NDICE

1. Introduccin..................................................................................................2
2. Cromatografa de Gases..............................................................................6
2.1. Componentes bsicos de un cromatgrafo Gas Lquido ...............7
2.2. Aplicaciones de la Cromatografa de Gases...................................13
3. Cromatografa de Lquidos........................................................................15
3.1. Componentes bsicos de un equipo de HPLC...............................16
4. Mtodos cromatogrficos en HPLC..........................................................22
4.1. Cromatografa de Reparto..............................................................22
4.1.1. Cromatografa en Fase Reversa.......................................22
4.1.2. Cromatografa en Fase Normal.........................................23
4.1.3. Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto...................24
4.2. Cromatografa Inica.......................................................................24
4.2.1. Aplicaciones de la Cromatografa Inica...........................25
4.3. Cromatografa de Exclusin por Tamaos......................................26
4.3.1. Aplicaciones de Cromatografa Exclusin por tamao......26
5. Comparacin entre Cromatografa de Gases y HPLC.............................27
6. Aplicaciones de la Cromatografa de Gases y de HPLC.........................29
7. Glosario.......................................................................................................31
8. Bibliografa..................................................................................................32
1. INTRODUCCIN: MTODOS CROMATOGRFICOS.
Qu es la Cromatografa?
La cromatografa es un conjunto de tcnicas que permiten identificar, separar y determinar compuestos
qumicos en mezclas complejas.
Cabe destacar desde un principio que en todas las tcnicas cromatogrficas hay:
Una Fase estacionaria y una Fase mvil.
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 En Cromatografa de gases, la fase mvil es un gas, el cual se hace pasar a travs de una fase
estacionaria.
En Cromatografa Lquida, la fase mvil es un lquido que se hace pasar a travs de una fase
estacionaria.
Un Cromatografa de Fluidos Supercrticos la fase mvil es un fluidos supercrtico que tambin pasa a
travs de una fase estacionaria.
Una de las caractersticas fundamentales en las cromatografas es que los componentes de la mezcla que
queremos separar / identificar / cuantificar, se separan cuando sus velocidades de migracin son distintas.
Desde el siglo pasado las separaciones analticas se llevaban a cabo por mtodos clsicos como son la
precipitacin, destilacin y extraccin. Los crecientes esfuerzos por conocer ms sobre la composicin y
funcin de las protenas han obligado a los cientficos a buscar tcnicas, cada vez, ms precisas. Fue el
botnico ruso Mikhail Tswett quien invent la cromatografa a principios del siglo XX. Tswett hizo pasar
soluciones que contenan pigmentos vegetales, como clorofilas y xantofilas, a travs de columnas de vidrio
empacadas con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecan como bandas
coloridas sobre la columna, lo cual explica el nombre que se escogi para el mtodo, chroma que significa
color en griego y graphein que significa describir.
Para elegir una tcnica de separacin adems de tener en cuenta los criterios econmicos y de accesibilidad,
hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades fsicas estructurales
de las molculas que se pretende separar, o de las caractersticas de la matriz en que se encuentran; otras se
derivan de los objetivos del anlisis (sensibilidad, resolucin, tiempo de anlisis, necesidad de una deteccin
especfica).
El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la obtencin, preparacin y posible fraccionamiento
de la muestra, la aplicacin de la tcnica analtica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos.
Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: tcnicas de
separacin y tcnicas espectroscpicas.
Las tcnicas espectroscpicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una informacin compleja,
relacionada con sus caractersticas estructurales especficas, por otro lado las tcnicas de separacin se utilizan
para resolver los componentes de una mezcla y la seal obtenida puede utilizarse con fines analticos
cuantitativos o cualitativos.
Actualmente las separaciones analticas se realizan fundamentalmente por cromatografa y electroforesis.
La cromatografa comprende un conjunto importante y diverso de mtodos que permite a los cientficos
separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta
imposible por otros medios. Se pueden separar molculas en funcin de sus cargas, tamaos y masas
moleculares. Tambin a travs de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc...
La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de una mezcla, sino tambin su
identificacin y cuantificacin.
El anlisis cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos (tiempos y volmenes de
retencin) mientras que el anlisis cuantitativo est basado en la medida de alturas o reas de picos
cromatogrficos que se relacionan con la concentracin. La columna cromatogrfica y la forma con la que se
disea, constituye el corazn de la separacin. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la
respuesta de los componentes que se separan.
En todas las separaciones cromatogrficas la muestra se desplaza con una fase mvil, que puede ser un gas, un
lquido o un fluido supercrtico. La fase mvil puede pasarse a travs de una fase estacionaria, con la que es
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inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie slida. Las dos fases se eligen de forma, que los
componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente con el
flujo de la fase mvil; por el contrario los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se
mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan
en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se
recogen en forma de grficos llamados cromatogramas.
Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar segn la situacin de la fase estacionaria en:
Cromatografa en columna
Cromatografa plana.
O bien segn la Fase mvil en:
Cromatografa de gases.
Cromatografa lquida.
Cromatografa de Fluidos Supercrticos.
Relacionando estas dos clasificaciones entre s, slo la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse
acabo en columna o sobre superficies planas. Por otra parte, tanto la de gas como la de fluidos supercrticos
estn restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la
fase mvil.
La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC por su sensibilidad, fcil
adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no
voltiles o termolbiles y su aplicacin a sustancias de primordial inters en la industria, como son los
aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros.
2. CROMATOGRAFA DE GASES.
En esta tcnica cromatogrfica, la muestra se inyecta y volatiliza en la cabeza de una columna cromatogrfica.
La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un gas inerte y a diferencia de la mayora de las
tcnicas cromatogrficas la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica misin es
transportar el analito a travs de la columna.
Existen dos tipos de cromatografa de gases:
Cromatografa Gas Slido: La fase estacionaria es un slido de gran rea superficial sobre el que se
adsorbe el analito. Actualmente slo se aplica a la separacin de especies de bajo peso molecular
(CO2, O2, N2 e hidrocarburos). Los compuestos ms polares son retenidos en la fase estacionaria de
manera semipermanente.
Cromatografa Gas Lquido: La fase estacionaria es un lquido no voltil inmovilizado sobre la
superficie de un soporte slido inerte. La velocidad de migracin de un analito est determinada por
su distribucin entre la fase lquida inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del
analito (Peb) y su solubilidad en la fase estacionaria son los factores que regulan su retencin.
En la cromatografa de gases (que uno de los objetos de estudio en este trabajo: Cromatografa Gas
Lquido), se usa como fase estacionaria un compuesto orgnico polimrico de baja volatilidad, estable
trmicamente y con adecuadas caractersticas de disolvente. Es preciso sealar que deben usarse fases
estacionarias, similares funcionalmente al compuesto a analizar.
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Fig 1: Algunos ejemplos de fases estacionarias comunes en cromatografa gas lquido.

