PURIFICACINYCARACTERIZACINDEUNAaAMILASA

PRODUCIDAPORLACEPANATIVABacillussp. BBM1
PURIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFA a
AMYLASEPRODUCEDBY Bacillussp. BBM1
MNICAQUINTEROMORENO
GrupodeBiotecnologaMicrobiana. EstudiantedeIngenieraBiolgica, UniversidadNacionaldeColombiasedeMedelln.

OLGAINSMONTOYACAMPUZANO
GrupodeBiotecnologaMicrobiana.ProfesoraAsociada, EscueladeBiociencias,FacultaddeCiencias,UniversidadNacional
deColombiasedeMedelln.

PABLOA.GUTIRREZSNCHEZ
GrupodeBiotecnologaMicrobiana.ProfesorAsistente,EscueladeBiociencias,FacultaddeCiencias,UniversidadNacionalde
ColombiasedeMedelln. paguties@unalmed.edu.co
RecibidopararevisarOctubre27de2008,Junio2de2009,versinfinalAgosto20de2009

RESUMEN:Lacepa Bacillussp.BBM1,productorade aamilasas,fueaisladaapartirde unamuestradesuelodela

Universidad Nacional de Colombia sede Medelln. La caracterizacinmorfolgica, bioqumica y molecular indica
queestabacteriaestfilogenticamenterelacionadaconlas especiesB.subtilisoB.amyloliquefaciens.Laamilasa
producida(BBM1)fuepurificadaporprecipitacinconsulfatodeamonioysupesomolecularfueestimadoen77.6
kDaporelectroforsisSDSPAGE.Estaenzimaescompletamenteestablea60Cypresentaactividadsignificativa
entre30y80C.LaamilasaBBM1tieneunpHptimoentre5.07.0ynorequierecalcioparasufuncionamiento
estaspropiedades hacenqueesta enzima sea atractivaenaplicacionesindustriales.
PALABRASCLAVE: Bacillus,enzimas, aamilasa
ABSTRACT:Anovel aamylaseproducingstrain,Bacillussp.BBM1,wasisolatedasoilsamplefromUniversidad
Nacional de Colombia sede Medelln. Morphological, Biochemical and molecular data suggests that this strain
belongstoeitherB.subtillisorB.amyloliquefaciensspecies. aamylaseBBM1waspurifiedbyammoniumsulphate
precipitation and its molecular weight estimated as 77.7 kDa by SDSPAGE electrophoresis. This enzyme was
completelystableat60Caspresentssignificantactivityinthe3080Crange.AmylaseBBM1hasanoptimalpHin
therange5.07.0anddoesnotrequirecalcium.Allthispropertiesmakethisenzymeinterestingforfutureindustrial
applications.
KEYWORDS: Bacillus,enzymes, aamylase

Dyna,Ao77,Nro.162,pp.3138.Medelln,Juniode2010.ISSN00127353

32

1.

