COLEGIO DE BIOQUIMICOS DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

PREPARACION DE PLASMA RICO EN PLAQUETAS PARA MEDICINA REGENERATIVA:

optimizacin y cuantificacin de citoquinas y factores de crecimiento.
Paola Romina Amable, Rosana Bizon Vieira Carias, Marcus Vinicius Telles Teixeira, talo da Cruz Pacheco,
Ronaldo Jos Farias Correa do Amaral, Jos Mauro Granjeiro, and Radovan Borojevic.
Stem Cell Res Ther. 2013; 4(3): 67.

INTRODUCCION
Las principales funciones de las plaquetas son impedir la prdida de sangre aguda, la reparacin de las
paredes vasculares y de los tejidos adyacentes despus de una lesin. Durante la cicatrizacin de la herida, las
plaquetas se activan por el contacto con el colgeno, expuesto a la corriente sangunea despus de la lesin
endotelial. Las plaquetas secretan mediadores y citoquinas intracelulares almacenados en el citoplasma y
liberan su contenido de los grnulos- despus de la agregacin. Esta secrecin es intensa en la primera hora
y las plaquetas continan sintetizando ms citoquinas y factores de crecimiento de sus reservas de ARNm por
un mnimo de 7 das [1]. Ms de 800 protenas diferentes se secretan en los medios circundantes [1,2], que
tiene un efecto paracrino en diferentes tipos de clulas: los miocitos [3], las clulas del tendn [3-7], las
clulas madre mesenquimales de diferentes orgenes [8-11], condrocitos [12-14], osteoblastos [ 3,15,16], los
fibroblastos [17-19] y las clulas endoteliales [20]. Se estimula la proliferacin celular, la angiognesis y la
migracin de las clulas, lo que resulta en la regeneracin de tejidos. Tambin hay informes que confirman
que las plaquetas secretan pptidos antimicrobianos, lo que sugiere un efecto antibitico [21].
Se demostraron otras propiedades de las plaquetas relacionadas con sus efectos antiinflamatorios y
analgsicos [22-24]. Un ensayo clnico mostr que los concentrados de plaquetas tenan un efecto analgsico
[25] y Asfaha con sus colaboradores mostraron efectos analgsicos mediados por receptores activados por
proteasas 4 (PAR4) in vitro [26]. El Dr. Sharkawy y colegas estudiaron las secreciones de plaquetas y su efecto

en cultivos de macrfagos, concluyendo que los concentrados de plaquetas funcionaban como un agente
antinflamatorio, debido a las altas concentraciones de RANTES (Regulated on Activation, Normal T Cell
Expressed and Secreted) y Lipoxina A 4 (LXA4) [27].
Los productos derivados de plaquetas incluyen el plasma rico en plaquetas (PRP), que se puede utilizar con o
sin activacin de las plaquetas. Estas preparaciones se han utilizado desde la dcada de 1970 y han sido cada
vez ms populares desde la dcada de 1990 [28]. Desde entonces, han surgido diferentes maneras de
preparacin de PRP: el convencional de centrifugacin de la sangre con tubos de sistemas comerciales;
activado mediante la adicin de colgeno, calcio y / o trombina, por el contacto de vidrio o mediante ciclos de
congelacin; se aplica como suspensin de plaquetas o como un gel, y la metodologa se sigue ampliando [2931].
La aplicacin de PRP en diferentes tejidos ha dado resultados prometedores en diferentes patologas tales
como lesiones agudas y crnicas de hueso y cartlago. El Dr. Kon y colegas informaron de la observacin de
91 pacientes (115 rodillas) tratados con PRP, que el tratamiento PRP es seguro, reduce el dolor y mejora la
funcin de la rodilla a los 12 meses , especialmente en pacientes ms jvenes [32]. Este mtodo fue superior a
la viscosuplementacin con cido hialurnico [32]. El anlisis posterior a los 24 meses, sin embargo, mostr
una prdida progresiva de la mejora y planteaba la cuestin de las posibles terapias repetidas [33]. En este
ejemplo se observa la necesidad de estudios adicionales, incluso en serie, con un gran nmero de pacientes y
con controles. La opinin general en los ltimos comentarios es que la mayora de los ensayos clnicos
presentados no tienen el poder estadstico suficiente para arrojar resultados concluyentes. En vista de
mltiples aplicaciones potenciales PRP en ortopedia, medicina deportiva y ciruga reparadora, seran tiles los
anlisis comparativos de diferentes escenarios clnicos. Estas comparaciones no son viables, principalmente
porque PRP es un producto biolgico, preparado utilizando diferentes protocolos, a veces incluso sin controlar
si las plaquetas se concentraron y se purificaron efectivamente o si se ha producido una activacin temprana,
descartando todos los factores de crecimiento secretados dentro del plasma pobre en plaquetas (PPP). Otra
cuestin que ni siquiera se menciona en los informes clnicos es si existe una correlacin entre la
concentracin de plaquetas o el volumen de PRP aplicado por rea lesionada. Los estudios ya han demostrado
que la baja concentracin de plaquetas es ineficiente y que las concentraciones altas tienen un efecto
inhibidor sobre el crecimiento celular, pero los resultados son todava contradictorios [34-36]. Aunque todava
no profundamente caracterizado, el contenido de leucocitos tambin ha demostrado ser un factor
importante, en el aumento de la inflamacin y la reduccin de la regeneracin de tejidos en tendinopatas
[37]. Los procedimientos de preparacin tambin son pertinentes, tal como se muestra en estudios del
potencial condro-inductivo y osteo-inductivo de PRP, que se inform que se pierde por la activacin de la
trombina [38] y es retenido despus de la activacin por procesos de congelacin-descongelacin [39]. Siguen
sin definirse nomenclaturas consensuadas, protocolos estandarizados para producir PRP, as como una
caracterizacin completa del producto final que podra mejorar la comparabilidad de los estudios [40,41].
Las combinaciones de PRP y clulas madre mesenquimales han sido ampliamente estudiadas in vitro [8-11].
Todos los autores concluyeron que el PRP aument la proliferacin celular, pero se encontraron divergencias
con respecto a la capacidad de diferenciacin de clulas madre, algunos se indicaron al PRP como
favorecedor de la diferenciacin osteognica [9] y otros que demostraron un compromiso condrognico
[10,12]. Estas variaciones pueden deberse a diferentes preparaciones de PRP, incluyendo o no la fraccin de

