La fluorescencia: es una propiedad de ciertas molculas que, al ser

irradiadas con energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten

radiacin de longitud de onda caracterstica permitiendo su cuantificacin.
Las molculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y
convierten la luz absorbida de alta energa (longitud de onda ms corta) en luz de
menor energa (longitud de onda ms larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de
emision y eexcitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de
excitacin pero distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al
mismo tiempo(fluorescencia de dos colores).
Una molcula que fluoresce puede ser fijada en el
usando luz UV.

anticuerpo para ser detectada

Ejemplos de estas molculas son la Fluorescena, Rodamina, Texas Red, C y 3 y C y

5. En la seleccin de los fluorocromos, uno esta limitado por la disponibilidad del juego
de filtros del microscopio a utilizar Muchos juegos de filtros son mas compatibles con
rodamina o fluoresceina. El texas red puede ser usado tambien con un juego de filtros
para rodamina.
La inmunofluorescencia se uttiliza esencialmente en la deteccion de auto anticuerpos y
anticuerpos con antigenos de superficie de celulas y tejidos.

para ello se emplean anticuerpo frente a la proteina que se desea detectar marcados
con molculas fluorescentes. Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno
por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este
procedimiento (inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del marcaje con un
fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesariospara cada una de las
sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con
antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente antiinmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (inmunofluorescencia indirecta).

La tcnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de

clulas de sangre perifrica.Actualmente el anlisis de una suspensin de clulas
vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citmetro de flujo.
La suspensin celular se hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas
pasan por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la
dispersinde la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos
se analizan ycuantifican las poblaciones en estudio en funcin de sus propiedades
fisicoqumicas del marcaje efectuado. Para la separacin celular este aparato lleva
acoplado un sistema quecarga elctricamente las clulas y con placas deflectoras se
realiza su separacin Adems de basarse en la deteccin de la fluorescencia emitida
por las clulasmarcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las
clulas en estudio comotamao (FSC), complejidad (SSC), etc.
Microscopia de inmunofluorescencia: En 1941 Coons intent conjugar los
anticuerpos con colorantes fluorescentes y en 1942 public la primera aplicacin de
esta tcnica inmunolgica.
La microscopia de inmunofluorescencia es una tcnica in munohistoqumica que
consiste en conjugar colorantes fluorescentes (isotiocianato de fluorescena, rodamina
B de lisamina o cido 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfnico) con anticuerpos o antgenos,
exponiendo despus este conjugado a los anticuerpos o antgenos correspondientes en
cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de clulas, o cultivo de tejidos en capa
nica. Cuando la reaccin es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producir
fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia
Microscopio de inmunoflorescencia: Consta de una fuente de luz (lmpara de
mercurio o halgena) la cual debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta , el
microscopio y un sistema de filtros, el de excitacin o seleccin de luz ubicado entre la
fuente de luz y el preparado, tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con
longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado
exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. Es segundo tipo
de filtro es el de calor y est ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitacin en
los microscopios de luz transmitida y entre la fuente de luz y el espejo dicrmico en los

microscopios de luz incidente. El tercer tipo de filtro es de barrera, colocado antes del
ocular para prevenir daos retinianos que podran ser causados por rayos ultravioleta
que escapan el espejo dicrmico.

Funcionamiento: La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs

de un filtro excitador que solo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de
onda deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la
lente del objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se
excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor.
Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico
y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de
la radiacin de excitacin.
Tecnica de dignostico inmunofluorescente: en el caso de lesiones cutneas como
manifestacin de enfermedades reumatolgicas, las indicaciones ms frecuentes son
enfermedades ampollares, vasculitis y tests de banda lpica.Es importante conocer el
mejor sitio de biopsia, ya que el rendimiento ptimo de la tcnica depende de la
enfermedad en estudio.
Se reconocen los siguientes patrones de reaccin en la IF directa de piel:
Fluorescencia intraepitelial : Pnfigo vulgar, p. vegetante, p. foliceo, p. eritematoso,
p. paraneoplsico, LECSA.
Fluorescencia de membrana basal : Penfigoide buloso, p. gestacional, LE,
dermatosis IgA lineal, dermatitis herpetiforme.
Fluorescencia vascular y perivascular : Porfiria cutnea, pseudoporfiria, vasculitis
leucocitoclstica, v. Schnlein-Henoch.