Morenoetal

INTRODUCCIN

Las aamilasas (EC 3.2.1.1) son enzimas que

catalizan lahidrlisis de enlaces glicosdicos a
1,4 presentes en el almidn, glicgeno y otros
polisacridos. El almidn est compuesto por
dos polmeros de glucosa: la amilosa, que
presenta nicamente enlaces a-1,4 y la
amilopectina, queadicional a los enlaces a1,4,
posee sitios de ramificacin a1,6 [1]. La
industria del almidn es una de las principales
usuarias de amilasas para la hidrlisis y
modificacindeestamateriaprimaconelfinde
obtener glucosa, maltosa y oligosacridos, que
pueden ser convertidos en jarabes de fructosa y
dextrosa.Laglucosaobtenida,tambinpuedeser
fermentada para producir etanol, aminocidos y
cidos orgnicos [2]. Sin embargo, para la
conversinenzimticadealmidonesesnecesario
utilizaramilasastermoestables,yaqueestasson
adicionadas luego de un paso de gelatinizacin
querequieretemperaturas entre70Cy110C
[3]. El paso donde se adicionan las amilasas se
conoce como liquefaccin, y su objetivo es
reducir la viscosidad de la solucin mediante la
hidrlisisparcialdelalmidn[4].Sehaestimado
que las enzimas hidrolticas del almidn
representancercadel30%del mercado mundial
de enzimas, entre las que podemos mencionar
Ultrathin
de
la
compaa
Valley
Research/Diversa, Multifect AA 21L de
Genencor y Termamyl y Liquozyme de
Novozymes [5]. Las amilasas tambin pueden
ser utilizadas como una alternativa a la adicin
de malta en la industria cervecera, en el
mejoramiento de harinas en la industria
panadera, la produccin de almidones para la
industria del papel, la remocin del almidn en
la fabricacin de textiles y como aditivos en
detergentes[6].
Las aamilasas bacterianas, y en especial
aquellas provenientes de bacterias del gnero
BacilluscomoB.subtilis,B.stearothermophilus,
B. licheniformis y B. amyloliquefaciens, han
encontrado una amplia aplicacin en procesos
industriales gracias a sus rangos de temperatura
ptima (2590 C), resistencia a pH extremos
(1.011.5) y altos niveles de expresin [3]. En
estetrabajosereportalacaracterizacin

morfolgica,bioqumicay molecularde lacepa

nativa Bacillus sp. BBM1 productora de a
amilasas termoestables, y una metodologa de
produccin y purificacin de la enzima.
Adicionalmente, se determinaron los rangos
ptimos de temperatura y pH, termoestabilidad
ydependenciadeionessobrelaactividaddeesta
nuevaamilasa.

2.

MATERIALESYMTODOS

2.1 Car acter izacin

micr oor ganismo

cultivo

del

El microorganismo se aisl a partir de una

muestradesuelo de laUniversidadNacional de
Colombia sede Medelln y se caracteriz
bioqumicamente con la prueba API 50 CH
(API, BioMerieux) [7]. La caracterizacin
molecular del Bacillus sp. BBM1 se realiz
mediante secuenciacin del gen ribosomal 16S
(16S ADNr ). La amplificacin de este gen se
llev a cabo mediante PCR, con los cebadores
pA (5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3) y
pC5B(5TACCTTGTTACGACTT3)[8].
La secuenciacin del producto de PCR fue
realizada por Macrogen Inc., Seul, Corea y
depositadaenGenBankconelcdigodeacceso
FJ411412.
La similitud con otras secuencias fue
determinada por medio de una bsqueda con el
programaBLAST[9].
El crecimiento del microorganismo se llev a
caboenmediodecultivoLB,suplementadocon
1%dealmidnsoluble e inoculadocon esporas
previamenteactivadas(1%delvolumenfinaldel
medio de cultivo), Las condiciones de
crecimiento fueron 40C y 180 rpm durante
aproximadamente 60 horas. El extracto
enzimtico se obtuvo centrifugacin por 20
minutosa7000g.

Dyna162,2010

2.2

33

Pur ificacindela aamilasa

La enzima se precipit a partir del extractro

enzimtico mediante adicin de sulfato de
amonio hasta una saturacin del 40%,
incubacinenhielopor20minutos ycolectada
por centrifugacin (20 minutos a 7000g, 4 C).
Elpellet seresuspendi enun volumen mnimo
de tampn citrato (50 mM, pH 6.0) y se pas a
travs de una columna Biogel P100
preequilibrada con la solucin de citrato. Se
tomaron fracciones de 1 ml y se seleccionaron
aquellas con actividad amiloltica. El grado de
pureza fue evaluado mediante la relacin
actividad/[Protena total] y electroforesis en
poliacrilamida 10% (SDSPAGE) [10]. La
concentracindeprotenafueestimadamediante
elmtododeBradford[11].

residual. El pH ptimo de la aamilasa fue

determinado mediante medicin de la actividad
enunrangodeacidezentre2.0y13.0utilizando
los siguientes tampones: BisTris/HCl (pH 5.5
7.0),Tris/HCl(pH7.58.5)yglicina/NaOH(pH
8.510.5).
El
efecto
de
diferentes
concentraciones decalcioyEDTAfueevaluado
en buffer citrato suplementado con NaCl (50
mM, 100mM, 200mM, 400mM y 800mM),
CaCl2 (1 mM, 10 mM y 100 mM) y EDTA (1
mM,10mMy100mM).