leucocitos, que puede modificar su contenido de factor de crecimiento. En ambos casos, el PRP pareca ser un
aditivo prometedor para el trasplante de clulas madre con aplicaciones ortopdicas, al aumentar el
nmero de clulas madre trasplantadas y guiar su diferenciacin a un tipo celular definido.
El presente estudio propone el establecimiento de un mtodo optimizado y reproducible para la preparacin
de PRP y caracterizar el contenido en factores de crecimiento y citoquinas de las fracciones obtenidas antes y
despus de la activacin plaquetaria. Nuestro objetivo final es desarrollar y caracterizar una preparacin de
PRP con fines teraputicos, centrndose en la alta produccin de plaquetas, la pureza y la recuperacin sin la
introduccin del factor de crecimiento a lo largo de la manipulacin de la muestra.

MATERIALES Y METODOS
Declaracin de tica
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comit de tica en Investigacin del
Hospital Pro-Cardaco, Rio de Janeiro (CAAE: 04691712.3.0000.5533) y todos los donantes firmaron un
consentimiento informado.

Recoleccin de sangre y preparacin de plasma rico en plaquetas

La sangre perifrica de 22 donantes voluntarios sanos de ambos sexos (de 20 a 54 aos de edad) fue recogida
en tubos que contenan 0,5 ml de solucin de citrato (Vacutainer , Ref: 369714, BD Biosciences). El
procedimiento de preparacin del PRP consisti en dos pasos de centrifugacin. Todas las etapas se llevaron a
cabo en una centrfuga refrigerada (certificada Jouan Br4i, Saint-Herblain, Loire-Atlantique, Francia). Se
estudiaron las variaciones en la fuerza centrfuga relativa (FCR), la temperatura, y el tiempo para la
optimizacin de las condiciones para el aislamiento de plaquetas. Despus de la primera centrifugacin, se
recogi todo el plasma por encima de la capa leucocitaria, para la separacin de las plaquetas de las clulas
rojas de la sangre y leucocitos (PRP1). Para la optimizacin de la segunda etapa de centrifugacin, se
estudiaron slo el FCR y tiempo. El PRP1 de donantes individuales se dividi en fracciones de 1 ml y despus
de la segunda etapa de la centrifugacin el sedimento de plaquetas se suspendi en 300 microlitros de
plasma pobre en plaquetas (PPP; nueva fraccin llamado PRP2). El PRP2 se activ usando 20 mM de CaCl2
(PRP2-Ca) o 20 mM de CaCl2, ms 25 UI / ml de trombina de plasma humano (PRP2-Thr, Ref.: T6884, SigmaAldrich, St Louis, Missouri, EE.UU.). Todas las muestras se incubaron a 37 C durante 1 hora y a 4 C durante
16 horas. Para la recuperacin de la PRP2 activado, todas las muestras tratadas se centrifugaron a 3000 x g
durante 20 minutos a 18 C. El sobrenadante (activado PRP2) se recogi mediante aspiracin. Los cogulos se
trataron con HCl 200 mM durante 10 minutos y se neutralizaron con NaOH 240 mM ( lavado del cogulo).
Todas las muestras se almacenaron a -80 C.