2.1. Componentes bsicos de un Cromatgrafo Gas Lquido:
De forma muy esquemtica podemos resumirlos en:
Gas portador Sistema de Inyeccin de muestra Columna Detector Registrador
O tambin como indica esta imagen:
Fig 2: Esquema Cromatgrafo de gases.

Vamos a ver los componentes uno a uno:

GAS PORTADOR
El gas portador debe ser inerte y de alta pureza (He, Ar, N2, CO2, H2). Su eleccin vendr determinada por el
tipo de detector que se use. Este gas estar en la botella de gas portador que son botellas con manureductores
para poder controlar el caudal.
SISTEMA DE INYECCIN DE MUESTRAS.
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Las muestras estn formadas por un disolvente, compuestos voltiles (analito) y compuestos no voltiles
(suciedad).
El mtodo ms comn de inyeccin de muestra implica el uso de una microjeringa que inyecta la muestra
lquida o gaseosa a travs de un septum de goma de silicona en una cmara de vaporizacin instantnea
situada en la cabeza de la columna. Esta cmara normalmente est a unos 50 C por encima del punto de
ebullicin del componente menos voltil de la muestra.
Al inyectar con microjeringas el sistema debe asegurar:
Que la muestra se vaporice en la cabeza de la columna sin distorsin del gas portador.
Que la muestra ocupe la mnima longitud posible de la columna.
Tambin se encuentra el inyector en columnas empaquetadas es una cmara de vidrio o cuarzo denominada
glass insert, colocada en un bloque termostatizado a 200 300 C. El gas portador circula a travs del bloque,
penetra caliente en el inyector por una parte lateral y arrastra la muestra vaporizada al interior de la columna.
Otro tipo de inyector es el usado en columnas capilares donde la muestra vaporizada debe ser mucho ms
pequea. Se inyectan volmenes similares a los de las columnas empaquetadas que, o bien dejan pasar slo
una pequea fraccin de la muestra inyectada a la cabeza de la columna (inyeccin Split), o bien reconcentra
el analito gas en la cabeza de la columna (inyeccin Splitness), o bien vaporizan los analitos una vez que lo ha
hecho el disolvente (inyeccin on column).

