Capitulo 3 SELECCION, MANTENIMIENTO Y MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL. Seleccion Debiddo a que el éxito o faacaso de un proceso fermentative eomienza con el anism utilizada, en [a eleccidn del mismo se deber‘an tener en cuenta iterios generales que se indican a continuacién: 1. La cepa utilizar debe ser gensticamente estable 2. Su velocidad de crecimiento debera ser alt 3. Lacepa debe esa libre de contaminantes, inculdosfagos. 4. Sus requerimientos nutriciones deberian ser stistechos u pats de medios deculive de costo reduc. 5. Debe"ser de fie conservuci6n por largos periods de tiempo. sn pe sus earacteristicas particulars. 6, Debera llevar cabo el proceso fermentative completo en un timp corto, Sil objetivo del proceso es un producto, éste deberia ser dealt rendimiento Y de fell extraceibn del medio de culo. Los microorganistnos que se utilzan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a parr de fuentes naturales o de una eoleeidn de cutivos. A nivel anus, en general, cada firma posce su propia coleveign de onginists, smu hos de los cules han sido meforados a través de ténicasclisicas de mutacién 0 de ingenieria genic. Sin embargo, estas cepa sdlo son empleadas por la indus ta qu las posec, debido al gran aor comercial de las misnas, Ena $08 So dispone de orgaismos modificades genéicamente para llevar a Cabo reat ciones expecifieas de biosintsis, degradacin obiocatlisis, los uales estan pro- teuidos por patentes. Esto sini que un gran poreentae de organises aie dios o modiffeados no son disponibles para uso general en laboratories. Erxisten ci clr an gyn ianero de Colecciones depositaris dle cltsos Entre la diversdad de coleccnes se dstacan: "American Type Culture Collec- tion USA, la cual mantiene bacteria, evadluras,algas, atinomyeetes, pokes, protcze0s, Virus y leas elulares. "Colletion Nationale de Cultures de Microor funismies® del sttut Pasteur. Francia: "Northern egional Researgh Labora tory" (NRRL), de Peoria, USA, y "National Collection of Type Cultures, Londres, ida de Sil orgunismo a usiizar es aislado de fuentes naturales eommo agua, suelo plantas y cescelos. la eleccion del material de pastida puede hacerse eniendo en {cuenta que el organismo exprese en ese ambiente kas propiedades que son de in- teres. Por cjemplo, en suelo tcatados eon pesticidas se podria encontrar oF nisinos adaptidos a la degradhcidn de estos productos quitnices: 0 en karvas de Elewida la fuente de aiskamiento, las posibifidades de éxito dependen de Ia tenica elegida para el mnismo: en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, © b) enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestraUna ver efectuado el muestreo y seleccién (screening) para cl aislamiento de debe tener en cuenta que ka composician quimiea del material a partir del cual Se vaca realizar el aislamiento comienza a variar a partir del snomento en que &5 0- mada la muestra, por lo tanto ésta se debe procesar ripiéamente, tatando de cvituralteraciones gue afecten a la poblacion de 2) Aislamiento directo: en este caso es descable que el medio que se utiliza ra el aislannento permita la maxima expresiin del material genético del orga hismo, Sise busca por ejemplo un organismo con acein antimcrobiana, se pusde crecer al potencial proxluetor. en una caja de petri en presencia del 0 los 0 ‘mos contra los cuales se requiere la accion antimicrobiana, observindose la pro- uB y por lo tanto el organismo A podra ser selec- cclonado a pesar de que umA < umB (uz = valor de wa partir del cual uB > uA). Mantenimiento 0 conservacién de los cultivos Los objetivos de la conservacion de los cultivos se porian resumi en os si- uguientes aspectos: a) preserva la pureza genética del cultivo sm pérdida de nin- ma de sts propiedakes bingutimieas, b) preserva las n'veles de su productivi iad inivial e) lograr que el eultivo pueda sex transportado y meangjado con facili dag. Esto iltimo puede ser un factor esencial en la seleccién de un método de preservacion, En todo trabajo de Microbiologia se deben conocer las earacteristicas de ka wlaciin cor ka cual se va a wabujar (propiedaces morlologicas y bioguimnicas) En este sentido, tanto en la conservacion como en el desarrollo del