Anlisis hematolgico
El recuento total de clulas de la sangre se determin en sangre entera, fraccin PRP1, fraccin PRP2 y
fraccin PPP. Los recuentos de plaquetas se realizaron con un hemocitmetro utilizando un fluido REESECKER modificado por Wintrobe y otros tipos de clulas de la sangre se analizaron usando un analizador
hematolgico XE-2100 (Sysmex, Kobe, Hyogo, Japn).

Cuantificacin de citoquinas
Se analizaron muestras de sangre perifrica, PRP1, PRP2, PPP, PRP2 activado y del lavado del cogulo. Las
citoquinas proinflamatorias, factor estimulante de crecimiento de colonias granulocitarias-macrfagos (GMCSF), interleuquina (IL): IL-1, IL-6, IL-8, factor de necrosis tumoral (TNF) , el interfern gamma (IFN) , IL-2, IL2R, IL-7, IL-12p40/p70, IL-15, IL-17, citoquinas antiinflamatorias (IL-1RA, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IFN alfa),
quimiocinas (eotaxina, protena 10 (IP-10), protena-1 (MCP-1), monoquinas inducidas por IFN- , protena
inflamatoria de macrfagos (MIP)-1, MIP-1, RANTES, quimioatrayente de monocitos y los factores de
crecimiento : factor de crecimiento endotelial (EGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de
crecimiento de fibroblastos bsico (bFGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante (TGF)-1, TGF-2, , factor de TGF3 crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA, PDGF-AB, PDGF-BB , el factor de crecimiento similar a la
insulina 1 (IGF-1)). Fueron utilizados equipos comerciales de ELISA y Luminex: Quantikine hPDGF-AB ELISA (R
& D, Minneapolis, Minnesota, EE.UU.), citoquinas Humanos Ensayo 30-plex (Invitrogen, Carlsbad, California,
EE.UU.), Fluorokine MAP Kit Multiplex TGF- (I + D, Minneapolis , Minnesota, EE.UU.), Fluorokine Kit Humanos
angiognesis Multi analito Profiling (I + D, Minneapolis, Minnesota, EE.UU.) y MILLIPLEX MAP Humanos IGF-1
Single Plex Kit (Millipore, Billerica, Massachusetts, EE.UU.). Los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las
instrucciones del fabricante.

Anlisis estadstico
Los resultados se expresan como media desviacin estndar para al menos tres repeticiones. La significacin
estadstica se evalu mediante el anlisis unidireccional no paramtrico de varianza seguido por la prueba de
Tukey post-hoc (para comparar todos los pares en el grupo) o la prueba de comparacin mltiple de Dunnett
(para comparar cada condicin con los datos de control, pero no uno con el otro). Un valor de P < 0,05 fue
considerado estadsticamente significativo. El anlisis estadstico se realiz utilizando el software Prism 5.00
(GraphPad Software Inc, San Diego, California, EE.UU.).

RESULTADOS Y DISCUSIN
Optimizacin del mtodo para la preparacin del plasma rico en plaquetas
Despus de los primeros anlisis de los resultados experimentales, se decidi optimizar el procesamiento de
la sangre en dos etapas de centrifugacin, que se describen de la siguiente manera. El objetivo de la primera
etapa era para agotar el producto de glbulos rojos y blancos con una mnima prdida de las plaquetas, y el
objetivo del segundo paso fue obtener la ms alta recuperacin y el mejor rendimiento de las plaquetas en
el volumen final de plasma ms pequeo.