En biopsia cutnea por sospecha de vasculitis, la biopsia quirrgica es ptima, ya que

permite evaluar todos los estratos de la piel, incluida hipodermis. La biopsia punch es
suficiente, pero la biopsia por shave es definitivamente insuficiente. La muestra debe
procesarse para HE convencional e IFD. Lo ideal es obtener una muestra de una lesin
temprana o reciente sin necrosis y que no incluya lcera. La dermis subyacente a la
lcera suele mostrar alteraciones en la pared de los vasos sanguneos secundarias a la
inflamacin, inespecficas, que pueden confundirse con vasculitis.
En prpura de Schnlein-Henoch, la biopsia cutnea de una lesin vascultica puede
ser de gran valor diagnstico, ya que muestra vasculitis leucocitoclstica y un patrn de
IFD vascular con depsito de IgA y c3.
En la enfermedad de Behet, los criterios diagnsticos incluyen las manifestacioens
cutneas y la prueba de patergia, ambas situaciones en las cuales el estudio
histopatolgico puede ser de gran ayuda. Las alteraciones en las aftas orales se
caracterizan por lceras con vasculitis predominantemente linfocitaria; en la prueba de
patergia, los hallazgos tpicos son una inflamacin neutroflica supurativa asptica con
componente de vasculitis linfocitario.
La suspensin celular se hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas
pasan por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la
dispersinde la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos
se analizan ycuantifican las poblaciones en estudio en funcin de sus propiedades
fisicoqumicas del marcaje efectuado. Para la separacin celular este aparato lleva
acoplado un sistema quecarga elctricamente las clulas y con placas deflectoras se
realiza su separacin Adems de basarse en la deteccin de la fluorescencia emitida
por las clulasmarcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las
clulas en estudio comotamao (FSC), complejidad (SSC), etc.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS
ventajas
- Se pueden obtener resultados rpidos.
-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos especficos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto.
-Es sensible.
DESVENTAJAS
-Costos en reactivo y equipo
-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% especficos (como toda tcnica serolgica).
APLICACIONES
Esta tcnica tiene mltiples aplicaciones en diagnstico e investigacin.
Se ha utilizado en estudios bacteriolgicos, virales, parasitolgicos. Se ha
utilizado en el estudio de la distribucin intracelular de las molculas.

INTRODUCCION

La inmunofluorescencia es una tcnica de inmunomarcacin que hace uso

de Anticuerpos unidos qumicamente a una sustancia fluorescente para
demostrar la presencia de una determinada molcula. Es una tcnica que
tiene variantes cuali y cuantitativas, por ejemplo dentro de las cuantitativas
y la inmunotincin de clulas para su observacin por microscopa
fluorescente dentro de las cualitativas.

lLa inmunoflorescencia como todo inmunoenzayo aprovecha la capacidad

que tienen los anticuerpos para unirse con alta especificidad a una
determinada molcula blanco; pero se diferencia de otras tcnicas
inmunoquimicas

CONCLUCION

La inmunofluorescencia, como tcnica de tincin, puede ser utilizada en

cortes de tejidos, lneas celulares cultivadas, clulas individuales y
secreciones que contengan clulas en suspensin (por ejemplo esputo)
con la finalidad de analizar la presencia y distribucin de proteinas y
glucidos.
Existen varios diseos de microscopios que pueden ser utilizados para el
anlisis de preparados histolgicos marcados por inmunofluorescencia.
Las tcnicas de tincin por inmunofluorescencia para la marcacin de
estructuras subcelulares se encuentra limitada a su uso en clulas fijadas
(muertas) ya que los anticuerpos no son capaces de atravesar las
membranas ntegras de las clulas vivas. Sin embargo si es posible
detectar protenas o molculas en suspensin en el sobrenadante, en la
periferia (membrana) y proximidades de una clula viva, esto posibilita
marcar clulas vivas siempre que no se requiera ver su estructura interna.
En el caso de clulas fijadas, dependiendo de la tcnica de fijado utilizada,
puede ocurrir que las protenas de inters queden unidas por enlaces
cruzados a otras protenas, lo que puede causar tanto falsos positivos,
como falsos negativos debidos a unin inespecfica.

BIBLIOGRAFIA

1- (PDF) Inmunoquimica-instituto de biotecnologia- UNAM.

2- Minmuflures:wwww.javeriana.edu.co/facultades/ciencias/libros/inmun
oflures.htm.
3- (PDF) La inmunoflorecencia en el diagnotico.
4- http://.ser.es/indexphp/Inmunoflorescencia.