cul, ya sea cl que suniiistra o el que recibe la cepa, deberian usar las misinas técnicas me todoldgicas. Tanto para el mantenimiento, preparacién y propagacién de inéculos, se deben usar métodos reprodhueibles que no produzcan variaciones 0 pérdidas de las caracteristicas de la vepa empleada, 'No hay métados de mantenimento en process industriales que Sean comu- nes a toa las inustrias. empleindose en algunos casos metodos especificos Se~ eretos. cas del cultivo es esencial en la eleccién de tun método de preservacion, La identidad del cultivo puede conocerse en base a suis caracteristies de crecimiento en uno o mais medios espetifices,tommand en consideracién propiedades macro y microscdpicas exhibidas, o en base a una eva- luaciin mas exhaustiva empleandy muchos ensayus bioguiinieos, biologics. in munologicos y genéticos. En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibi lidad de determinar en cada etapa sia habido o no alteracion genética, En la mayoria de las situaciones solamente se pueden notar cambios mensurables U observables cales como pigmentacién, morfologia,reacciones fermentativas, pro- piedales microscapieas, ete. El anilisis de estos parcimetros junta con la determi- nacin eusintitativa del recuento de colonias antes y después del proceso de man- tenimiento brindan la informacion necesaria para la eorrecta evaluaeion de la ‘técnica de conservacién a elegir Los métodos de preservaci6n o mantenitniento mas importantes son los si- guientes: El conocimiento de las caracteri Subcultivos 4el cultivo en un medio nutritivo fresco. El intervalo de transferencia varia con el mieroorgantismo, debiendo considerarse el medio edecido para cada especie Una ver desarrollados los cultivos se mantienen a4 °C durante lapsos gue asei- lan entre 15 dias ¥ 2 meses. Los inconvenientes yue presenta son vavins: a) inere= seato de la posibilidad de mutacion eon cad transfereneia, eon perdida de las caracteristieas del organissno: b) contamninacidin: €) alleracianes en el medio de cultivo, durante la estadia et fro, en Ta cual se produce una desecacion lua del asain,Mantenimiento bato capa de aceite Tsuna conica cing y clectva para prolongar la conservaciin de muches organismosy consiste en eebrir completannte ef cullive despues de su desarrro- ilo en medio sido, con una capa de aceite mineral o vaslin est. Los cltivos nesta forma se pueden conservar a temperatura ambiente ain mejor en bela fone lot microorganismos pueden continuarreproducisndose, con posbiidades de aparicién de mutantes: sin embargo se acepta gue estas alteraciones no se ob- servi fst lag es ans ee mason mente Congetacién Debido a que la actividad metabiliea de uns eélula se reduce considerable mente por shanteniiniento a muy baa temperatura, la congelacion es una teenies de eleccién, ya sea para cortos o largos periodos de tiempo. A esto ha contribuido también la mayor disponibilidad de nitrogeno liquido (-196 °C) y el mejoramiento de los equipos de refrigeracion, La teenica involuera cl ereeirniento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa [as eélulas son mis resistentes a los daiios por congelacidn y descongelacidn, que las de fase exponen- cial. Tambien es aconscjable utilizar uns densidad celular elevads en la eongela tion, debido a que, cuando parce de las e€lulas se lsan se hberarian sustaneias Grigprotectoras que aumnentarian el porcentae de eélulas sobrevisientes Las células 1 eongelar pueden ser resuspendidas diteclamente en un agente exioprowetor o se puede agresar el mismo como adicivo al medio de eultivo. FI ins emplead es glicerol al 10%, augue ottos agentes como dimetilsultioxido, locosa, dextrans, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extrato de malta, han sie do también empleados. La suspension cellar es coloeada en ampollas (vidsio o plstico) y sellada antes de colocarla bajo nitrégeno liquido. Uno de los problemas de esta técnica se refiere a la velocidad de congelacién, Muchos estudios son coincidentes en sefalar que una velocidad de congelt- cién lenta ¥ una ripida descongelavisn rinden los mayores nomeros de eélulas viables. Se encontro que dependiendo de la naturaleza de las eélulas, existe una velocidad de congelacion optima en cada cuso para