UNIVERSIDAD NACIONAL DE

SAN AGUSTN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERA DE
PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERA QUMICA

GUA DE PRCTICA
BIOQUMICA APLICADA
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos
Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
Ing. Karina Moran Medina

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Gua de Prctica con el objeto

de hacer llegar al interesado los alcances actuales de la bioqumica
aplicada en el laboratorio.
Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano
tienen como base el desarrollo de la biologa molecular, lo que a su
vez ha generado el desarrollo de la bioqumica como consecuencia
natural.
La aplicacin de los nuevos conocimientos de la bioqumica han
determinado el gran impulso que la bioqumica aplicada ha dado a la
nueva tecnologa de los bioprocesos.
Todos los avances de la biotecnologa tienen como sustento el
conocimiento previo de la biologa y de la bioqumica aplicada.
La presente Gua de Prcticas brinda a los estudiantes de
Ingeniera Qumica las destrezas bsicas para el empleo de los
diferentes instrumentos requeridos para el estudio prctico de la
bioqumica.

Los Autores

NDICE

PROLOGO
1

NDICE
Pgs.
PRCTICA 1

SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS..................

PRCTICA 2

DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS

PROTENAS...................................................................................................................

PRCTICA 3

DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS........................

PRCTICA 4

CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DILISIS.......................

PRCTICA 5

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHL..............................

PRCTICA 6

REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS................................

PRCTICA 7

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIN..................................

PRCTICA. 8

INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE

ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA............................

PRCTICA 9

EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES..............................................................

PRACTICA 10 DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA..........................

PRACTICA 11 CINETICA ENZIMATICA EN UREASA......................................................................
PRACTICA 12 EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO....................................................

INSTRUCCIONES
GENERALES
A. Busca los conceptos antecedentes y reprtalos, previo a
la realizacin de la prctica.
2

B. Construye
material.

la hiptesis

C. Lee
cuidadosamente
ejecutarlos.

de

los

trabajo,

antes

de solicitar el

experimentos

antes

de

D. Recurre a tus libros de texto y/o de consulta para aclarar

dudas y comprender el porq u de las operaciones que se
han efectuado; o consulta de inmediato al profesor
responsable.
E. Realiza cuidadosamente tus experimentos, procurando
entender el porq u de los hechos acaecidos.
F. Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo
experimental, observa
minuciosamente y anota los
cambios ocurridos: (olor, color, gases, liberacin
o
absorcin de calor, etc.), en tu manual o cuaderno.
G. Al concluir el desarrollo
experimental,
cuestionario para su futura revisin.

resuelve

el

H. Elabora tus conclusiones.

Material necesario para trabajar por alumno:
a) Individualmente: U n a bata de trabajo con manga larga.
b) Por equipo: Una cinta masking-tape de 1/2 pulgada, un
paquete de toallas de papel, un marcador indeleble, un
lienzo para limpiar la mesa.

PRECAUCIONES
EXPERIMENTO

EN

EL

DESARROLLO

DE

CADA

Las medidas oportunas y la comprensin de las prcticas a

seguir, har del laboratorio un lugar seguro como cualquier saln
de clases. Para ello debern tenerse en cuenta, en forma
general, las siguientes precauciones:

1. Observa dnde dejas el material caliente, cerciorndote

de que est fro antes de tomarlo con la mano.
2. Cuando calientes un tubo de ensaye, no lo apuntes hacia ti o
hacia tus compaeros, puede proyectarse su contenido.
3. Si cae sobre ti o en tu ropa un material corrosivo, lvate
inmediatamente con agua abundante y
llama a tu
instructor.
4. Nunca pruebes una sustancia si no se te indica. Puede ser
veneno.
5. Al detectar el olor de un lquido, no pongas la cara sobre la
boca del recipiente. Con tu mano abanica hacia ti el aroma.
6. Antes de usar un reactivo, lee dos veces la etiqueta para
estar seguro de su contenido.
7. Los aparatos
o recipientes en
los que
haya
desprendimientos
gaseosos
no
deben
cerrarse
hermticamente, pues las presiones formadas en su interior
pueden explotarlo.
8. Los tubos de ensaye no deben calentarse por el fondo sino
por las paredes, para evitar la expulsin de su contenido.
9. No arrojes cuerpos slidos en los lavabos, a menos que
estn pulverizados y sean fcilmente arrastrables o solubles
en agua. No viertas directamente los cidos en los lavabos,
ya que los corroe.
10.
Cuando
interrumpas
un
experimento,
coloca
etiquetas con leyendas apropiadas a los frascos y matraces
que contengan sustancias, as te ser fcil identificarlos.

11.
Cuando trabajes con fuego,
recogido para evitar se incendie.

mantn

tu cabello

12.
Cuando necesites encender el mechero, nunca lo
hagas con un papel, puede iniciar un incendio.

El profesor indicar el uso adecuado y la ubicacin de las

instalaciones de
agua,
luz, drenaje, gas, y otras que
existen en el labora- torio. Se recomienda que los alumnos
realicen un croquis de dichas instalaciones y practiquen
simulacros de evacuacin del edificio.

REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIO

1. Tendrn derecho al acceso y uso de laboratorio nicamente

los alumnos que estn matriculados en el curso respectivo o
las personas debida- mente autorizadas por la Direccin.
2. Los alumnos
respetarn durante
prcticas el horario que tengan asignado.

todo

el perodo de

3. Los alumnos se presentarn a la prctica en su horario

asignado acompaados de su profesor.
4. En las prcticas de la primera hora (7:00 a.m.), habr una
tolerancia mxima de 15 minutos para ingresar al laboratorio.
5. A partir de las 8:00 a.m., el alumno tendr
tolerancia para presentarse al laboratorio.

10 minutos

de

6. No se permitir la entrada al laboratorio si el alumno no se

presenta con su bata.
7. En ningn caso el alumno podr sustraer del laboratorio,
aparatos o materiales sin la autorizacin respectiva por escrito.
8. Es obligacin de los alumnos conservar en buen estado las
5

instalaciones, materiales
y equipo del laboratorio, as como
mantenerlo aseado, depositando la basura en los cestos que
para tal efecto existen.
9. El material y equipo de laboratorio recibido deber ser
revisado
de inmediato y reportar cualquier anomala o
desperfecto al responsable de laboratorio.
10. Es obligacin del alumno entregar al responsable de
laboratorio el material y equipo usado, limpio y en buen
estado, 5 minutos antes del trmino de la sesin de prctica
11. El material o equipo que se deteriore o se pierda ser
repuesto por los responsables en un plazo no mayor de 5 das
hbiles, de lo contrario se perder el derecho de uso de
laboratorio.
12. Sin excepcin de persona, est prohibido fumar e ingerir
alimentos y bebidas en el interior del laboratorio.
13. Las prcticas realizadas y reportadas en un curso no son
transferibles a otros alumnos.
14. Si por causas de fuerza mayor se suspendiera alguna prctica
programada en el curso, sta se realizar en la sesin inmediata
sin perjuicio para el alumno.
15. Las prcticas se evaluarn
profesor de cada asignatura.

de

acuerdo

al criterio del

16.
Los alumnos
que
muestren
indisciplina dentro
del
laboratorio sern sancionados de acuerdo a la gravedad de su
falta ya que este tipo de conducta puede originar un accidente.