2.3

La cepa BBM1 es un microorganismo Gram

positivo que forma esporas subterminales
elipsoidales.Labacteriatieneforma bacilar con
dimensiones de ~1.8 mm x ~0.7 mm (Figura 1).
Las colonias son color crema, de consistencia
cremosa, con borde y superficie irregular. Al
crecer la bacteria en un medio solido con
almidon al 1% y tincin con yodo se aprecia la
presenciadehalosdedegradacincaractersticos
de la produccin de amilasas (Figura1). El
anlisis de la secuencia del gen ribosomal 16S
confirma que esta bacteria pertenece al gnero
Bacillus pero no da claridad sobre la identidad
de la bacteria a nivel de especie. Luego de una
bsqueda con el programa BLAST[9], se
obtuvieron 51 cepas deBacillus con el mximo
puntaje(2488bits),dividasas:Bacillussubtilis
(27),Bacillussp.(16),B.amyloliquefaciens(4),
Bacillus velezensis (4). Recientemente se ha
determinado que B. velezensis es un sinnimo
heterotpico de B. amyloliquefaciens [12]. Lo
queindicaquenuestroaislamientocorrespondea
B. subtilis o B. amyloliquefaciens, especies que
no pueden ser diferenciadas fcilmente por
mtodos bioqumicos, siendo necesario el
anlisis de secuencias adicionales, como la
regin ITS 16S23S, para la determinacin a
nivel
de
especie
[13].

Pr uebaenzimtica

Se tomaron 700 ml de solucin de almidn

soluble al 1% en tampn citrato (50 mM, pH
6.0), se adicionaron 100 ml de extracto
enzimtico y se incub durante 45 minutos a la
temperatura establecida. Para detener la
reaccinsetomaron40 mldelextractoanteriory
seadicionarona1mldeHCl0.1N.Alamezcla
anteriorseleagregaron40 mldeyododeGramy
se midi la absorbancia a 660 nm. Como
estandarseutilizunacurvapatrnconalmidn
solublesinenzima.Lasunidadesdeactividadse
definieroncomoelporcentajededisminucinen
la absorbancia respecto al control negativo, as:
actividad =(AC660A660)/AC660.
2.4

Car acter izacindelaenzima

La temperatura ptima de la aamilasa fue

estimada mediante la prueba del lugol en un
rango de temperaturas entre 30 C y 90 C en
tampn citrato almidn 1% a pH 6.0. La
termoestabilidad de la enzima se estim
mediante incubacin del extracto crudo en un
rango de temperaturas entre 30C y 90C por
quince minutos y medicin delaactividad

3.

RESULTADOSYDISCUSIN

3.1 Car acter izacindelacepapr oductor a

34

Morenoetal

Figur a1. Deteccindela aamilasaymicroscopaelectrnicadebarridode Bacillussp. BBM1

Figur e1. Detectionof aamylaseandscanningelectronmicrographof Bacillussp.BBM1

3.2
Pur ificacin y car acter izacin de la
enzima
Laproduccinde aamilasasporlacepaBBM1
alcanzaunmximoaproximadamentea60horas
despus de la inoculacin del medio de cultivo.
La amilasa puede ser precipitada utilizando
(NH4)2SO4 al40%.Enestepasoseobtieneuna
purificacin
significativa de la enzima,

lo cual puede evidenciarse por electroforesis

SDSPAGE (Figura 2A). A partir del gel, se
estimaque elpesode laenzima es de77.6kDa
(Figura2B).Elanlisisporelectroforesisnativa
del extracto indica que la protena posee un
punto isoelctrico inferior a 6.8, ya que esta
migra como un anin en las condiciones de
corrido(Figura2C).