obtener ura smi sobgevi- dda, Como eriterio general se puede decir que, lo mas ampliamente usado es el en- friamiento a 1°C mint (ya que una rapids cangelaeion causa ruptura de mem branas) hasta -20 °C y luego un rapido descenso. Eu cuanto a temperatura de conservaeién, la unis baja recomendada es -70 °C, ya que a temperaturas mnis altas acusren algunas recristalizaciones, kas Cust les s) sum intracellates son letaes para las eclulas, En caso de aitrégeno liquido, lo conservacién podria prolongarse por aos Cuttivos en tierra La tiema estéril puede see inocukada con un cutive e incubsda varios dias para inducis esporulacion de bailos aerobios y anaerabios, Una vez que la mise a se manifiesta, a tierra es secada (desecador) y el eultivo mantenide de esta forma en una atmosfera Seca o en refrigerador, FT metodo ha sido utilada ante pliamemte con hongos y actinomyeetes, los euitles han sida mantenidos en estascondiciones varios aitos, Tambien se puede utiliza directa de suspensiones de esporos. 7a para fa eonservacidn Preservacién en celulosa El empleo de un soporte de papel para el mantenimiento de eélulas en condi ciones de ausencia de agua es un procedimiento adecuado y sencillo, para conser- var cepas. La técnica consiste en embeber tiras de papel de filtro con una suspen- sign densa de organismos en stero, glutarmato de sogio v otto agente, las mismas son posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado bajo vacio. De es- ta forma se han logeado conservar cepas de Streptomyres y Salmonella por perio- ddos de hasta 2 aiios a temperatura ambiente Liofilicacién La linflizacion esta considerada como el método mis adecuad para Ia pr servacién de mictoorganismos. La téenica involuera el congelamiento de un cult vo sega por un secado bajo vacio, lo cual resulta en la sublimaciéin de agua la suspension celular. La ventaja es cue la mayoria de los organismas sobrevive al secide y el culsive es fucilmente muantenido aint temperatura unibiente sin percia significativa de viabiligad La liofilizacién es apropiada para la conservacién de la mayoria de las bacte- rias, encontrandose que las Gram-positivas sobreviven mejor que las Gram-nega- tivas cuando se las lofiliza y mantiene en condiciones similares, También se ome plea en la conservacién de esporos, actinomycetes y muchos hongos incluidas le- yaduras. Sin embargo, no es adecttada para células animales, alyts y hongos en fase de micelio. La técnica eonsiste en patti de un cultivo de fase estaeionaria (donde las e€- lulas son usuallmente mas resistentes) resuspendiendo lis células com un snedio crioprotector, en el eu se obtenga una alta densidad celular. Unas pocas gotas, de suspension celular son sransferidas a una ampolla, ka ctial es congelida a aprosimadamente 40°C y deshideatada mediante una sublimacin en vacio, Es: te debe ser manent en 5-10 unn mediante una bomba, El secado contin Teas- ta Heyara valores de humedad del orden gel 1"; luego. la ampolla es sellad ba jo vacio. Se debe evitar la formacién de radicales libres que se producen por expo- siciOn de las eélulas al oxigeno, ya que estin asociados con pérdida de viabilidad; lealli a importancia de mantener el vac. EL medio empleado en fa Fifilizacidin es un factor importante en el proceso Entre los agentes recomendados estin la leche descremada en eoncenttaciones dl 10 al 20%; suero equino, mezclas de suero, glucosa y extrato de levadura; sue ro fetal bovino, ete. En algunos casos el efecto protector de ls leche desereinad ‘es mejorado por el agregado de solutos tales como acido ascdrbico o tiourea. La sucarosa se ha empleado para reemplazar la leche deseremmada, y para inejora®sirpetformance ¢ le adictona glutamate de sod y acto casitone wot componente nitrogenado, Normalmente la liofilizacién produce daiios en las eélulas, siendo los mismos en algunas casos reversibles, por lo cul estas necesitan un tempo de reeupers ‘i6n que es variable en funcién del tipo de dato producido, En la reconstitueién de un tubo liofilizado se logra inerementar la sobrevida de los miroorganismos sien lugar de agua destilaa se agrega caldo nutritive © celmismo medio que se usb para e] crecimiento imcial de las eélulas: de esta for= due ka misma proveca en forma