PRCTICA

PRCTICA 1
SEPARACIN EN CAPA FINA
SEPARACIN EN CAPA FINA
DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS
DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS

I.

OBJETIVO:
Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina para la
identificacin de aminocidos presentes en una muestra biolgica.

II.

FUNDAMENTO TERICO:
AMINOCIDOS
Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas.
Por lo tanto, si a una determinada protena se le somete a una
hidrlisis ya sea cida o alcalina; ste proceso rendir una mezcla
de sus aminocidos constituyentes, los cuales pueden ser
susceptibles de ser analizados o identificados por mtodos
cromatogrficos.
Todas las protenas son polmeros y los monmeros que
se cambian para formarlos son los a -aminocidos.

Los diferentes aminocidos se diferencian por sus

cadenas laterales.
In vivo el pH fisiolgico es prximo a la neutralidad.
El pKa de los grupos carboxlo y amino de los alfa
-aminocidos
es
aproximadamente
2
y
10
respectivamente.
Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo
carboxilato habr perdido un protn y el grupo amino
habr captado un protn para dar la forma
ZWITTERION.
En los genes, de todos los organismos estn codificados
20 aminocidos que se incorporan a las protenas.
Todos los aminocidos son enantimeros (L)
Existen otros aminocidos (no proteicos) y tambin hay
aminocidos modificados que se hallan en las protenas.

 La variedad de las cadenas laterales (hidroflicas,

hidrfobas, cidas, bsicas, neutras) permite una gran
complejidad funcional en las protenas.
CROMATOGRAFA
Mtodo de Separacin
Permite separar, aislar e identificar
estrechamente relacionados presentes
complejas.

componentes
en mezclas

En estos mtodos se emplea:

- Fase estacionaria

: Slido/lquido

- Fase mvil

: liquido/gas

Los componentes de una mezcla se transportan a travs

de una fase estacionaria por medio de una fase mvil que
fluye.
Las separaciones se basan en las diferencias de
velocidad de migracin entre los componentes de la
muestra.
Cromatografa en Capa Fina
Tiene 2 partes: Fase mvil y Fase estacionaria.
El soporte o Fase Estacionaria.
Es un slido poroso capaz de retener solvente y slido
pueden ser.

El soporte poroso est adherido a la base, est pegado gracias

a la presencia de SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de slica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay

alguna marcha de la migracin de muestra o estndares esta
marcha ya no es verde sino violeta.
III.

PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
Se siembra los estndares y la muestra con un capilar
bastante fino.
Tener precaucin de que en el sembrado se intenta tener
una mancha entre 1 y 2 mm de dimetro.
La distancia entre las siembras puede ser no menor de 67mm aproximadamente.

Segundo Proceso: Elusin

Una vez sembrada la muestra se procede a la fase mvil
con la ayuda de un solvente de elusin.
Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin

10

El solvente debe estar por debajo del sembrado de la

muestra.
El solvente comienza a subir por capilaridad.
Las muestras se comportan diferente segn el solvente
utilizado y sus componentes algunos migrarn
rpidamente otros no.
Tercer Proceso: Visualizacin o Revelado
El producto puede verse:
Por s mismo porque tiene color.
Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple
vista.
Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dnde est la
mancha dando coloraciones amarillas profundas.
Usando mtodos qumicos, usando una sustancia qumica como
revelado, ( en este caso ninhidrina en butanol)

11

Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en funcin de su

factor de retardo RF que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente

con la de una sustancia patrn en idnticas condiciones.
La razn de estas distancias se designa por Rf
IV.

PARTE EXPERIMENTAL:
Sembrado de estndares de aminocidos y muestras
Corrida cromatogrfica. Elusin
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
Tapar hermticamente y dejar que proceda el desarrollo de la
separacin cromatogrfica, hasta que el solvente haya
alcanzado el frente trazado en la parte superior de la placa.
Revelado del cromatograma
-

Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.

Destapar la cmara y retirar con cuidado la placa de vidrio. Secar la placa con ayuda de una secadora de cabello.

12

Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol

sobre la placa. Secar la placa con una secadora.

Identificacin
Luego proceder a identificar las manchas existentes que
debern corresponder a aminocidos para ello se debern hacer
los clculos de los Rfde los estndares y luego los Rf
correspondientes a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reaccin que identifica aminocidos a
travs de una coloracin azul violeta.
V.

CUESTIONARIO:
5.1.

Haga un esquema de los resultados observados.

5.2.

Calcular los Rf de los estndares y muestras.

5.3.

Identificar que aminocidos estn presentes en las muestras

problemas.

5.4.

13

5.5.

Qu es la cromatografa de exclusin molecular y la

cromatografa de intercambio inico y cules son sus
aplicaciones.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________

5.6.

Qu mtodos existen para el anlisis de aminocidos de las

protenas.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.7.

Indicar tipos de solventes de elusin para la fase mvil tanto

para silica y almina.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.8.

Haga el mecanismo de reaccin de la Ninhidrina con los

aminocidos.

5.9.

La cromatografa en capa fina separa las sustancias segn su

peso molecular.? Fundamente.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

14

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

15

VI.

OBSERVACIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

VII.

CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

VIII.

BIBLIOGRAFA
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

16

PRCTICA

PRCTICA 2

DETERMINACIN DE LAS

DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS

DE LAS PROTENAS
PROPIEDADES
QUMICAS DE LAS

PROTENAS

17

I.

OBJETIVOS:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir y
demostrar de manera cualitativa las propiedades qumicas de las
protenas en base a los siguientes aspectos:
Solubilidad de las protenas.
Las propiedades electroqumicas de las protenas.
El efecto cido-bsico en la solubilidad de las protenas.

II. PRERREQUISITOS:
1. Salting In y Salting Out.
2. Agentes precipitantes de protenas.
3. Propiedades fisicoqumicas del agua.
4. Ecuacin de Henderson-Hasselbach.
III. INTRODUCCIN:
Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de
aminocidos. En las protenas existen 20 tipos de aminocidos
diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia
determinados por el cdigo gentico.
Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso
molecular de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una
considerable variacin de formas y estructuras. Para su estudio se
consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la
ms simple la estructura primaria y la ms compleja la estructura
cuaternaria cuya conformacin depende de diferentes fuerzas
qumicas de atraccin y repulsin que son ejercidas sobre la
estructura molecular de la protena y por lo tanto son
responsables de su estabilidad.
Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos:
protenas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias
en sus propiedades qumicas y fsicas. Sin embargo, para los fines
que se persiguen en esta prctica se les mencionara en forma
general.
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena
son: La fuerza inica del medio, el pH. la temperatura y la
constante dielctrica del solvente. Cuando hay un cambio de
cualquiera de estos factores, la protena responde con una
intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la
estructura proteica de una manera superficial o lo hace tan
drsticamente que desnaturaliza a la protena. Por fortuna, en
nuestro organismo, la variacin de tales factores es mnima por lo
que son imperceptibles los cambios en la protena.