Figur a2. A)ElectroforesisSDSPAGEdelprocesodepurificacindela aamilasaBBM1.1,extractolibrede

clulas2,precipitacincon(NH4)2SO4M,marcadordepesomolecular.B)Estimacindelpesomolecular.C)
zimogramadela aamilasa
Figur e2. A)SDSPAGEelectrophoresisof aamylaseBBM1.1,Cellfreeextract2,(NH4)2SO4 precipitationM,
Molecularweightmarkers. B)Molecularestimation. C) aamylasezimogram

Dyna162,2010

35

3.3 Temper atur ayter moestabilidad

La aamilasa BBM1 presenta una actividad
significativaentre30Cy80C,conunmximo
a 60C,quetambincorrespondeal mximo de
estabilidad(Figura3).Laenzimatrabajaconuna
eficienciasuperioral80%entre45Cy72Cy
su actividaddecrecerpidamenteporencimade
80C. Mediante una grfica de Arrhenius (no
mostrada), se estima que esta aamilasa tiene
una energa de activacin cataltica de 5.98
kcal/mol y una energa de activacin para la
desnaturalizacin de 22 kcal/mol. La amilasa
BBM1 es 100 % estable a una incubacin por
15 minutos entre 30C y 60C. Sin embargo, a
70Claactividadresidualdisminuyeenun85%
y se vuelve cero por encima de 80C (Figura
3B).
La mayora de aamilasas producidas por B.
amyloliquefaciens y B. subtilis presentan una
temperaturaptimacercanaalos70C[14]yen
el gnero Bacillus se han encontrado enzimas
con temperaturas ptimas superiores aisladas a
partir
de
B. licheniformis y B.
stearothermophilus [15, 16]. Pese a que la
termoestabilidad de estaamilasaes moderadasi
se comparacon laproducidaporotrosBacillus,
la temperatura ptima puede ser mejorada con
tcnicas como mutagnesis dirigida. En las
dcadas pasadas se ha adquirido una gran
cantidad deinformacinbioqumica,mutacional
y estructural que han facilitado la comprensin
de las propiedades trmicas de las aamilasas
[17]. Algunas variantes termoestables han sido
construidas mediante sustitucin en las
posiciones H133 y A209 por los aminocidos
isoleucina y valina respectivamente [18]. Otro
tipo de sustitucin estabilizante consiste en
reemplazar los aminocidos glutamina y
asparagina, ya que su deaminacin a altas
temperaturascontribuyedemaneranegativaala
termoestabilidad enzimtica [19]. Esto ha sido
demostrado con la mutacin N190F para la
amilasade B.licheniformis [20].
Elcasomssorprendentehasidoeldescritopor
Declerck et al, quienes lograron incrementar la
termoestabilidad de una alfaamilasa en 50 C
[21].

Figur a3. Temperaturaptima(arriba)y

termoestabilidaddela aamilasaBBM1(abajo)
Figur e3. Optimaltemperature (above)andthermal
stabilityof aamylaseBBM1(below)

3.4

RangodepH

La influencia del pH sobre la actividad

enzimticaseilustraenlafigura4A.Elperfilde
actividad muestra que la aamilasa BBM1
presenta actividad mxima en el rango 5.07.0.
El efecto del pH sobre la catlisis enzimtica
refleja el estado de ionizacin de algunos
aminocidos importantes para que se lleve a
cabo la reaccin cataltica. El pKa de estos
aminocidos puede ser estimado usando una
grfica de DixonWebb [22]. Para el caso de la
amilasa BBM1 la actividad est regida por
aminocidosconunpKacercanoa3.8y8.2que
puedencorresponderaaspartato(3.9)ycistena
(8.37)respectivamente(Figura4B).
ElpHptimoparalas aamilasasdeB.subtiliso
B. amyloliquefaciens es variable, pero se
encuentrageneralmenteenelrango6.07.0[19].
Existenpocosreportesde aamilasasconunpH
ptimo por debajo de 5.0. Algunos casos
excepcionalesincluyenlaalfaamilasaproducida
por Alicyclobacillus acidocaldarius con un pH
ptimo de 3.0 y la producida por Pyrococcus
furiosus activa a un pH de3.5[23,24].