lentSe encuentra con frecuencia que el crecimiento despues de la rehidratacion tiene una fase de retardo extendida, Se puede reducir esta fase si se emplea para el crecimiento un medio de igual composicién que el que da dptimo desarrollo pe- ro disminuyendo su concentacin original ent un 28 un 50% , En general no es posible determinar para cada urupo de organismos el méto- do de conservacion ideal por lo gue se tata de emplear el mis adecuao, De to- as tavas de mnorcanad, bi este easo ka Wa es 1a congelacidn, a pesar de «que las cepas mantenicas de esta fornta son dificiles de transportar M ismos industriales joramiento de microorg En general los organismmos aislios de la naturaleza produetores de metaboli- tos de interés industrial producen a los mismos en niveles muy bajos, por lo tanto se hace necesario inerementar estas rendimientas para lograr una mayor renta- Bilidad de los procesos. Una fornia de mejorar el rendimaiento es mediante lt optissizacitin del medio de cultivo y de las condiciones de operacin, pero esto esta limitado por la capaci- iad de singesis nat cl proto dese cue Hens el Ors LF Poe sibilidad es el mejoramiento genético de la cepa. ‘Como ya se dijo, la produes'vidad potenefal de un organismo es controlada por su genom. pudiendo el mismo ser mod'ficado para inerementar los rendi= Imientos. Con el érganismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivo para lograr nuevamente la maxima productividad. Por lo tanto Tos programas de rolle iavolucran una continua modificaeidn genética det microorganism, Seuuida por una readaptacio del medio de cultive a los nuevs requer inientos, rejoras de las condiciones de operacién y tambien de los procesos de extraccién y purificacion, La oblenciin de cepas moditic neticamnente se puede realizar por 1} Seleccidn natural de variantes, 2) Mutacion inducida, y 3) Recombinacién genéti- 1 Seleccisn maryral Se debe tener en cuenta que en cada divisidn celular hay una pequensa proba biliad de que oeusra un eambin geneeo, por lo eual no es sorprendente que en ‘una gran masa celular Ia poblacin sea heterngénea, Esta distribueibn puede pre= sentar problemas de rendimientos debido a gue en general is variantes tienen Ienores niveles de produccton que la poblacion parent. Estos cambios defn ‘os (mutaciones} se deben distinguir de las variaciones fenotipieas gue dependien die Iss condiciones ambieatales ¥ gue tienen lugar en todas fas celdias de 2 po- blacién que expresan la misma modificacion fisiologica, dentro de las variaciones permits por su genotipa, Ea lis mutaciones espontineas el elemento respon sable de la mutacin no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor muta- {nenico se comace) son estables y hereditarias y nen una frecuencia estadistica mente medible (tas de mutacion), La frecuencia ale nnutaciones espontinens varia entre 107% a 10-° mutaciones por genomra y por generacion. Por lo tanto sise considera un Valor de ID.” se de- bercn estudiar un eran mtimero de organismios © 107) en fa basqueda del tipo deseado. Ena seleeci de variantes naturales. una prictica que todavia es utilizada se rficrs a la observacion de las caraeteristicas moxtologteas de his eolontas, [as ‘ales, en manos de un operador avezado, se asocian con mayor o menor produc- tividad, lo que permite seleceiona® y postesiormente estudiar los clones aisiados IsCapitulo 4 MEDIOS DE FERMENTACION La preparaciéin de medios para el desarrollo de procesos de fermentaciiin es tuna etapa tunducnental para asegurar ka productividad de los mismo. Como ya se explicé, los componentes de los medios constituyen los efectores texternos de naturalezat quianiea que desesnpefian un rol eseneial en los prog ya que deben cumphr con Jos reguerianienios del ereezniento y de foriucion de productos y admis surmanistrar energia para la sintesis de melubolitos y para el mantenimiento celular No obstante que los mieroorganis:nos varian considerableinente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es pusible efeetuar la distincion de las si Hrentes eategorias de camponentes: a) Maeronuitientes, agregadas en cantic ‘des de gramos por lito que estin representados por las fuentes de C, N.S, P, Ky Mg; b) Mieronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mo, Mo, Cae