18

IV. MATERIAL:
13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
1 pipeta de 10 ml
5 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 5 ml
1 gradilla
V. METODOLOGA:
En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en
protenas que se encuentran en el organismo, mediante la
modificacin las propiedades de los solventes, para establecer
una relacin con los efectos que se pueden presentar en el
organismo.
Fundamento Qumico:
Las protenas poseen cargas positivas y negativas dependiendo
del pH de la solucin en la cual se encuentran; cuando se
neutralizan, se presenta precipitacin proteica.
La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la
constante dielctrica del solvente permitiendo una mayor
solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se aade exceso
de una sal, se neutralizan las cargas de la protena y sta tiende a
precipitar. Este mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas
cargadas electropositivamente. Con la adicin de un cido o una
base a una solucin proteica se alcanza un estado en que hay el
mismo nmero de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza
la carga de la protena y tiende a precipitar. El pH que determina
el nmero igual de cargas de signos opuestos se denomina punto
isoelctrico.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin
de un cido.
Preparar una solucin de caseinato de sodio, tomando 250 mg de
casena, 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N. Cuando la
solucin sea perfecta, se agregan 5 ml de cido actico 1 N.
Mezclar bien, diluir a 50 ml con agua destilada. Si la solucin no
est suficientemente clara, se puede filtrar.
Preparar los siguientes tubos como se indica a continuacin
Tub
o
1
2

p
H

Agua
destilad
a
8.38
7.75

Ac.
Actico
0.01N
0.62
1.25

Ac.
Actico
0.1
0
0

Ac.
Actico
1.0N
0
0

Casein
ato de
Sodio
1.0
1.0
19

3
4
5
6
7
8
9
10

8.75
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
5.8

0
0
0
0
0
0
0
0

0.25
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
0
0

0
0
0
0
0
0
1.6
3.2

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que

presente la solubilidad de la casena en cada tubo. Reportar el
punto isoelctrico correspondiente al tubo donde se presenta la
mayor precipitacin.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de HendersosnHasselbach.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin
de un cido.
Tubo
pH
Solubilidad
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Cul es el punto isoelctrico de la protena ?
____________________________________________________________________
VI. CUESTIONARIO:
6.1.

De qu factores depende la solubilidad de una protena en el

agua.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.2.

Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la

adicin de un cido o una base fuerte.
20

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

21

6.3.

Explique cmo afecta un cambio en la constante dielctrica

del agua a la solubilidad de una protena.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.4.

Qu es el Salting in y qu tipo de compuestos pueden

promoverlo.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.5.

Qu es el Saltingout y qu tipo de compuestos pueden

promoverlo.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.6.

Qu relacin existe entre el punto isoelctrico y la solubilidad

de una protena.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.7.

Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos

est indicado utilizarse.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

22

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
6.8.

Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le

permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto
incluyendo hidrofbicos a travs de un medio acuoso.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

VII. OBSERVACIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
______________________________________________________
VIII. CONCLUSIONES

23

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
IX. BIBLIOGRAFA
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

24

PRCTICA 3
DETERMINACIN
PRCTICA 3

ESPECTROFOTOMTRICA DE
DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE
PROTENAS
PROTENAS

25

I.

OBJETIVO
Determinar la concentracin de una solucin de protenas
mediante la reaccin de Biuret y el espectrofotmetro.

II.

FUNDAMENTO:

La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar

mediante la reaccin del Biuret. El reactivo Biuret contiene
CuSO4 en solucin alcalina. La reaccin se basa en la
formacin de un compuesto de color violeta, debido a la
formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu
(+2) y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno
que forma parte de los enlaces peptdicos.

Los compuestos que contienen 2 o ms enlaces peptdicos

producen un color violeta
caracterstico con soluciones diluidas de sulfato de cobre
(CuSO4) en solucin alcalina.

26

El color se debe al compuesto de coordinacin formado al

existir enlaces qumicos entre los pares de electrones libres
del tomo de nitrgeno presente en los enlaces peptdicos de
las cadenas proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorcin de los complejos entre los iones de

Cu+2 y las diferentes protenas son similares pero no idnticas
por lo tanto, se puede utilizar una protena como patrn de
calibracin. La curva de calibracin obtenida por este mtodo,
se har utilizando como patrn solucin de extracto de
levadura, cuya concentracin es de 8 mg/ml preparada con
agua destilada.

Espectrofotometra. Principios bsicos

La reaccin de biuret es cuantificable, es decir a mayor
concentracin de protenas, mayor intensidad de color violeta,
estas reacciones en las que el color formado es proporcional a
la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimtricas.

Midiendo la intensidad de color se podra conocer la

concentracin de la sustancia que lo produce. Para ello se
aplican tcnicas fotomtricas, empleando un aparato llamado
colormetro (si mide slo un determinado color) o
espectrofotmetro (si realiza una medida de todo el espectro
de colores).
La luz es parte de la radiacin electromagntica, que se
propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones
luminosas se diferencian unas de otras por sus longitudes de
onda que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones
comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los
colores del arcoris, de tal forma que cada color corresponde a
una radiacin con una longitud de onda especfica. El
espectrofotmetro dispone de una lmpara que emite luz
monocromtica, de una longitud de onda determinada, que
incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un
detector, que medir la cantidad de luz que no es absorbida
por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizar
la radiacin de longitud de onda a la que absorba ms cantidad
de luz ( a la longitud de onda de mxima absorbancia).

27

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la

fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es
proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la
sustancia atravesada por la luz. La relacin entre luz incidente
(Io) y la reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin
que ha sido absdorbida por la muestra. Esto es lo que se
denomina Absorbancia (Abs)DensidaOptica (DO)

Laley de Beer-Lambert se formula como:

Abs (DO) =e x C x 1
Siendo e el coeficiente de extincin molar (especfico para
cada sustancia a una longitud de onda y en unas condiciones
determinadas (M-1, cm-1), C es la concentracin de la muestra
a medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayora de los
espectrofotmetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm
de espesor, por lo que 1 se puede ignorar. As la concentracin
desconocida de la sustancia ser:
C = Abs /e

28

III.