Fig 3: Inyector en columnas empaquetadas. Fig 4: Inyector usado en columnas capilares

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COLUMNAS
Las columnas cromatogrficas varan en longitud desde menos de 2 hasta 60 metros. Se construyen de acero
inoxidable, vidrio, slice fundida, o tefln. A fin de poder ser colocadas en el interior del horno
termostatizado, normalmente son configuradas como helicoides con dimetros de 10 a 30 cm.
La temperatura de trabajo es una variable importante para realizar un trabajo preciso, por ello son introducidas
dentro de un horno termostatizado.
La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin
requerido. Normalmente con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullicin promedio de
la muestra, se obtienen tiempos de elucin razonables (2 a 30 minutos).
En cromatografa de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas y las capilares.
En las columnas empaquetadas la fase estacionaria se impregna en un soporte slido poroso. Este soporte
slido debe mantener inmvil la fase lquida proporcionndole la mxima superficie. Estos soportes slidos
suelen ser tierra de Diatomeas que son fuertemente adsortivas.
Las columnas Capilares son de slice fundida con una capa protectora exterior de poliamida. Su longitud varia
entre los 10 y 60 metros. Su dimetro interior oscila entre 0,1 0,32 mm. Su fase estacionaria recubre las
paredes internas de la slice y permiten conseguir mejores eficiencias que las empaquetadas aunque su uso es
ms complicado. Este tipo de columna requiere sistemas especiales de inyeccin de muestra y detectores ms
sensibles.
En ambas columnas, su fase estacionaria est unida qumicamente al soporte slido, lo que las lleva a ser ms
estables frente a la temperatura y prdida de fase estacionaria que aquellas en las que la fase estacionaria est
inmovilizada por adsorcin fsica.
DETECTORES
La funcin bsica de un detector es que debe producir respuestas muy rpidas a pequeas concentraciones de
soluto.
Las caractersticas ideales de un detector en cromatografa de gases son:
1. Adecuada sensibilidad. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el
intervalo de 108 a 1015 g de analito/s.
2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios rdenes de magnitud.
3. Buena estabilidad y reproducibilidad
4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400
C.
5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.
6. Alta fiabilidad y fcil manejo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos.
7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente
predecible para una o ms clases de analitos.
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8. No sea destructivo de la muestra.