36

Morenoetal

Debido a que la mayora de las amilasas

utilizadasenlasacarificacindelalmidnnoson
estables a pH cido, este proceso debe ser
ajustado a un pH cercano a 6.0 [14]. Se ha
planteado que los costos de procesamiento del
almidn pueden ser reducidos de manera
significativa si se utilizan amilasas estables a la
acidez en el paso de sacarificacin ya que esto
permitirarealizarlahidrlisisdealmidnenun
solopaso[14].Loanteriorhacequelaactividad
de la amilasa BBM1 a pH cido sea una
propiedadmuyinteresanteparasuutilizacinen
procesosindustriales.

Figur a4. EfectodelpHsobrela aamilasa BBM1

(arriba)y grficadeDixonWebb(abajo)
Figur e4. EffectofpHon aamylaseBBM1(above).
DixonWebbplot(below)

3.5

mediantelaadicindeagentesquelantestieneun
efecto negativo sobre la estabilidad y tasa
cataltica de estas enzimas [26]. Esta
dependencia al calcio es problemtica en la
industria del almidn, debido a la formacin de
oxalatodecalcio,elcualpuedebloqueartuberas
e intercambiadores de calor [14]. Adems, la
presenciadecalcionoesadmisibleenproductos
como la cerveza. La formacin de oxalatos
puedeseratenuadaconlautilizacindeenzimas
que requieran este elemento en bajas
concentraciones y mediante disminucin del pH
durante el proceso de produccin. Mediante
ingeniera de protenas ya se ha logrado la
generacindeenzimasquenorequierencalcioy
con una alta resistencia a pH cido, como
TermamylLC[27].
Unade las caractersticas ms interesantes enla
amilasaBBM1essubajadependenciadelcalcio
paraestimularsuactividad(Figura5).Solamente
aconcentraciones de200ppmselograobservar
una leve mejora de la actividad respecto al
control positivo. Eso se confirma con la
incapacidaddelEDTAdedisminuirlaactividad
cataltica. Las amilasas que no requieren calcio
son bastante raras, siendo una excepcin la
amilasa aislada a partir de Bacillus sp. KSM
K38 (Amyk38) la cual requiere iones de sodio
comosustituto[28].Sajedietal.reportaronuna
enzima con caractersticas similares a BBM1
aisladaapartirdeBacillussp.KR8104(KRA),
cuya actividad es independiente de la presencia
deionesCa2+,esactivaabajopHypresentauna
altaresistenciaalaadicindeEDTA[26].

EfectodelCalcioyEDTA

Una caracterstica de la aamilasas es el

requerimiento de iones de calcio para mantener
laintegridad estructuraly mejorarlaestabilidad
trmica [17]. La mayora de las estructuras
cristalogrficas de aamilasas demuestran que
stas contienen un sitio de unin al calcio
localizadoenlainterfaceentrelosdominiosAy
B.Sitiosdeuninalcalcioadicionales,hansido
reportados para otras amilasas de Bacillus
licheniformis, B. amyloliquefaciens y B.
stearothermophilus[25].Laremocindelcalcio

Figur a5. EfectodelcalcioyEDTAsobrela a

amilasaBBM1
Figur e5. EffectofcalciumandEDTAon aamylase
BBM1

Dyna162,2010

4.