MATERIALES Y EQUIPO

Espectrofotmetro
Gradilla para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado
Probetas, Pipetas
Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret
IV. PROCEDIMIENTO
Realizacin de una curva patrn: Como se desconoce el
coeficiente de extincin molar () de las protenas coloreadas con
el reactivo biuret, se proceder a construir una curva patrn,
midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones
conocidas de protena, para sobre ella interpolar el valor de Abs
de la solucin problema y determinar su concentracin
grficamente y tambin por regresin lineal. Para ello se dispone
de una solucin de 10 mg/ml de protena (extracto de levadura) a
partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la
frmula:

Ci x Vi =

Cf x Vf

Dnde:
Ci = concentracin de la solucin madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solucin madre inicial
Cf= concentracin final de la solucin a preparar
Vf= volumen total final de la solucin a preparar
En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solucin madre
(Ci=10 mg/ml) las soluciones de la tabla.

29

Conc.
Final. Sol.
a
preparar

Volume Volum
n Sol. en
Madre
agua
inicial

Volume Volum
n
Rx. en
Biuret
Final

Tubo

Mg/ml

ml

ml

ml

ml

Blanc
o

0,0

4,0

0,5

3,5

1,0

3,0

1,5

2,5

2,0

2,0

2,5

1,5

3,0

1,0

3,5

0,5

4,0

0,0

Muest
ra

4,0

0,0

Abs.
570n
m

Al aadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la

absorbancia.
Medicin de la absorbancia en el espectrofotmetro:
a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de mxima
absorbancia para la reaccin del biuret)
b) Poner en la cubeta del espectrofotmetro el contenido del tubo
blanco, secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el
espectrofotmetro.
c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la
absorbancia de las soluciones de los otros tubos, comenzando
por el de menor concentracin.
e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs
del tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco
(Abs=0), se construye una recta en papel milimetrado,
30

representando las concentraciones en el eje de abscisas y las

Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la protena problema en la grfica y
calcular su concentracin.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional
a la concentracin y que la relacin es lineal: Y = a + b X
(Y = A + B x Conc.). Utilizando regresin lineal se obtiene
el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar
concentracin que en este caso es de la muestra desconocida.

31

V.

CUESTIONARIO
5.1 Cul es la concentracin de protenas de la muestra?

5.2 Se podra determinar la concentracin de

muestra de protenas con esta curva patrn?

cualquier

5.3 Los
aminocidos y los dipptidos daran positiva la
reaccin del Biuret?

5.4

Investigue si existe alguna protena en la que no est

presente ninguna aminocido con anillo bencnico en su
cadena lateral, e indique que consecuencias tendra sobre la
determinacin espectrofotomtrica

32

33

VI.

OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________________________________

VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________
VIII. BIBLIOGRAFA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
34

35

PRCTICA 4
PRCTICA 4
CONCENTRACIN DE EXTRACTOS
CONCENTRACIN
DE
EXTRACTOS
PROTEICOS POR
DILISIS

PROTEICOS POR DILISIS

36

I.

OBJETIVO
Aumentar la concentracin de las protenas en un extracto o
solucin que las contenga.

II. FUNDAMENTO
La dilisis es una tcnica que separa las molculas de acuerdo a
su tamao usando membranas semipermeables que contienen
poros de dimensiones menores que las macromolculas que se
deseen separar como las protenas, los poros permiten la difusin
de las molculas de solventes, sales y otras molculas pequeas,
pero bloquean el paso de protenas por su gran tamao.
Se usan membranas de celofn (acetato de celulosa),
nitrocelulosa, colodin, u otras de naturaleza semipermeable.
Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusin por
diferencia de concentracin.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
01 pliego de papel celofn.
1Kg de azcar.
Solucin de extracto proteico al 0.5%.
Pipeta de 10 ml.
Vaso de precipitados.
Piceta.
IV. MTODO
Preparar una bolsa con el papel celofn, de modo que no se
presenten fugas al llenarla con una solucin.
Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solucin de
protena al 0.5%.
Comprobar
la
concentracin
espectrofotmetro a 280 nm.

de

protena

con

el

Llenar la bolsa de celofn con 50 ml de solucin proteica,

usando para tal fin la pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa
de modo que no presente fugas.
Preparar un tazn con azcar, y colocar all la bolsa de celofn
conteniendo la solucin proteica.
Untar toda la bolsa de celofn, con el azcar, cubrindola por
completo.
Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azcar, observando
los cambios ocurridos.

37

 Medir el volumen de lquido que qued en la bolsa de celofn

y comparar con el volumen inicial.
Mediar nuevamente la concentracin de protenas en el
espectrofotmetro a 280 nm.

V. CUESTIONARIO
Seale las principales tcnicas de separacin de solutos por
membrana, y las principales aplicaciones de cada una de
ellas.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________
Investigue la composicin qumica de la membrana utilizada y
explicar las razones de su porosidad.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________
Efecte los clculos de variacin en el
concentracin de la protena en solucin.

volumen

la

Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de

solventes por osmosis.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
38

Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de

solutos por difusin debida a diferencias de concentracin.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
VI. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________________________________
VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________
VIII. BIBLIOGRAFA
39

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

40

PRCTICA 5
DETERMINACIN DE PROTENAS
PRCTICA 5
POR MICRO-KJELDAHL
DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICROKJELDAHL

41

I.

OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en
una muestra desconocida.

II. FUNDAMENTO
El mtodo de micro-kjeldahl es una simplificacin hecha por
HACH en el proceso Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo
anlisis en un tiempo corto y con pequeas muestras.
Se funda en la transformacin del nitrgeno presente en las
protenas a nitrgeno inorgnico. Para ello se siguen tres etapas
claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por accin del cido
sulfrico en presencia de oxidantes fuertes (perxido de
hidrgeno), de esta manera todo el carbono presente se libera
como CO2 y nitrgeno como NH3, luego este se combina con
el exceso de cido sulfrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la
accin de un lcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se
recibe en una solucin de cido dbil en presencia de
colorante indicador.
3. En la tercera se titula la solucin con un cido fuerte
cuantificando el nitrgeno presente.
Luego se aplica la relacin siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
dnde: ml.N.fc.meq = peso de nitrgeno en la muestra
ml = gasto de cido sulfrico en la titulacin (ml)
N. normalidad del cido
Fc. Factor de correccin del cido
meq.= peso del miliequivalente del nitrgeno
Suponiendo que la muestra solo contiene protenas simples
con 16% de N, el porcentaje de protenas ser:
Protena = 6.25xN
III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinacin se hace en tres etapas:
DIGESTIN.
Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es slido) y
colocar en el matraz de digestin
Agregar 4 ml de cido sulfrico concentrado al matraz
42