Actualmente no existe el detector que rena todas esas caractersticas, y tampoco parece probable que pueda
llegar a disearse nunca.
Los detectores ms generalizados son:
Detector de conductividad trmica (TCD): Es totalmente universal y muy sencillo, aunque no es muy
sensible. Se emplea bsicamente en el anlisis de gases. Su baja sensibilidad impide usarlo con
columnas capilares. Los gases que salen de la columna entran en un compartimiento en el que se
encuentra un filamento caliente, cuya temperatura depende de la capacidad del gas que le rodea en
disipar calor, esto es, su conductividad trmica. En el momento en que se eluye de la columna un
compuesto con diferente conductividad trmica que el gas portador, la temperatura del filamento
vara, y por tanto su resistencia elctrica, lo que es registrado en forma de aumento o disminucin de
la corriente.
Detector de ionizacin a la llama (FID): Es como detector, el ms usado. Esto se debe porque es
prcticamente universal para los compuestos orgnicos, donde es bastante sensible y tiene un
comportamiento excelente. Los gases que efluyen de la columna son introducidos en una llama
formada por H2 y aire cuya conductividad elctrica est permanentemente registrada. En el momento
es que un compuesto de carbono se eluye de la columna, se quema y durante la reaccin de
combustin se generan electrones y otras especies cargadas que alteran la conductividad elctrica de
la llama.
Detector de captura de electrones (ECD): Este detector es selectivo para las molculas que contienen
tomos electronegativos, como perxidos o halgenos e insensible a compuestos como aminas,
alcoholes, o hidrocarburos. Por lo que se emplea en el anlisis de pesticidas halogenados. Se trata de
un detector tremendamente sensible y en algunos casos hasta inestable. El efluyente de la columna se
hace circular entre un pequeo ncleo de un metal radiactivo que emite electrones (partculas ), y un
electrodo cargado positivamente que los recibe. En el momento en que de la columna eluye una
especie de tomos electronegativos, capaces de capturar a dichos electrones, se detecta una
disminucin de la corriente del electrodo.
Detector Termoinico (TID): Se trata de un detector selectivo de los compuestos orgnicos que
contienen fsforo y nitrgeno. En comparacin con un FID, el TID es 500 veces ms selectivo para
los compuestos continentes de fsforo y 50 veces ms con los compuestos continentes de nitrgeno.
Un detector termoinico tiene una configuracin similar al detector de llama. El efluente de la
columna se mezcla con hidrgeno, pasa a travs de la llama y se quema. El gas caliente fluye
alrededor de una bola de silicato de rubidio calentada elctricamente, la cual se mantiene a unos 180
con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800
C. Esto provoca que se produzcan una gran cantidad de iones a partir de las molculas que contienen
fsforo o nitrgeno, lo que resulta en una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la
determinacin de compuestos que contienen esos dos elementos.
Detector de Emisin Atmica (AED): Es el detector ms reciente y se encuentra a la venta. En este
detector el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido por microondas que se acopla a un
espectrofotmetro de emisin con series de diodos. El plasma es suficientemente energtico como
para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y as obtener los espectros de emisin.
Estos espectros son recogidos en un espectrmetro.
2.2. Aplicaciones de la Cromatografa de Gases.
La cromatografa de gases se puede aplicar a gases y cualquier compuesto que pueda ser volatilizado o
convertido en un derivado voltil.
Con carcter general se puede aplicar en los siguientes casos:
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 Para separa muestras analticas complejas.

En el anlisis cualitativo: Por ejemplo para determinar el criterio de pureza, la presencia o ausencia de
compuestos, el nmero de tomos de carbono en una serie homloga...
En el anlisis cuantitativo: para realizarlo se requiere es uso de patrones o estndares.
Centrndonos en el tema que nos compete que son los alimentos, podemos destacar las siguientes
aplicaciones o ejemplos:
Aminas aromticas heterocclicas (HAA) formadas durante la coccin de alimentos proteicos (carne
y pescados). Donde estos compuestos son mutagnicos potentes bien conocidos y algunos de ellos son
carcingenos. Se han formado en alimentos cocinados, y tambin se han detectado en las muestras
ambientales (aerotransportadas partculas, aire de interior, humo del cigarrillo...) y en las muestras
biolgicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA son muy importantes para
el gravamen de riesgo para la salud humana.
Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial: Se identifica y cuantifica,
mediante cromatografa en fase gaseosa aquellos componentes que definen la calidad bsica de los
orujos y cuyo control exige la administracin: grado alcohlico, acidez total, acetato de etilo, metanol,
acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.
Determinacin de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana,
cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.
Estudio de vinos monovarietales.
Caracterizacin de avellanas por su composicin en cidos grasos.
Identificacin d compuestos voltiles en granos de cacao.
Determinacin del perfil del cido graso, acidez y valor del perxido en la calidad del aceite de oliva
contra el almacenaje.
Determinacin cuali y cuantitativa de componentes voltiles en hierbas y especias.
Separacin de compuestos voltiles del queso.
Anlisis de compuestos terpnicos de la uva de la variedad albario.
Estudio de compuestos azufrados voltiles pesados es vinos tintos de la denominacin de origen
ribeira sacra.
***** Se adjuntan al final del trabajo los artculos que corresponden a cada aplicacin aqu expuesta *****
3. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS.
En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que circula a travs de una columna en la que est
contenida la fase estacionaria. La fase mvil no slo arrastra al analito, sino que existen interacciones intensas
entre el analito y la fase mvil.
La retencin cromatogrfica es funcin de:
La fase mvil.
La fase estacionaria.
El analito.
Todas las especies que pueden disolverse pueden separarse eligiendo la combinacin adecuada de fase mvil
y fase estacionaria.
La cromatografa lquida se clasifica segn el lecho cromatogrfico:
Cromatografa Lquida Clsica: La columna es de vidrio y se usa para mezclas complejas.
Cromatografa de alta resolucin o HPLC: La columna es de acero inoxidable. Va a ser objeto de
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estudio en este trabajo.