Primera etapa de centrifugacin

Sangre recin recogida se centrifug como se describe en Materiales y Mtodos, produciendo tres fracciones:
una capa inferior densa que contiene clulas rojas de la sangre que ocupa aproximadamente la mitad del
volumen total de sangre, una capa blanca delgada intermedia que contiene los leucocitos (capa leucocitaria) y
arriba, una fraccin amarilla que contiene las plaquetas (PRP1).
La RCF, tiempo y temperatura se consideraron variables a optimizar, ya que potencialmente podran influir en
el rendimiento final de plaquetas y su pureza. Estas tres variables estn muy correlacionadas, por lo que de la
variacin de los parmetros de a uno, no sera adecuado para encontrar las mejores condiciones, ya que, por
ejemplo, un aumento de la temperatura sera reducir la densidad del plasma y por lo tanto el comportamiento
de clulas de la sangre sera diferente bajo las mismas condiciones de centrifugacin , los tiempos de
centrifugacin ms largos seran mejor combinarlo con poca RCF, por lo que las plaquetas siguen aisladas en
la fraccin superior. Realizamos 17 experimentos, con 15 condiciones diferentes; una condicin se repiti tres
veces para la estimacin de error. Los resultados se presentan en la Tabla 1. Hemos observado que el aumento
de la RCF de 200 a 360 g era perjudicial para el rendimiento y la recuperacin. Se observ el mismo efecto
negativo al aumentar el tiempo de centrifugacin. Al analizar la influencia de temperatura, no se detect
ningn efecto cuando los tiempos de centrifugacin eran cortos, pero cuando la etapa de centrifugacin dur
16 minutos, la temperatura tuvo un efecto positivo en el aumento de la produccin de plaquetas. En base a
estos anlisis, hemos elegido cinco condiciones (carreras 5, 8, 11, 13 y 15) que se repite en diferentes muestras
de sangre. Se confirm el rendimiento y la recuperacin de las plaquetas, que muestra la reproducibilidad
entre das y entre los diferentes donantes (Figura 1). La recuperacin de plaquetas y el rendimiento fueron
estadsticamente menor para la condicin 2 (360 g, 16 minutos, 16 C), llevado a cabo a la ms alta RCF. El
mejor rendimiento se obtuvo utilizando los parmetros de la condicin 3 (300 g, 5 minutos, 12 C), el que
tiene el tiempo de centrifugacin ms bajo. Dado que una diferencia significativa no se observ con la
condicin 1 (240 x g, 8 minutos, 16 C), elegimos la condicin 3 como un primer paso para una mayor
optimizacin de la segunda etapa, debido a su tiempo ms corto.

Segunda etapa de centrifugacin

En la optimizacin de la segunda etapa de centrifugacin, la temperatura se fij en 12 C, ya que los anlisis de
la primera etapa indicaron que no afect significativamente la recuperacin de plaquetas y el rendimiento. La
Tabla 3 muestra los resultados para las diferentes condiciones estudiadas, donde se determinaron la
produccin de plaquetas en PRP, PRP2, la recuperacin de plaquetas parcial en el PRP2 y el PPP. En algunas
condiciones de centrifugacin, la recuperacin total de las plaquetas (PRP2 ms los valores de recuperacin
PPP) no alcanz el 100%, posiblemente debido a la agregacin de plaquetas. Prdidas importantes se
observaron con baja RCF y el mejor rendimiento se obtuvo con alta RCF y largos tiempos de centrifugacin.
Condicin 4 (700 x g, 17 minutos), la condicin 5 (450 x g, 12 minutos) y la condicin 9 (800 x g, 12 minutos),
donde confirm adems con el uso de diferentes muestras de sangre (n = 3). A pesar de que la recuperacin
de las plaquetas no fue estadsticamente diferente de las otras dos condiciones (P = 0,3222), fue elegida la
condicin 4 (700 x g, 17 minutos) ya que permiti una prdida de plaquetas inferior en la fraccin PPP (Figura
2A) y produjo un sedimento que fue fcilmente resuspendible. Para las tres condiciones, se cuantificaron
eritrocitos y leucocitos en ambas muestras, PRP2 y PPP. La fraccin PPP estaba libre de eritrocitos y leucocitos.
Todas las clulas contaminantes restantes se centrifugaron junto con las plaquetas; menos del 0,3% de los
glbulos rojos y blancos iniciales se mantuvo en PRP2, definiendo nuestra preparacin como un plasma pobre
en leucocitos.

Efecto de la temperatura sobre la preparacin del plasma rico en plaquetas.

Teniendo en cuenta que la temperatura no afect el aislamiento de plaquetas durante la primera etapa, todo
el procedimiento se ensay a 12 C y a 18 C (temperatura ambiente). Los resultados se muestran en la Tabla
4 y tambin en la Figura 2. No se observaron diferencias significativas entre ambas temperaturas.