 Verificar que el control automtico del digestor este en

440C y que haya succin en la columna de
fraccionamiento.
Digerir la muestra por 4 min despus de haber alcanzado
la temperatura indicada.
Aadir 10 ml de perxido de hidrgeno al 50% a la
muestra a travs de un embudo de la columna de
fraccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro, aadir
porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se
aclare.
Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar
la columna de fraccionamiento, y colocar el matraz sobre
un bloque y tapar hasta que se haya enfriado.
Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.
DESTILACIN
El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un
baln de destilacin.
Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de
cido borrico al 4% ( en volumen) adicionndole indicador
azul de metileno y rojo de metilo, dando una coloracin
violeta.
El baln de destilacin que contiene el digesto se aade
13 a 15 ml de hidrxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3
granallas de zinc.
Conectar el equipo de destilacin y destilar el digesto
durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor
tenga una coloracin verdusca y su volumen sea ms o
menos 3 veces del volumen inicial)
TITILACIN.
Preparar una solucin de cido sulfrico 0.1 N y
valorizarla.
Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de
verde a violeta
IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre protenas simples y conjugadas.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

43

___________________________________________________________________
________
Indique ejemplos y estructuras primarias de dos protenas
simples y dos protenas conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las

etapas durante el proceso de determinacin del nitrgeno

Efectu los clculos y determine el contenido de protenas en la

muestra

Indique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante

la etapa de digestin

Explique el objetivo de la etapa de destilacin.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Explique porque la titilacin se hace con cido sulfrico y no con
un lcali.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
44

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
V. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
VI. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________
VII. BIBLIOGRAFA

45

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

46

PRCTICA 6
PRCTICA 6

REACCIONES DE IDENTIFICACIN
DE CARBOHIDRATOS

REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS

47

I.

OBJETIVOS:

Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos.

Diferenciar experimentalmente monosacridos, disacridos y
polisacridos.
Familiarizarse con la clasificacin de los hidratos de carbono
en reductores y no reductores.
Estudiar las propiedades del almidn.

II. FUNDAMENTO TERICO:

Se denominan carbohidratos o glucsidos los derivados
aldehdicos cetnicos, reales o potenciales de alcoholes
polivalentes o sus productos de condensacin segn la cantidad
de glucsidos o azcares sencillos que se obtengan por hidrlisis
de los policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacridos (celulosa, almidn)
Trisacridos (rafinosa)
Disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacridos
Los monosacridos por el grupo carbonilco pueden ser aldosas o
cetosas por el. nmero de tomos de oxigeno, pueden ser
hexoaas (glucosa, galactona, manosa, fructosa), pentosa
(arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones
carbonilo y oxhidrilo y, adems, algunas especficas. Todos son
ptimamente activos. Por el calor y la accin de cidos fuertes se
deshidratan, dando en algunos casos derivados del furfural.
Los hidratos de carbono ms abundantes de la bisfera estn
constituidos por el almidn y celulosa que son polmeros de
glucosa presentes en plantas.
El almidn est distribuido ampliamente en las plantas que lo
almacenan en granos y en tubrculos como reserva alimenticia
para el momento de la germinacin. Todos los tipos de almidn
producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador
cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidn.
La hidrlisis del almidn catalizada por cidos lo convierte en
varias clases de dextrinas, en maltosa y por ltimo en D (+)
glucosa.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la
hidrlisis puesto que la coloracin va cambiando de azul a rojo a
medida que decrece el peso molecular delcompuesto orgnico.
Los grupos funcionales existentes en el almidn y en la celulosa
son los grupos hidroxilo y acetal. Estos polisacridos tienen
diferente configuracin, siendo el almidn un glucsido y la
48

celulosa un f -glucsido. Tambin difieren en el tamao teniendo

lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del
almidn.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Reactivo Molisch

Tubos de ensayo

Reactivo Fehling

Pipetas

Reactivo Tollens

Bao de agua hirviente

Reactivo Seliwanof

Pinzas

Reactivo Barfoed

Bao hirviente

Sol. glucosa 1%

Vaso de precipitados

Sol. fructuosa 1%

Luna de reloj

Sol. sacarosa 1
Sol. lactosa 1%
Sol. almidn 1%
Sol. sacarosa 5%
Sol. HCl

10%

Sol. NaOH 10%

Sol. yodo - yodurado
IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genricas de los carbohidratos
Reaccin de Molisch
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una
solucin de glucosa al1%, 1 ml. de solucin de fructuosa o
levulosa al 1%, 1 ml. de una solucin de sacarosa al 1%, 1 ml.
de una solucin de lactosa al 1%, 1 ml. de una solucin de
almidn al 1% y en el ltimo 1 ml. de agua (testigo). A cada
una agrguele 2 gotas
de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por
las paredes 2 ml. de cido sulfrico concentrado.
Observe el color violceo del anillo formado en la interfase
entre los dos lquidos. Anote aquellas soluciones que den
positiva la prueba.
Reacciones Especficas
Reacciones de Fehling
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solucin
A de Fehling con 0.5 ml. de la solucin B de Fehling,

49

agrgueles 1 ml. de la solucin de los carbohidratos utilizados

en el experimento anterior.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay
cambios de color, formacin de precipitados.
Reaccin de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de
Tollens recientemente preparado, aadir a cada uno 2 ml. de
las soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay
formacin de espejo de plata y cuales carbohidratos dan
negativa esta reaccin.
Realice una comparacin de estos resultados con los de la
prueba de Fehling.
Reaccin de Seliwanof
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanof,
luego aada 3 gotas de solucin de los carbohidratos
utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a bao
hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el
color adquirido.
Reaccin de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego
aada 1 ml. de solucin de los carbohidratos utilizados
anteriormente, luego llevar los tubos a bao hirviente y
observar la formacin de un precipitado de color rojo ladrillo,
lo que indicar la presencia de monosacridos.
Los disacridos tambin precipitan xido cuproso, pero muy
lentamente.
Hidrlisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solucin de sacarosa al
5%, llvelos a bao hirviente y a cada tubo aada volmenes
iguales de agua para el primer tubo, cido clorhdrico al 10%
en el segundo tubo, e hidrxido sdico acuoso al 10% en el
tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a
continuacin la reaccin de una porcin de cada mezcla con la
solucin de Fehling. Qu conclusiones deduce?
Ensayo del Almidn frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solucin de almidn al
1%, aada una gota de solucin de Iodo - lodurada, observe el
color de la solucin. Luego caliente la solucin coloreada a
ebullicin y observe el efecto, observe tambin qu efecto
produce el enfriamiento de la solucin.
50

 Hidrlisis del Almidn

En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solucin de
almidn al 1%, aada 1 ml de cido dorhdrico concentrado.
Hierva la solucin y retire muestras de Y ml. a intervalos
prximos, ensayando su reaccin frente al iodo. Anote el color
en los diferentes ensayos.
Cuando la solucin ya no produzca coloracin con el iodo,
neutralcela y ensaye la reaccin de una muestra frente al
Fehling. Formule estructuralmente los productos finales de la
hidrlisis del almidn (un disacrido y un monosacrido).
V. CUESTIONARIO:
5.1.