Zn'y Coa se area oy mao en caidas de gaan 9 ie crogramos por litro; y ¢) Factores de crecimiento, que estin constituidos general- mente por componentes orwinicos suninisirados en baja concentraciin y que ne son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporadas a esiructuras Celulares y de limeton metaboliva espeeit dos, dcidés grasos no saturados, ete. Los medios pueden clusificarse, considerando la naturaleza quimica de los ‘componentes, en I) medios sintéticos o medios quimicamente definidos, y 2) me- dios complejos en cuya composicién intervienen sustancias de origen animal 0 ve getal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maiz, harina de soja, etc. {que aportan las sustancias fimdamentales ya mieneionadas, pero que son quimi- camente indefinidas y de composicién variable. En el estudio de los medios de eultivo es conveniente considerar en prime: el disetio pura tratar a eontiniaeion fa Tormulacion y epsimizacion de los 1. como vitaminas, algunos aminosci- Disesio El dsefo de un medio de frmentacin tiene como finalidad l elecein de los todos aquellos aspects relacionados con el microorganism, el proceso y los sus- traos ase empleo como so las requerimientos nuecieales del mictonrea smo y algunds especificos del proceso la disponbilidad real de los componenies y eorsiderscones sabre las malerias ps, Os aspecton gue so. bi Sapa de fermentacin yal conocimient de fos mecaniss bioguimices ce te= ful ha formacisn de algun productos, como ese eas de lt anportaeia dsl “tid POs, sega ya se expics Trataremos especialmente de Tos res primeros Requerimientos nutricionales Los roqueriinientos nutricionales estin detersainados por el ipo de m lismo celular, ya sea autotr6fico, que corresponde a los microorganismos que ob-tienen el carbono del C02 como las algas y algunas bacteria, y los heterotrficos que necestan compuestos organicos como fuente de carbono, Otro factor esenial esti determinado por las condiciones del cultiva, si es aerabio o anaerobio, EI D2 © uno de los oxidants tis comunes en el metabolism ensr¥tieo, En i auscn- eva del O:-cl NOs ¢ SG: son utilizados como aceptores de electrones por algu- zan H, para reducit el COs a CH4 para obtener energia. Oras protistas obtienen su energia,en condiciones anaeroblas por reaccion de Gxido-reduccion realizadas sobre compuesias organicas. Las foeates de earbono eumpien tambiéa el tal de ser fuente de en Otro requerimienso nutricional est eonstituido por Ios fuentes de nite «que pueden ser de naturalezainor no es utilizado pe fa lt hiosinwsis de proteimus,deidos aucleicos y polimeres de la pured celular Par lasintess de proteinase requicten en wenral L-amanadeidos, amu tant bign son necesarios algunos aminodcidos de la serie D como D-alanina y D-aspar- lgunos esos se peguicten ico para su incosparacion a la paved de ka eélukas, En a tambien poptides de histidina Los requerimientos de oxras macronutrientes vomo el Py el S soa suninis trados en forma de POsH y SOs (0 aminoscidos azutrados). El fosforo se incor- pont en iiidas nucleicos, ¥ polimeros eeluares, PTS es asimilad para ki sintesis ‘mina y otros components. Los requerimientos de Kv My son tambien esenciales. Uns parte importante del primero esta unida al RNA de manera que fos requerinnientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las celulas, como la velo cidad de erecimiento. El in K actua como coenzima y probablemente actia como atin en la estructura aniéniva de varios componentes eelulares. El ion Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y aetua como cofactor en minieross reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categorias: a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn b) los que son raramente esenciales coina B, Na, Al, Si, CV, Cr, Ni, As, Se. Mo, Sh. ¢ [En general los requerimientos ¢e trazas de elementos son conocidas cu Titativamente. A veees es difieil demostrar us tequerimienso de un micronutriene te porque generalmente esta presente en suificiente cantidad como impurezat de los componentes principales. Los requerimientos de éstos compuestos pueden au- ‘mentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", camo por ejent- plo por aumento de