La HPLC consta de una columna de acero inoxidable de 10 30 cm de longitud, y un dimetro interno de 4
10 mm. Las partculas de la fase estacionara son de un tamao aproximado a las 5 10m.
Cabe destacar que separa con gran eficacia, identifica los compuestos separados por la columna y adems lo
cuantifica por su altura o rea de picos en el cromatograma.
3.1. Componentes bsicos en un equipo de HPLC:
De forma esquemtica los componentes bsicos son:
Sistema de suministro, Inyector Columna Detector Registrador
Bombeo y conducciones
de la fase mvil
En esta figura pueden observarse con ms detalle:

Fig. 5: Esquema de un aparato de HPLC.

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MVIL:
Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para desgasificar y eliminar partculas
en suspensin de los disolventes que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin.
SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MVIL:
Se usan bombas para impulsar a la fase mvil y deben cumplir los siguientes requisitos:
Deben vencer altas presiones.
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 Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.

Deben estar libres de pulsaciones y tener volmenes muertos pequeos.
Deben estar construidas de materiales resistentes a la presin y a las agresiones qumicas.
Fcil manejo y mantenimiento.
Se utilizan tres tipos de bombas :
Bombas recprocas
Bombas de desplazamiento
Bombas neumticas.
INYECTORES:
Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma reproducible y adecuada.
Hay dos tipos de inyectores
Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite mucha presin.
Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en el equipo cromatogrfico
y existen bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra.
PRECOLUMNAS
Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensin y los contaminantes de los
disolventes. La composicin del relleno debe ser semejante al de la columna. Aunque el tamao de partcula
es mayor para minimizar la cada de presin. En muchas ocasiones se usan para aumentar la vida de la
columna.
COLUMNA:
Normalmente son de acero inoxidable de dimetro interno uniforme aunque en ocasiones se encuentran tubos
de vidrio de paredes resistentes.
La mayora de las columnas de cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Generalmente
son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las
columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y
10m.
Los empaquetados ms comunes son de partculas de slice pero tambin se usa la almina, polmeros porosos
y resinas de intercambio inico.
La columna ms utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, empaquetada con
partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro.
Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las cuales tienen
menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que
oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm.
Pueden tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de
disolvente caracterstica muy importante ya que los disolventes de alta pureza que se requieren en
cromatografa de lquidos son muy caros.
DETECTORES:
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A diferencia de la cromatografa de gases, en HPLC no existen detectores tan universalmente aplicables, ni

tan fiables tampoco. En lo que si coinciden cromatografa de gases y HPLC, son las cualidades enumeradas en
los detectores de cromatografa de gases.
En HPLC existen dos tipos bsicos de detectores:
Los basados en una propiedad de la disolucin: Que corresponden a una propiedad de la fase mvil,
como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, la densidad...
Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades del soluto,
como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.
En la siguiente tabla se presentan los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus
propiedades ms importantes:

Fig.5: Detectores ms comnmente usados en HPLC.

Paso a hacer una breve descripcin de algunos de ellos:
Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna cromatogrfica.
Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces pasa por la cubeta
de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los
dos haces se usan detectores fotoelctricos contrastados. En cualquier caso, el cromatograma consiste
en una representacin en funcin del tiempo del logaritmo del cociente de las dos seales
transducidas. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz, en cuyo caso, las medidas de
intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el
clculo de la absorbancia.
Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector fotoelctrico
colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una
fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente.
Detectores de ndice de refraccin: Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que
responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de
llama en cromatografa de gases. Se aade que son fiables, no dependen del caudal, son muy sensibles
a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante. Por otra parte, no
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son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la
elucin con gradiente.
Detector de dispersin de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte en
una fina niebla gracias a un flujo de nitrgeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de
conduccin a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase mvil y se originan
partculas de analito. Estas partculas pasan a travs de un lser y por un fotodiodo de silicio se
detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser
ms sensible que el detector de ndice de refraccin.
Detectores Electroqumicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroqumicos, que se basan
en cuatro mtodos: amperometra, voltamperometra, coulombimetra, conductimetra.
Detectores por espectrometra de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografa de lquidos
con la espectrometra de masas. De forma general se pueden obtener tanto cromatogramas a tiempo
real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.
4. MTODOS CROMATOGRFICOS EN HPLC
Hay cinco mtodos cromatogrficos:
Cromatografa de Reparto:
Cromatografa en fase normal.
Cromatografa en fase reversa.
Cromatografa inica.
Cromatografa de Exclusin.
Cromatografa de adsorcin.
4.1. Cromatografa de Reparto:
La cromatografa de reparto es hoy en da el mtodo ms utilizado. La cromatografa de reparto se divide en
fase normal, y fase reversa, cuyas principales diferencias radican en las distintas polaridades de sus fases
estacionarias y mviles.
4.1.1. Cromatografa en fase reversa:
En la cromatografa de fase reversa su fase estacionaria en apolar, y la fase mvil polar. Las fases
estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar qumicamente los centros silanoles activos de la slice
con un trialquilclorosilano.
La retencin se produce en esta especie de capa lquida depositada qumicamente como consecuencia de la
distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria ( apolar) y la fase mvil (polar).
Los compuestos ms retenidos son los ms apolares. La retencin y selectividad se controlan
fundamentalmente con la composicin de la fase mvil. Para obtener una fase mvil de fuerza de elucin
ptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.