CONCLUSIN

Bacillus sp. BBM1 produce una amilasa que es

activaenunampliorangodepHyconactividad
significativa a pH cido. Esta enzima no
requiere calcio para su funcionamiento. Estas
dos caractersticas hacen de la amilasa BBM1
una enzima con potencial aplicacin en la
industria del almidn. Por esta razn es
importante llevar a cabo estudios enzimticos
complementarios,ascomolasecuenciacin del
gen codificante para esta enzima con el fin de
entender el mecanismo deresistenciaabajopH
ysuindependenciaalcalcio.Finalmentedegran
importancia ser la identificacin a nivel de
especie de la cepa BBM1, con base en anlisis
desecuencias de otrasregiones diagnsticas del
genomabacterial.

5.

37

[3] PANDEY,A.,NIGAM,P.,SOCCOL,C.R.,
SOCCOL, V.T., SINGH, D. Y MOHAN, R.
Advances in microbial amylases, Biotechnol
ApplBiochem,31,13552,2000.
[4] VANDERVEEN, M.E.,VEELAERT,S.,
VAN DER GOOT,A.J. Y BOOM, R.M. Starch
hydrolysis under low water conditions: A
conceptualprocessdesign,JFoodEng,75,178
86,2006.
[5] TURNER,P.,MAMO,G.YKARLSSON,
E.N. Potential and utilization of thermophiles
and thermostable enzymes in biorefining,
MicrobCellFact, 6, 9. 2007.
[6] NIGAM, P. Y SINGH, D. Enzyme and
microbialsystemsinvolvedinstarchprocessing,
EnzymeMicrobTechnol,17,7708. 1995.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a los profesores Orlando Ruiz,

Mauricio A. Marn y los estudiantes de
IngenieraBiolgicaJuanEstebanRamrez,Juan
Camilo Castrilln y Andrea Pareja por su
colaboracin en diferentes etapas de este
proyecto. A Medardo Prez del Laboratorio de
Microscopa Avanzada por la imagen de
microscopa. Este proyecto se realiz con
financiacin de la Direccin de Investigaciones
de la Universidad Nacional de Colombia Sede
Medelln(DIME,proyecto 802010013).

REFERENCIAS
[1] VAN DER MAAREL, M., VAN DER
VEEN,B.,UITDEHAAG,H.,LEEMHUIS,HY
DIJKHUIZEN,L.Propertiesandapplicationsof
starch converting enzymes of the aamylase
family,J.Biotechnol.,94,13755, 2002.
[2] KIRK, O., BORCHERT, T.B. Y
FUGLSANG, C.C. Industrial Enzyme
applications, Curr Opin Biotechnol, 13, 34551,
2002.

[7] BEDOYA,G.P.Produccindeunextracto
con actividad amiloltica, a partir de una cepa
nativa de Bacillus sp. Universidad Nacional de
Colombia [Tesis de Maestra]. Medelln:
UniversidadNacionaldeColombia,2007.
[8]
DUNBAR, J., TAKALA, S., BARNS,
S.M., DAVIS, J.A Y KUSKE, C.R. Levels of
bacterial community diversity in four arid soils
compared by cultivation and 16S rRNA gene
cloning,. Appl. Environ. Microbiol, 65, 1662
69.1999.
[9] ALTSCHUL, S.F., GISH, W., MILLER,
W.,MYERS,E.W.YLIPMAN,D.J.Basiclocal
alignment search tool, J Mol Biol, 215(3), 403
10.1990.
[10] LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of
bacteriophageT4, Nature,227,6805, 1970.
[11] BRADFORD,M.M.Arapidandsensitive
method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of
proteindyebinding, Anal.Biochem., 72, 248
54,1976.