tensperatura por encima de um valor éptinna Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminod\ dlos y vitaminas del wrupo B como tiamina, riboflay ina, ateslo pantotético, maci- na, éte.. que representan para muchas bacteria y levaduras factores eseaciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de azimas. Otros faetores de crecimiento las vitaminas sow constituyentes de co: son las purinats, poliaminas, putreseinas, ete En algunos procesos existe la necesidad de efeetuar otros dos, a parte de los nutrientes requerides por los microorganisimos y que representan los r= uerimientos especificos del proceso considerado, in ejemplo es el caso de los precursores que constituye ka base de una mole ccula que debe ser sintetizada por ef microorganismo, como el acide fenil acsticnpara la penicitina, Onto ejemplo es el agrewado de cielo dextrinas en procesos de broductin de Bordetella pertussis que puede atuar camo compljante de inhib dores de crecimiento celular. El agregado de cloruros 6 bromuros en el caso de al- ‘unos antibioticos como claro y hromotetraciclinas,tetracielidas produeilas por C1 Streptomyees aureofaciens, respon tambicn a sequerimsenton expectices P= + inhibir [a sintesis de proguctos no deseados, como ocurre también con el agre= gado de mananos y barbitiricos en la produceidn de estreptomicina por S. griseus El agregado de sulfato, en el proceso de fermentacién alcohélica, que favorece 1a formacién de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento especifico. El diseito correcto tiene que ver con las caracteristicas bioquimicas propias y evolucién de los parimetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracteriza~ do por un descenso continuo de pH, debido al uso de una stl de nonin como rresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de. pl del riis> mmo. Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mez~ clas de fesfatoso de carbonsato de calcio 0 Gomo mis generakmente se have, con agregados periddicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma mas cconveniente mediante un control auromatico Ge pIT. El diseno de un medio espe- tifico para la produceioa de aeide eitrien debe considerar la influencia newasiva {que para el proceso tiene unt exceso de hierTo en su corsposicion: por lo tanto di- Cho medio dhe disefarse de ananera tal que su preparaciin (a partir de diversas diel mismo en cantidades controladas Disponibilidad de los componentes Aparte de su presencia en ef medio de cultivo, los nutrientes deben estar dis- ponibles para ser usados por la cella Es importante mencionar la disponibilidad uy concentracién es modilicada por guelaciim, ya que muchos constituyentes Tne 5 productos del metabolism acta coin agentes caplet pe por ejemplo aminosicidos, hidroxideides, hidroxidos, y los aniones orrespondiente u iones metilicos Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracién y prevenir la precipi- tacién de los iones metilicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algiin agente quelante agregado, como el EDTA (Acido Btilendiaminotetraacético). En medios complejos de uso industrial la situacién es alin mas complicada ya que existe una gran variedad de sustaneias orginicas, las cuales pueden quelar Secuestrar 0 absorber iones metalicos reduciendo la concentracién iGnica disponi ble. Entre dichos compuestos podemos citar: aminoacidos, proteinas, dcidos orgé- nicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales. En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultiv va a tener una determinada capacidad de Union a elementos metilicas dlisminuyendo su concentracion efeetiva. como ocurte también com los aminosici dos y proteinas que Lieaen los grupos seactivos R-COO™, RHN=, RS, RO que son los més importantes. La dindmica de formacin del complejo esti determina- dia por la constants de equilibsin de formacion del complejo metal-ligando, ¥ por la Veloeisad a la cual el equilibrio es obtenido. La eonstante de equilibric para Ja formacisn del complejo del ion metalico (M) con el ligando (L) se expresa de a i szuiente formalBML donde ls eargas del cation y ligando estin omitidas. “IMI El valor de K es prieticamente independiente del natura de gra, ya que depence particu