Indique la composicin de los reactivos utilizados en la

prctica (R. Molish, R. Seliwanof, R Barfoed, R Fehling).

5.2.

Elabore un diagrama de flujos del proceso de produccin de

la glucosa a nivel industrial.

5.3.

A qu se debe la coloracin azul del iodo sobre las muestras

de almidn?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________

51

______________________________________________________________
____________
5.4.

Cmo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrlisis

del almidn?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

VI. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________
VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
52

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
____________

53

PRCTICA 7
METABOLISMO DE
CARBOHIDRATOS:
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS:
FERMENTACIN.
FERMENTACIN.
PRCTICA 7

54

I.

OBJETIVOS
1) Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin
celular anaerbica (fermentacin) en levaduras.
2) Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la
respiracin celular.
3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos,
inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de
pH e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.

II. ACTIVIDADES
Fermentacin
alcohlica
(Saccharomycescerevisiae).

en

levaduras

La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la

reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas,
por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de
CO2.
III. PROCEDIMIENTOS.
3.1.

Complete la siguiente batera de tubos:

Tubos

Suspensin 1 ml
de levadura
7%

1 ml

1 ml

1 ml

Sol.
Glucosa

1 ml

1 ml

1 ml

Sol. NaF

1 ml

Agua
destilada(4
3C)

2 ml

1 ml

Sol.Rojo
Neutro

1 ml

Agitar por inversin para homogenizar el contenido de cada

tubo.
3.2.

Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido,

presionndolo girar rpidamente de manera que el tubo
quede invertido dentro del frasco. Marcar el nivel de la
burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un
55

elstico los 4 frascos, ponerlos a incubar en un bao de agua

a 43C.
3.3.

Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solucin en el

tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con
agua.

3.4.

Cul es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2

con papel pH.

3.5.

Anote y discuta sus resultados.

Soluciones:
1 Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de
levadura en 10 ml de agua destilada a 43C y completar a 100
ml con agua destilada a 43C.
2 Solucin de glucosa 0,1 M
3 Solucin de NaF0,1 M
4 Solucin rojo neutro 0,02 M
Papel pH.
IV. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
56

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________
V. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________________________
VI. BIBLIOGRAFA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

57

PRCTICA. 8
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y
PRCTICA. 8
CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE
POR SACCHAROMYCES cerevisiae
ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA.
INMOVILIZADA.

58

I.- OBJETIVOS
1 Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2 Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3 Evaluar por refractometra el grado alcohlico del producto
de la fermentacin
II.- ACTIVIDADES
Fermentacin
alcohlica
(Saccharomycescerevisiae).

en

levaduras

La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la

reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas,
por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de
CO2 y por la concentracin del producto formado o por la
disminucin de la concentracin del sustrato (en grados Brix)
III.- MATERIALES.
-

Material biolgico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas

Reactivos: Agar-agar, solucin de glucosa 5%
Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodrmicas de
20cc, esptulas, picetas, papel toalla.
Equipos: Balanza, refractmetro, bao mara.

IV.- PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificacin en 50 ml de agua
destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada,
con calentamiento y agitacin constante.
Calibrar el bao de mara a 40C, para mantener dentro del agar
licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla
en refrigeracin (aproximadamente 4C), por 30 minutos.
Inmovilizacin de la enzima:
Mezclar 50 ml de la suspensin de levaduras y 50 ml de agar agar
licuado y homogenizar.
Tomar con una hipodrmica de 20 ml un volumen de la mezcla y
dejar caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal
refrigerado.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con
movimientos rotatorios suaves.
Secar los pellets en papel toalla.
59

Obtencin del mosto de uva:

Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.
Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alcuota y leer los grados brix o porcentaje de azcar en
el refractmetro.
Obtencin de etanol:
Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de
uva, (o 50ml de una solucin de glucosa al 5%). To0mar una alcuota,
considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados brix o
porcentaje de azcar en el refractmetro.
Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alcuotas cada 15 minutos.
Leer los grados brix en el refractmetro para cada alcuota.
V .- CUESTIONARIO.
1.-Indique la importancia de la inmovilizacin de enzimas y/o clulas.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

2- Cul es el fundamento de la inmovilizacin de levaduras en agar?.

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

3.- Explique las caractersticas coagulantes del agar-agar.

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las
clulas de levadura, si estas estn atrapadas en la matriz de agaragar.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

5- Presente al menos un caso detallado de aplicacin de la

inmovilizacin de enzimas.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
60

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

6- Qu otros mtodos para la inmovilizacin se utilizan?

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VI.- CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________
VIII.- BIBLIOGRAFA

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
61

62

PRCTICA 9
PRCTICA 9

EXTRACCIN DE ENZIMAS

EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES

VEGETALES

63

I.

OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cscara de frejol y comprobar su
actividad cataltica.

II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son protenas con accin cataltica.
Las protenas se encuentran en el interior de las clulas en un
estatus particular, a pH fisiolgico, y con estructura nativa
estabilizada por diversas mezclas de sustancias.
La extraccin de enzimas debe realizarse de modo que conserven
las caractersticas estructurales y las propiedades funcionales de
las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad uresica,
debido a la enzima ureasa presente en la cscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato rea provoca la
hidrlisis de esta con la consiguiente liberacin de amoniaco y
anhdrido carbnico, segn la siguiente reaccin.
O=C

NH2
+

H2O ----------

2NH3 + CO2

NH2
La actividad uresica se puede comprobar haciendo reaccionar
el amoniaco liberado con el Reactivo de Nessler (K 2Hg14). Este
reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y Potasio, que al
reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de
color amarillo-anaranjado (complejo cuya frmula se supone sea
HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes
de onda de 405 a 420 nm.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
150 gr. De cubierta de frejol, solucin de rea0.3 M, agua
destilada
Bufer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
Espectrofotmetro, Bao Mara, Balanza,
Equipo de
filtracin, papel filtro, Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04
tubos de ensayo de 10 ml. Baln
de 500ml. Vaso de
precipitados de 500 ml.
IV. PROCEDIMIENTO.
Extraccin de la Enzima.
Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o
(agua hervida fra) , despus de 24 horas remover la
cscara por friccin, y proceder a escurrir el agua.
64

 Preparar 200 ml. De bufer fosfato de sodio 0.005 M.