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Fig 6: Las polaridades de los solutos son A> B > C

Actualmente, el 75% de los anlisis con HPLC se realizan en fase reversa. Permite un anlisis directo de
muestras acuosas y de compuestos solubles en agua o en disolventes relativamente polares (metanol) y con
peso molecular no superior a 2000 o 3000 ua.
Si se compara con la de adsorcin, su comportamiento cromatogrfico es excelente.
4.1.2. Cromatografa en fase normal:
En esta cromatografa a diferencia de en fase reversa, la fase estacionaria es polar y la mvil apolar. Las fases
estacionarias se obtienen haciendo reaccionar qumicamente los centros silanoles activos de la slice con un
trialquilclorosilano.
La retencin tambin (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa lquida depositada
qumicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase
mvil (apolar). Donde el analito menos polar ser el primero que se eluye y el ms polar el ltimo en eluir.

Fig.7: Polaridades de los solutos A > B > C

Se deduce que los analitos A, B, C tardan ms tiempo en eluirse si se usa una fase mvil poco polar. Es decir,
cuanto ms polar sea el analito, ms tardar en eluir.
4.1.3. Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto:
Como aplicaciones de la cromatografa de reparto en productos de alimentacin : edulcarantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos en bebidas refrescantes, colorantes, aminocidos, proteinas, carbohidratos,
lpidos.
4.2. Cromatografa inica:

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La cromatografa inica se usa para separar y determinar especies inicas. La fase mvil es un lquido acuoso
y salino que contiene un disolvente orgnico como metanol o acetonitrilo y un compuesto inico que aporta
un contraion de carga opuesta al analito. La elucin de los pares inicos se consigue mediante una disolucin
acuosa de metanol u otro disolvente orgnico soluble en agua. La fase estacionaria es una resina de
intercambio inico. Se trata de un material polimrico (Ej: poliestireno), que contiene muchos grupos
funcionales por molcula y prcticamente insoluble en agua.
Hay dos tipos de cromatografa inica, que se clasifican segn el mtodo empleado, para evitar que la alta
conductividad de la fase mvil interfiera en la medida de conductividad del analito. Estos dos tipos son:
Con detector conductimtrico y supresin qumica: Se coloca una columna supresora del eluyente
inmediatamente despus de la columna analtica (de baja capacidad). Esta columna supresora es un
intercambiador inico de alta capacidad y de signo opuesto a la columna analtica, que convierte los
iones del eluyente en especies moleculares poco ionizadas y no retiene los iones del analito. La
columna supresora se debe regenerar peridicamente. Veamos las reacciones entre el eluyente y el
supresor:
La primera reaccin de la imagen se corresponde a cuando la columna analtica es catinica.
La segunda reaccin de la imagen corresponde a cuando la columna analtica es aninica:

Fig. 9:Reacciones en cromatografa con detector conductimtrico y supresin qumica.