armente de! iom metligo, Se puede acer un Hsia de iérminos de valores decrecentes dela constante de equilib comasigue: Fe3 > Pre eCye Ne nto net yee Gk ore Aree Me Gr! SP> Ba"> Nat > Ki > y de la eal se puede dedusr, pot ejemplo, cue el ion Cu estar furdamentalrente eon contpejo smeriasguc Ct Nyy Re st ran en forma de iones metilics ines, Por otvo ado la Velocidad a fa cual se alcanza el equilbrio tiene tami serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion: St?) = Ca Mn'"> Fe? Cai" = Mg = Ni®, De ambas consideraciones surge pot ejemplo que cuando se aleanza ¢! equilibrio el jon Ca estar easi siempre libre para ser Utlizado y siesta complejado se harasipidamente disponible, en earnbio el Ms" estar generalmente libre peru si esti cumpleaca se ara disponibie muy lenta- ‘mente. En la misma forma se puede dedueir que el Co” estara fundamentalmen- te en forma complejada send disponible adewnis a muy baja velocidad. Por esa razan ese elemento es parenelalete hiitante tos orgénicos que tienen capacidad para actuar como ligandos, y sobre todo et ion retilico considerado, ya que la concentracidn libre de éste es To que interesa Materias primas fundamentales Los componentes empleados en la industrias de fermentacién son general= ‘mente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabildad en su composieitn quimica, Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y e! 60% del eosto total de mucho productos obtenidos por fermentacion, se haee’ priori rio disminuir el costo de los medios. denitrogeno. ° " Las fuentes de carbono pueden ser: 1) Hiratos de carbono como glucosa o dextrose, sacarosa, lactosa,almidon, dextrina; 2) Alcoholes como el glicrol y ma- nitol v3) Hligracarbures coma hexadecano, vtadecano y atts, Son my impor antes tambien por su disponibilidad y costa reducido ottas materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, eelulosas, sucro de queso. te. Tambien se pueden empleur otros subprodctoso effucntes de intstrigs que por sil contenido en fuentes de carbon son intetesantes pats algunos procesos {go solamente les pata procesos de pradiccion de bionnasa destinados al const ‘mo animal, ya quest bien contienen hidratos de carbono y ots fuentes de carbo- to asimitables por los mietoo ny muchas impurezas {que impiden su utilizaei6n en otros praceses por las difieultades y costo elevado {ue presentan las operaciones de separacion y purificacion de los productos. Las fuentes de nitigeno de naturate7a inorganica ms comunes son el ano rnigco o las sales de antonio, Las organieas esti representadas por varios pro ductos, como ser: 1) Hidrolizads de proteins (Peptonas) que son abtenidas por hidrdlisis aida o enzimatica de distintas fuentes proveicas como carne de dite- rentes 6rganos y animales, pescado, casein, gelatina, harina de soja, algodén, gi- rasol.ete., Mediante ajuste de la rekicion enzima-stistrato y variando tiempo de 4hidraliss es posible variar cl tamaio de la cadena de polipéptides. Apaste funcién conto fuente nitroenada, las peptons aportan algunas vitamins y Jes inorginicas como fosfaios y suiministran tambien algunos micronutrientes co- mo Ca, Zn, Fey Cu. 2) Extracto de came, que se obtiene por extraccién acuosa y concentracién posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extracciin y temperatura de la misma, 3) Pxtracto de levaalura, que €s dispo nile en form de pasta o pole, y puede ser nbtenida mediante aulisis 0 plas- malisis de [a levadura, es bisicamente una mezcla de aminodvidos, péptidos, vie taminas solubies en #130 y earbohidratos. 4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H30 de la alta dela cebaulsy 8) "Comsteep, el agua de maverscion de Ia industria del maiz tiene mucha importancia por su ullizacién como compo- nente esencial de los medios para la protuccion de varios antibiotcos y enzimas. Es muy importante también la correcta eleceién de una detesminada fuente cen se presentan varias altenativas posibles, En este sentido deben eonside- rarse los costos, a disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompa- dara fas distintas materia prima utllizadis Formulacién La formukacion tiene que ver con los aspeetos euantitatives de las medias, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utiizadas. Una