( PO4HNa2) , y 200ml. De solucin EDTA 0.001 M. Usando
en ambos casos agua destilada fra, mezclar ambas
soluciones, y enfriar a 4C. En un baln de 500 ml.
Pesar 20 gr de cscara de frejol y colocarlo en un vaso de
precipitados de 500 ml.
Agregar 90 ml. De bufer fosfato previamente preparado,
y licuar cuidando se mantenga baja la temperatura.
Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De
agua destilada.
Centrifugar la suspensin a 14,000 g. Por 10 min. o pasar
la solucin por un filtro rpido y enjuagar el papel filtro
con 10 ml. De agua destilada.
Separar el sobrenadante y medir el volumen final del
extracto obtenido, llevar a refrigeracin.
Preparar un cuadro de resultados.
CASCARA

BUFFER

AGUA

EXTRACTO

FINAL (ml)

Determinacin de presencia de protenas en el extracto

por espectrofotometra.
Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de
reactivo biuret.
Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1
ml de agua y 4 ml de reactivo biuret.
Calibrar el espectrofotmetro y leer la absorbancia a 570
nm. Para comprobar la presencia de protenas.
Anotar la lectura de Absorbancia.
Comprobacin de La actividad enzimtica.
Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo
muestra y el otro como tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3
M y 1.5 ml de bufer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de
agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente,
para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C
por 15 min.
65

 Despus de incubar los tubos, adicionar el Reactivo

Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo. Volumen total 8
ml.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio
ambiente.
Calibrar el espectrofotmetro a 420 nm.
Medir la absorbancia. La muestra de extracto dar
coloracin y un alta absorbancia por el amoniaco liberado.
V. CUESTIONARIO.
Explique por qu es necesario licuar la cscara durante la
extraccin de la enzima ureasa.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Diga que pruebas se tienen de haber extrado realmente enzimas
vegetales.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Haga los clculos de reactivos para las soluciones que se
prepararon.

Explique el papel que juegan en la extraccin el bufer fosfato y

la refrigeracin.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
66

___________________________________________________________________
____________
Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extraccin
utilizado en laboratorio.

VI. OBSERVACIONES
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________
VII. CONCLUSIONES
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________
VIII. BIBLIOGRAFA

67

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________

68

PRACTICA 10
PRACTICA 10

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN

UREASA
ENZIMATICA
EN UREASA

69

I.

OBJETIVO
Determinar la capacidad cataltica o actividad enzimtica de la
enzima ureasa.(enz. Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimtica (U) es la expresin del poder cataltico
de la enzima y se obtiene midiendo la velocidad de la reaccin
que cataliza.
La actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de enzima
contenida en 1 ml de solucin que transforma o produce 1 mg de
sustrato producto por minuto medidas en las condiciones
optimas de operacin de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos
organismos vivos, mas no en el organismo humano. Algunas
fuentes comunes son las bacterias, o la cscara de frejol.
La ureasa cataliza la descomposicin de la rea segn la
reaccin:
NH2
CO

+ H2O

2NH3 + CO2

NH2
La velocidad de una reaccin enzimtica como la velocidad de
cualquier reaccin puede ser determinada midiendo:
1 la cantidad de sustrato transformado en un determinado
tiempo de reaccin
2 la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reaccin catalizada por ureasa se puede hacer
el ensayo midiendo la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo
cualquiera de los productos (CO2 NH3) producidos en un
tiempo determinado.
Por facilidad se medir la cantidad de amoniaco formado, lo cual
se hace por medios espectrofotomtricos utilizando el reactivo
Nessler que es un ioduro doble de mercurio y potasio que al
reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo
de color anaranjado castao.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH

HgONH2I + 7KI + 2H2O

La intensidad del color formado ser directamente proporcional

a la cantidad de amoniaco presente en cada tubo y se medir la
absorbancia de cada tubo a 420 nm (filtro morado).
III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
Materiales.
Preparar 50 ml de solucin de urea 0.3 M.
70

 Preparar 100 ml bufer fosfato 0.05M de pH=7.4, con

EDTA 0.001M
Reactivo Nessler.
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/ml en bufer fosfato
pH, 7.4 ( a 4C)
100 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M
(5x10-4milimoles/ml)
Material de vidrio.
02 fiolas de 50 ml.
02 fiola de 100ml.
08 tubos de ensayo.
01 gradilla para tubos.
01 espectrofotmetro.
bao de hielo.
Incubadora a bao mara.
Determinacin de la curva de calibracin.
Se preparan en los tubos de ensayo
amonio segn la tabla siguiente:

soluciones

de sulfato de

Patr
n
N

Concentra SO4(NH ml
de Buf
cin (NH3) 3)2
SO4(NH er
mol/ml
nmol/ml 3)2
(ml)

Nessl Volum
er
en
(ml ) final
ml

Blan
co

00

0.0

0.0

7.50

0.5

8.0

5.0

0.01

7.49

0.5

8.0

10

0.02

7.48

0.5

8.0

15

0.03

7.47

0.5

8.0

20

0.04

7.46

0.5

8.0

25

0.05

7.45

0.5

8.0

30

0.06

7.44

0.5

8.0

Con los datos obtenidos se construye

equivalencia o curva de calibracin.

la

curva

Absorban
cia
420 nm.

de

Medida de la actividad ureasica.

Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo
muestra y el otro como tubo de blanco.
71

En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M

y 1.5 ml de bufer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solucin de ureasa y 4.8
ml de agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar
suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por
15 min.
Despus de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubacin e
introducir en bao de hielo para detener la reaccin.
Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada
tubo). Volumen total 8 ml, agitar.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Leer la absorbancia a 420 nm.

IV. CUESTIONARIO
1.- Efecte los clculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reaccin enzimtica.

3.- Calcule la actividad enzimtica de la solucin de ureasa en nmol

de NH3 producido/min.

4.- Explique por qu durante la reaccin debe incubarse a 37C

72

5.- Realizar los clculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y

urea para cada tubo
patrn usados en la construccin de la
curva de calibracin.

6.- Encontrar la equivalencia por el clculo del factor de

equivalencia y por la
determinacin analtica de la ecuacin
de la curva.

7.- Diga si la curva de calibracin obtenida obedece a la ley de

Beer. Explique por qu.

8.- Explique por qu es necesario contar con un blanco en las

determinaciones de
actividad enzimtica.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimtica y actividad

especfica.

73

V. OBSERVACIONES

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

74

PRACTICA 11

PRACTICA 11

CINETICA
ENZIMATICA
EN UREASA
CINETICA ENZIMATICA
EN UREASA

75

I.

OBJETIVO.
Verificar la variacin de la velocidad de
enzimticas con la concentracin del sustrato.

las

reacciones

II. FUNDAMENTO.
La rea puede descomponerse por accin de la enzima Ureasa,
para formarse amoniaco y bixido de carbono segn la
siguiente ecuacin.
NH2
CO

+ H2O

2NH3 +

CO2

NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por
espectrofotometra a = 420 nm, si previamente se le
compleja con reactivo Nessler.
Cintica de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimticas varan con la
concentracin del sustrato segn una cintica autosaturante
que se describa por la Ec. DeMichaelis-Menten.
V = Vmax. [S]
Ks + [S]

La representacin grfica de tal ecuacin tiene la forma:

La ecuacin de Michaelis-Menten se puede resolver

haciendo uso de la Linearizacin de Lineweaver-Burk, en
cuyo caso toma la forma.

