSTICAS DE UN BUEN FIJADOR

FIJACIÓN
Formol al 10 %

Inmersión o perfusión

Procesamiento Histológico
• Toma de la muestra
– Identificación

Repicar la muestra

Procesamiento Histológico
• TOMA DE LA MUESTRA (0,5-1 CM) • FIJACIÓN: 40-60 VECES EL VOLUMEN • LAVADO EN AGUA CORRIENTE ¿cómo cortar tan delgado? ¿ 5 micrómetros?

¡¡¡ parafina !!! ... Pero y el agua?
¡¡¡ No son miscibles!!!

Procesamiento Histológico
• DESHIDRATACIÓN EN ALCOHOLES CRECIENTES (50º- 100º) • ACLARAMIENTO EN XILOL • INCLUSIÓN EN PARAFINA

• CONFECCIÓN DE LOS BLOQUES

Inclusión en parafina
• Procesamiento de la muestra
– – – – Lavado Deshidratación Aclaramiento (xilol) Inclusión en parafina

Inclusión
• Confección del bloque
– Identificación

Inclusión
• Confección del bloque

Corte al microtomo

• 5 micrómetros – Deslizamiento – Rotación

MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO

Procesamiento Histológico
Microtomos de deslizamiento

Corte al microtomo
• 5 micrómetros – Microtomos de rotación

Procesamiento Histológico

• Recolección de los cortes – Pescado (baño María)

Procesamiento Histológico
• Recolección de los cortes

• Desparafinación – Estufa – Xilol
¿ y el agua ? ...

• Hidratación(alcoholes decrecientes) • Coloración

COLORACIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA

COLORACIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA
• Coloración – Desparafinación (xilol) – Hidratación – Coloración Hematoxilina – Coloración Eosina

HEMATOXILINA & EOSINA
RESUMEN:
• • • • CORTE AL MICROTOMO RECOLECCIÓN (BAÑO DE MARÍA) DESPARAFINACIÓN (XILOL) HIDRATACIÓN ALCOHOLES DECRECIENTES (100º A-AGUA) • COLORACION HEMATOXILINA( núcleo- ácidos)

HEMATOXILINA & EOSINA
• • • • • • LAVADO AGUA CORRIENTE COLORACIÓN EOSINA LAVADO CON AGUA DESHIDRATACIÓN ACLARAMIENTO MONTAJE

Tipos de coloración ( acorde color producido )

Tipos de coloración ( acorde color producido )
• Ortocromática • METACROMÁTICA • Impregnación

Tipos de coloración ( acorde color producido )
• Retrógrada
• Progresiva

• VITAL (in vivo, in vitro)
• Histoquímica

MÉTODOS HISTOQUÍMICOS
Para carbohidratos: PAS, PAS-D Lípidos.: SUDÁN, ACEITE ROJO Ácidos nucléicos: FEULGEN Pigmentos y minerales: VON KOSSA (Ca.) EnzimaS : FOSFATASA (alcalina , ácida), ESTERASAS

MÉTODOS HISTOQUÍMICOS

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS TEJIDOS

MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS
ENZIMAS (P-AP), FLUORESCENCIA

OTRAS COLORACIONES
• PARA TEJIDO CONJUNTIVO • FIBRAS RETICULARES • IMPREGNACIONES ARGÉNTICAS Y ÁUREAS • CELULAS CROMAFINES • HONGOS • BACTERIAS

Coloración H & E

COLORACIÓN H & E

HISTOQUÍMICA: Azul Alciano

HISTOQUÍMICA: PAS

COLORACIONES ESPECIALES: TRICRÓMICAS

COLORACIÓN FIBRAS ELÁSTICAS

FIBRAS ELÁSTICAS

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA

METACROMASIA: AZUL DE TOLUIDINA

TRICRÓMICA

CME “DR. HUMBERTO FERNÁNDEZ MORÁN”

PANTALLA FLUORESCENTE

RESULTADO

Transmisión

Barrido

GRACIAS POR SU ATENCIÓN

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