primera aproximacion eon respecto a las cantidaes a utilizar de las die vversas fuentes lo da el conocimiento de la composicién de biomasa del microorga- nismo a ser empleado, Una composicidn elemental y tipica de la biomass es fen '% de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrogeno, 7-12; Fésforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0;, fg. 0.5-1%, Es decir. que si queremos formelar un medi para produeir una de terminada cantidad de biomasa debernos promyeer las distintas fuentes que ase gurer como minisno las cantidades de elementos que eben ser suministradlos. La Clasable 8. que ha rogenten en concentae Cuenta los requerimientos de las fuentes de © Sido caletlaca por Pirt para la produceion de Ale cidn de 10 gl! Tabla 3. Composicion de un medio miinimo para Klebsiella aerogens (Adaptado ce Pint) Componente Elemento provisto 0 funcién del Componente: Glucosa 5, Energi 22.7 NH,CI N 437 KH;P0, P+K 11s ‘Mg80,.7H,0 S+Mg 0.282 CaCl,.2H,0 Ca oon FeS0,.7H:0 Fe 0.007 Mn$0,.4H,0 Mn 0.002 Zn$04.7H,0 Zn 0.002 Cus0,.5H,0 cu 0.0004 CoC, 6,0 Co. 0.0004 EDTA, Sal disédica dihidrato Agente quelante 0.394 H,0 (destilada) 3,000 miMediante ef conocimiento de los eoefieseates de rendimienta para fa foarte clon de biomasa y procuicto y los valores de ka energia de nrantenimiento (aspec= tos a tratar en el eapiculo 5) sera posible establecer tambien les requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio. Optimizacion Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperative ls optimizaciin de los medios de cultivo, Entre ellas poentos mencioratr kis siguientes: 1) No exis teneia de ivformacion respeeta a eneficientes de rendinniento de m elementos para el eultive del microorganism determinado. 2) Existencia de limi- taciones antrcionles ocultas, especialmente de mieroelementos y factores de crecimiento. 3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respec to de los requerimentes nutricionales del microorganism en cuestion, que pue~ den causar inhibicion del crecimiento, 4) Ensayo de sustaneias estimulantes, ae Evadioras e inhibidoras del ereeimienta ¥ formacién del producto, 5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales. La mietodologia nis elemental consiste en realizar experimentos, en los eua- les se varia la eonicentracion del componente a ensayar manteniéncose constante las concenttaciones de los dein ingredientes. Para arganisies aerobios rulmente se ubliza coro sistema de cultivo erlenmieyers agitados. En este caso, ila sobre la velocidad de erecinniento y kt se analiza el efecto de la variable esce ‘concentracién de biomasa obtenida, Si hen el procedinicnto anteriores simple x evideate que hace falta wna sn cant de bajo proininar yaque e upesaor ne concede aera {ue nutente es elma del creefnent, Cando son varos los posbles nw Sats Kattante cf metodo neste pou pete Pos pare pes ee ea reguesia oben al vara la concentracia de un componente deena Dias nicles dels anos o seo, e produ. Prmenies ca iteraccion entre components. Se pueds melon rar ache da oprimizacion on bate cupleando eencisestadisteasoutlizand sistemas continuos con pulsos de componen- XE Lalande culivos commu tenses se vor en el eapitlo 6) es posible okt Tnuilino hiniegioparun go laser wus. Tete alo Largo de todo el experineat0, pu difcose conocer por lo lan el efecto que tu varacibn gjeqee sabre el cultvoal mame toner un dhs componthiesconstantce En la fig. se muestra la optimizacion de fi un medio lograda por el metodo de los pul- sos tahajanda eorun cutive continua yen Figo, Optimizacion de mins de ‘el cual se grafica la variacion de la concen- _fefmentaci6n. 1. Nutriente no limi- tracion de biomasa en funcién del tiempo MU, 4, Nutrient liitance 8 Nu- In X después del pulso de un componente dado, uit) Nunc tities Esterilizacion Es eonvenicnte. al tralar este tema, dar una definicifn clara del sérmino y de ‘otros relacionados, ya que a veces suelen producirse confusiones. Esterilizacién significa la eliminacidn de toda formu de vida de un medio © material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fisicos, por ejemplo, fil- tracién, 0 por muerte de los organismos por calor, productos quimicos u otra via