Donde los parmetros anteriores se relacionan por la

ecuacin de una recta.
1

[S]
76

VVmaxKs

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales.
20 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/l. En bufer fosfato de
pH=7.4, con EDTA, 0.5 nM.
Agua destilada.
reactivo Nessler.
Bao de hielo.
Equipos y material de vidrio.
fiolas de 50 y 100 ml.
07 tubos de ensayo de 10 ml.
02 matraz de 100 ml.
pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
Equipo de bao mara.
01 espectrofotmetro Espectronic 20D+
01 termmetro de 0- 100 C
IV. PROCEDIMIENTO.
Preparacin de muestras.
Hacer los clculos y preparar la solucin patrn de
sulfato de amonio al 5x10-4 M
Hacer los clculos y preparar la solucin de urea 0.3 M
Calibracin del Espectrofotmetro.
A fin de transformar los valores de intensidad de color en
valores de concentracin del producto formado (NH3), y por
tanto de actividad de la enzima se trazar una curva de
equivalencia de Densidad ptica (Abs) vs. Concentracin.
Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de
concentracin conocida, las que se neutralizan con reactivo
Nessler, para obtener diversas intensidades de color. Por la
dificultad del uso del NH3 se usar soluciones de sulfato de
amonio.
Preparar solucin madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M

77

 Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles

de Sulfato de Amonio, calcular las nmol de NH3 que
liberan cada una y su equivalencia con nmol de rea.
Completar la siguiente tabla.

78

Tabla N 1
PATRON n

Sol. de
sulfato(ml)

Contenido
nmol de
sulfato

50

100

150

200

250

300

Contenido
nmol de
NH3

Equivalencia
en nmol de
rea

Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibracin de

la prctica anterior.
Completar la siguiente tabla.
Tabla N 2
Muestra N

Volumen
de NH3
en
sulfato tomado ( muestra
ml)
(nmol)

la Absorbancia

Blanco
1
2
3
4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuacin
que relaciona DO vs
[NH3], haciendo los tratamientos estadsticos que sean
necesarios.
Pruebas cinticas.
A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6
muestras y un blanco para completar la tabla 3 como se
muestra.
Preparar solucin madre de ureasa 6gr/l en bufer fosfato

79

Tabla N 3
Tubo

Ure
a
M
ol

Ure
a
o.3
M
ml

Bufe Incub Urea

r
ar
sa
fosfa 37C ml
to ml
3
min

Incub
ar
37C

Ba Nessl Repos
o
er
ar
hiel ml
5
15 o
min.
min

Volum
en
final
ml

Blan
co

7.0

0.5

0.5

60

0.2

6.8

0.5

0.5

120

0.4

6.6

0.5

0.5

180

0.6

6.4

0.5

0.5

240

0.8

6.2

0.5

0.5

300

1.0

6.0

0.5

0.5

360

1.2

5.8

0.5

0.5

Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que

reacciona ( de la curva de calibracin), y completar la
tabla 4
Tabla N 4
Muestra

1
2
3
4
5
6
Blanco

[urea]
en Densidad
nmol/ml x10- ptica
2
(Abs)
0.1
1.0
3.0
4.0
5.0
6.0
-

Nmol
de Nmol
de
NH3
urea
que
producidos
reaccionan

Tratamiento de datos.
Para cada muestra calcular la velocidad de reaccin
mediante la relacin v = P/t, donde (p) es nmol de NH3
producidos, y (t) es el tiempo de reaccin enzimtica ( 15
min.) y completar la siguiente tabla.

80

Ab
s
42
0
nm
.

Tabla 5
Muestra

[S] nmol/ml. 1/[S]

V(nmol/min.) 1/v

1
2
3
4
5
6
Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

Estimar el valor de Vmax.

Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una lnea recta.

Determinar grficamente los valores de Vmax. Y Ks.

Escribir la ecuacin que representa a esta reaccin

enzimtica.

81

V. OBSERVACIONES

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

82

PRACTICA 12

EXTRACCION
PRACTICA DE
12 ADN DE
HIGADO DE POLLO

EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE

POLLO

83

I.

OBJETIVO
Extraer ADN de un tejido animal

II.

MARCO TEORICO
El ADN y ARN son biomolculas que intervienen en el
almacenamiento y la transferencia de la informacin gentica.
Son componentes fundamentales de la clula y constituyen en
conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.
Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan
formando ncleo protenas, ya que suelen unirse
a
determinados tipos de estas, como las histonas.
El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el
ncleo , mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se
sita fundamentalmente en el ncleo de la clula y tambin
cloroplastos y mitocondrias en pequeas cantidades.
Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos
dirigen y llevan a cabo la sntesis de protenas, y por tanto de
las enzimas necesarias para el funcionamiento celular.
Por otra parte el ADN es el vehculo de la herencia que se
transmite de padres a hijos de generacin en generacin.

III.

FUNDAMENTO:
El ADN se puede aislar mediante una tcnica relativamente
sencilla, consiste en primer lugar en romper las membranas
celulares para liberar los ncleos, para ello se tritura el hgado
de pollo en un mortero.
Al aadir una solucin hipertnica, como el NaCl 2M, se
produce el estallido de los ncleos, el detergente forma un
complejo con las protenas y las separa del ADN, El alcohol
tiene como funcin precipitar el ADN que se va agrupando
para dar lugar a la formacin de unas fibras blancas visibles a
simple vista, que se pueden colorear mediante un colorante
selectivo para ADN como el anaranjado de acridina.

84

IV.

V.

MATERIALES

Hgado de pollo 10 gr
Cloruro de sodio 2M

Etanol 96|

SDS 20%

Arena

Varilla de vidrio

vasos de precipitados

Mortero

Embudo

Pipetas

Probetas

Gasa

METODOLOGA
1.- Triturar 10 gr de hgado de pollo, dentro de un mortero,
con la adicin de 5gr de arena lavada, para promover el
rompimiento de las membranas celulares.
2.- Aadir al triturado de hgado 50 ml de agua destilada hasta
obtener una papilla.
3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando
separar los restos de tejido que quedaron sin romper
membranas.
4.- Medir el volumen del filtrado final.
5.- Aadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo
todo a un vaso de precipitados.

85

6.- Aadir 1 ml de SDS 20%.

7.- Aadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol fro, por
las paredes, logrando se formen dos capas, en la interface
precipita el ADN.
8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la
misma direccin tratando de hilar las fibras de ADN; sobre
la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas de ADN
visibles a simple vista, que es el resultado de la agrupacin
de muchas fibras de ADN.

86

VI.

CUESTIONARIO

1. De qu est formada la cromatina?

2. Durante la extraccin del ADN Cul es la razn de triturar el
hgado?, para qu aadimos arena al triturado?
3. Por qu crees que estallan los ncleos al aadir NaCl 2M?
4. Qu accin tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extraccin del ADN se utiliza un detergente y
etanol, con que finalidad
VIII. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

IX. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

X. BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

87