Con detector conductimtrico y supresin electrnica: Se utilizan fases mviles de conductividad muy
baja y diluidas. Su conductividad se corrige de forma electrnica. Comparada con la supresin
qumica, requiere un equipo ms sencillo, pero menos sensible.
4.2.1. Aplicaciones de la Cromatografa Inica:
Como aplicaciones de la cromatografa inica est el anlisis de drogas y sus metabolitos, sueros,
conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azcares, y preparaciones farmacuticas.
4.3. Cromatografa de Exclusin por Tamaos:
Tambin conocida como cromatografa en geles permeables o de filtracin en geles. Es una tcnica que se
aplica particularmente a especies de alto peso molecular.
La fase estacionaria est compuesta de partculas de slice o polmeros en forma de gel, que contienen una red
de poros uniformes. La retencin est basada en el tamao de las molculas. Si las molculas con ms grandes
que los poros, no pueden penetrar en ellos (slo pasan las partculas), y son las primeras que se eluyen. Si las
molculas son ms pequeas que los poros, penetran en ellos recorriendo caminos mucho ms largos, y sern
las ltimas en eluir. Si las molculas tienen un tamao intermedio, podrn penetrar en los poros ms grandes
(camino recorrido intermedio). Por tanto, el tiempo de residencia medio en los poros, depende del tamao
afectivo de las molculas de los analitos.
La retencin no se controla con la fase mvil, se controla eligiendo la fase estacionaria, cuya eleccin vendr
determinada por:
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 Si la separacin se realiza en fase acuosa (filtracin en gel), o en fase orgnica.

El rango de pesos moleculares (tamaos) que contienen la muestra que queremos analizar.
Cabe observar, que este tipo de separacin difiere de los dems que han sido considerados, en que no implica
una interaccin qumica o fsica entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo
de interacciones, dado que originan una mala eficacia de la columna.
4.3.1. Aplicaciones de la Cromatografa de exclusin de tamaos.
Como aplicacin referida a productos alimenticios en cromatografa por exclusin de tamaos: separacin de
cidos grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados.
5. COMPARACIN ENTRE CROMATOGRAFA DE GASES Y HPLC:
Como caractersticas de ambos mtodos:
Son eficientes, muy selectivos, ampliamente aplicables.
Slo se requiere una muestra pequea.
Pueden utilizarse sin destruir la muestra.
Se adapta fcilmente al anlisis cuantitativo.
Ventajas de la HPLC:
Puede acomodar muestras no voltiles e inestable trmicamente.
Es aplicable a iones inorgnicos.
Ventajas de la CG:
Se trata de un equipo sencillo y barato en comparacin con HPLC.
Es rpido.
Tiene resolucin en paralelo (columnas capilares).
Se conecta fcilmente con la espectroscopia de masas, (MS).
La CG, ofrece la ventaja de la velocidad y simplicidad del equipo, pero la HPLC es aplicable a sustancias no
voltiles y materiales trmicamente inestables.
Algunas diferencias instrumentales:
En HPLC no existen detectores tan aplicables universalmente, ni tan tampoco tan fiables como en
CG.
El detector en HPLC no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas.
El detector usado en HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento
de banda.
6. APLICACIONES DE CG Y HPLC
En el desarrollo del trabajo, cuando han sido descritos de cada uno de los mtodos, tanto CG como HPLC (en
todas sus variantes), se han incluido sus aplicaciones correspondientes. Algunas van a ser renombradas y
otras, van a ser incluidas y descritas en este apartado. Se han recogido artculos que son adjuntados en este
apartado del trabajo.
Aplicaciones en Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) : Como aplicaciones de la
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cromatografa de reparto en productos de alimentacin : edulcorantes artificiales, antioxidadntes, aflatoxinas,