38

Morenoetal

[12] WANG, L.T., LEE, F.L., TAI, C.J. Y

KUO, H.P. Bacillus velezensis is a later
heterotypic
synonym
of
Bacillus
amyloliquefacien,. Int J Syst Evol Microbiol,
58(Pt3),6715.2008,
[13]
XU, D. Y CT, J.C. Phylogenetic
relationships between Bacillus species and
related genera inferred from comparison of 3'
end 16S rDNA and 5' end 16S23S ITS
nucleotidesequences,IntJSystEvolMicrobiol.
53(Pt3),695704, 2003.
[14] HAKI, G.D. Y RAKSHIT, S.K.
Developments in industrially important
thermostable enzymes: a review, Bioresour
Technol.,89(1),1734, 2003.
[15] VIARA, N., ELENA, P. Y ELKA, I.
Purification and characterization of a
thermostable alphaamylase from Bacillus
licheniformis,J.Biotechnol.,28,27789, 1993.
[16] JEAYOUNG,K.,TAKASHI,N.YRYU,
S. Thermostable, rawstarchdigesting amylase
form Bacillus stearothermophilus, Appl.
Environ.Microbiol,55,163839, 1989.
[17] NIELSEN, J.E. Y BORCHERT, T.V.
Protein engineering of bacterial alphaamylases,
BiochimBiophysActa,1543(2), 253274, 2000.
[18] DECLERCK,N.,JOYET,P.,TROSSET,
J.Y., GARNIER, J. Y GAILLARDIN, C.
Hyperthermostable mutants of Bacillus
licheniformis alphaamylase, multiple amino
acid replacements and molecular modeling,
ProteinEng.,8(10), 102937,1995.
[19] TOMAZIC, S.J. Y KLIBANOV, A.M.
Mechanisms of irreversible thermal inactivation
ofBacillusalphaamylases.JBiolChem,263(7),
308691,1988.
[20] DECLERCK, N., MACHIUS, M.,
WIEGAND, G., HUBER, R. Y GAILLARDIN,
C. Probing structural determinants specifying
high thermostability in Bacillus licheniformis
alphaamylase, J Mol Biol, 301(4), 104157,
2000.

[21] DECLERCK,N.,MACHIUS,M., JOYET,

P.,WIEGAND,G.,HUBER,R.YGAILLARD,
C. Hyperthermostabilization of Bacillus
licheniformis alphaamylase and modulation of
its stability over a 50 degrees C temperature
range,ProteinEng,16(4), 28793,2003.
[22] ENGEL, P.C.. Enzymology LabFax.
AcademicPress,SanDiego,1996.
[23] MATZKE, J., SCHWERMANN, B. Y
BAKKER, E.P. Acidostable and acidophilic
proteins:, the example of the alphaamylase
from Alicyclobacillus acidocaldariu,. Comp
BiochemPhysiol,118(3),4759, 1997.
[24] JORGENSEN, S., VORGIAS, C.E. Y
ANTRANIKIAN, G. Cloning, sequencing,
characterization, and expression of an
extracellular
alphaamylase
from
the
hyperthermophilicarchaeonPyrococcusfuriosus
in Escherichia coli and Bacillus subtilis, J Biol
Chem.,272(26),1633542, 1997.
[25]
DAVIES, G. Y HENRISSAT, B.
structures and mechanisms of glycosyl
hydrolases,Structure,3(9), 8539, 1995.
[26] SAJEDI,R.H.,NADERIMANESH,H.,
KHAJEH, H., AHMADVAND, R., RANJBAR,
B., SOODEH, A. Y MORADIAN, F. A Ca
independent aamylasethatisinactiveandstable
at low pH from the Bacillus sp. KR8104,
EnzymeMicrobTechnol,.36, 66671,2005.
[27] HASHIDA, M. Y BISGAARD
FRANTZEN, H. Protein engineering of new
industrial
amylases,
Trends
Glycosci.
Glycotechnol,12, 139147,2000.
[28]
TSUYOSHI, N., MASAHIRO, F.,
AKIKO, K., HIROSHI, H., KATSUYA, O.,
SUSUMU,I.YKUNIO,M. Crystalstructureof
calciumfree alphaamylase from Bacillus sp.
strain KSMK38 (AmyK38) and its sodium ion
binding sites, J Biol Chem, 278(27), 2481824.,
2003.