Preparacin de Clulas competentes congeladas

1. Dejar crecer la cepa deseada durante toda la noche en medio LB (sin antibitico).
2. Diluir en proporcin 1 a 100 con medio LB (sin antibitico) y agitar a 37C hasta que la
densidad de clulas OD600 alcance 0.3 0.4
3. Poner 1400 l de la dilucin en tubos epp de 1.5 ml y enfriar en hielo durante 10 minutos.
(1400 l en cada uno).
4. Centrifugar a 3500 rpm durante 7 minutos con rotor fro (-20 C).
5. Tirar el sobrenadante con cuidado.
6. Volver a llenar los tubos epp con cultivo LB fro, 1400 l.
7. Volver a centrifugar a 3500 rpm durante 7 minutos con rotor fro (-20C).
8. Tirar el sobrenadante con cuidado.
9. Agregar a cada tubo epp 500 l de 10 mM MgCl2 enfriado en hielo y resuspender el pellet
mezclando cuidadosamente 3 veces (a cada tubo).
10. Centrifugar las clulas durante 7 minutos a 3500 rpm con rotor fro (-20C).
11. Tirar el sobrenadante con cuidado.
12. Agregar 120 l de 50 mM CaCl2 y glycerol al 20% (ya est mezclado) enfriado en hielo y
resuspender el pellet mezclando cuidadosamente 3 veces (a cada tubo).
13. Colocar los tubbos en hielo durante 1 hr.
14. Congelar con etanol a -80C.
15. Mantener a -80C hasta su uso.