aditivos, colorantes, aminocidos, proteinas, carbohidratos, lpidos.
Las aplicaciones de la cromatografa inica est el anlisis de drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes
de alimentos, mezclas para vitaminas, azcares, y preparaciones farmacuticas.
Respecto a las aplicaciones referidas a productos alimenticios en cromatografa por exclusin de tamaos:
separacin de cidos grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en zumos enlatados.
Aplicaciones de La cromatografa de Gases. Se pueden destacar las siguientes aplicaciones o ejemplos.
Aminas aromticas heterocclicas (HAA) formadas durante la coccin de alimentos proteicos (carne
y pescados). Donde estos compuestos son mutagnicos potentes bien conocidos y algunos de ellos son
carcingenos. Se han formado en alimentos cocinados, y tambin se han detectado en las muestras
ambientales (aerotransportadas partculas, aire de interior, humo del cigarrillo...) y en las muestras
biolgicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA son muy importantes para
el gravamen de riesgo para la salud humana.
Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial: Se identifica y cuantifica,
mediante cromatografa en fase gaseosa aquellos componentes que definen la calidad bsica de los
orujos y cuyo control exige la administracin: grado alcohlico, acidez total, acetato de etilo, metanol,
acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.
Determinacin de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana,
cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.
Estudio de vinos monovarietales.
Caracterizacin de avellanas por su composicin en cidos grasos.
Identificacin d compuestos voltiles en granos de cacao.
Determinacin del perfil del cido graso, acidez y valor del perxido en la calidad del aceite de oliva
contra el almacenaje.
Determinacin cuali y cuantitativa de componentes voltiles en hierbas y especias.
Separacin de compuestos voltiles del queso.
Anlisis de compuestos terpnicos de la uva de la variedad albario.
Estudio de compuestos azufrados voltiles pesados es vinos tintos de la denominacin de origen
ribeira sacra.
***** A continuacin adjunto los artculos encontrados de las aplicaciones en alimentos de CG y HPLC
*****
7. GLOSARIO.
CONTRAIN: (Termino usado en HPLC, cromatografa inica), Un contrain es un in que se combina con
el in analito para formar una pareja de iones, que es una especie neutra que es retenida por el relleno de la
fase inversa.
CROMATOGRAMA: Es una grfica de alguna funcin de concentracin de soluto contra el tiempo o el
volumen de elucin.
EFECTIVIDAD O SELECTIVIDAD DE UNA COLUMNA CROMATOGRFICA: Se dice que una
columna es efectiva cuando las especies a separar se eluyen a velocidades relativas suficientemente diferentes
(los picos estn suficientemente separados).
EFICACIA DE UNA COLUMNA CROMATOGRFICA: Se dice que una columna es tanto ms eficaz
cuanto menos sea el ensanchamiento de los picos. La eficacia ser mayor cuanto ms pequea sea la altura de
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plato y mayor sea el nmero de platos.

ELUCIN: Es un proceso en el cual los solutos son lavados a travs de una fase estacionaria por el
movimiento de una fase mvil.
ELUYENTE: Se trata de un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a travs de una
fase estacionaria.
RESOLUCIN DE UNA COLUMNA: Parmetro que proporciona una medida cuantitativa de su capacidad
para separar dos solutos. Debe ser mayor a 1,5 para que se considere buena.
TIEMPO DE RETENCIN:( TR ) Es el tiempo entre la inyeccin de una muestra y la aparicin de un pico de
soluto en el detector de una columna cromatogrfica.
TIEMPO MUERTO: ( TM ) Es el tiempo que tarda en salir de la columna una sustancia no retenida.
8. BIBLIOGRAFA.
LIBROS:
Anlisis Instrumental Skoog / Leary 4 Ed. Mc Graw Hill
Qumica Analtica Skoog / West / Holler 6 Ed. Mc Graw Hill
Anlisis qumico cuantitativo D.C. Harris. Grupo editorial Iberoamrica, Mjico, 1992.
Apuntes de la asignatura Qumica Analtica de la E.U.I.T.I.Z.
INTERNET:
www.altavista.com
www.google.com
www.eurojai.com
www.ig.csic.es
Trmino definido en el glosario, al final del trabajo.
Trmino definido en el glosario, al final del trabajo.
Trmino definido en el glosario, al final del trabajo.
Tiempo de retencin: Ver definicin en el glosario.
Tabla recogida de Anlisis Instrumental Skoog / Leary.
Recogida del libro Anlisis Instrumental : Skoog / Leary. 4 Ed. Mc Graw Hill.
Fig 2: Tomada de los apuntes de qumica analtica de la EUITIZ.

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Fig 3 : Tomada de los apuntes de qumica analtica de la EUITIZ.

Trmino definido en el glosario.
Trmino definido en el glosario.
Imagen tomada del libro Qumica Analtica 6 Ed. Skoog / West / Holler.
Tabla tomada del libro Anlisis Instrumental 4 Ed.. Skoog / Leary.
Trmino definido en el glosario.
Dibujo sacado de los apuntes de la asignatura Qumica Analtica de la EUITIZ.
Trmino definido en el glosario.
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