Reproducibilidad del mtodo

Hemos probado el mismo procedimiento para los distintos pacientes y en das diferentes. Los resultados se
muestran en la Figura 3. Para algunos pacientes (por ejemplo, pacientes 1, 5 y 7) la reproducibilidad era alta,
mostrando que casi no hay diferencia entre los dos das.
Intervalo de confianza
Considerando 18 muestras diferentes y = 0,05, nuestro mtodo de preparacin de PRP recin optimizado
permiti obtener una recuperacin final de plaquetas de 46,9 a 69,5%, y el coeficiente de concentracin
entre 5.4 y 7.3, con una concentracin de plaquetas final de 1,4 x 106 a 1,9 x 106 plaquetas / L.
Comentarios
En conclusin, el presente estudio desarroll y caracteriz el mtodo de dos pasos para obtener PRP, la
maximizacin de la pureza de las plaquetas, la recuperacin y el rendimiento:

1) Las muestras de sangre se recogieron en tubos de 5 ml que contienen 3,2% de citrato de sodio; una muestra
de 100 l se separ para determinar la concentracin inicial de clulas sanguneas.
2) Toda la sangre se centrifug a 300 g durante 5 minutos a 18 C.
3) La fraccin superior (PRP1) se separ sin perturbar la capa leucocitaria, y se transfiri a un tubo estril; el
volumen PRP1 se cuantific y una muestra de 100 l se separ para determinar la concentracin de las
plaquetas y la pureza.
4) PRP1 se centrifug a 700 g durante 17 minutos a 18 C.
5) PPP se transfiri a un tubo estril y se cuantificaron la concentracin de plaquetas y la pureza.
6) El sedimento de plaquetas obtenido a partir de 1 ml de PRP1 se resuspendi en 300 l de PPP (PRP2).
7) La activacin plaquetaria se realiz inmediatamente mediante la adicin de 20 mM de CaCl2 y 25 UI / ml de
trombina humana o CaCl2 solo, incubando a 37 C durante 1 hora y a 4 C durante 16 horas.
8) El plasma activado PRP2 se recuper por centrifugacin a 3000 g durante 20 minutos a 18 C.
Decidimos recoger la sangre en tubos de vidrio con citrato. Aunque Araki y sus colegas recomiendan el uso de
EDTA para maximizar la recuperacin de plaquetas [42], el uso de EDTA result en plaquetas daadas de
acuerdo con Landersberg y colegas [43]. Anitua propuso en 1999 un mtodo simple para la obtencin de PRP
que se ha utilizado con frecuencia en estudios posteriores y en la aplicacin clnica [44]. Se recogi una
fraccin de 0,5 ml de plasma situada justo encima de la capa leucocitaria separ despus de un solo ciclo de
centrifugacin (460 g, 8 minutos). La fraccin superior se considera PPP, ya que el autor argument que la
densidad de plaquetas fue aumentando gradualmente desde la parte superior de la capa leucocitaria. Por el
contrario, no hemos encontrado ningn gradiente de plaquetas en cualquiera de las fracciones PRP1 (datos no
presentados), y hemos decidido recuperar todo el volumen de PRP1 para la prxima etapa de centrifugacin.
El segundo paso de centrifugacin de alta velocidad de plaquetas concentradas por una dcima parte del
volumen de sangre inicial, dejando una fraccin PPP con <1% de prdida de plaquetas. Concentramos
plaquetas, alcanzando una lnea de base de 1 milln de plaquetas / l, finalmente, la recuperacin de al menos
el 50% de la cantidad inicial de plaquetas. Estos parmetros son ms altos que los reportados para los equipos
comerciales PRP: Sundman y sus colegas informaron de un aumento de 1,99 veces en la concentracin de
plaquetas utilizando un equipo ACP Arthrex, minimizando el contenido de leucocitos (0,13 veces), los mismos
autores reportaron un 4,69 veces y 4,26 veces mayor en la concentracin de plaquetas y leucocitos,
respectivamente, utilizando un kit de Biomet GPS III [45]. El Dr. Mazzucco y colegas compararon cuatro
protocolos diferentes: tres equipos comercialmente disponibles (Fibrinet, RegenPRP-Kit y Plateltex) y un
procedimiento de fabricacin casera, la obtencin de un aumento de 1,6 veces a 4,4 veces en la concentracin
plaquetaria [29]. El Dr. Le y colegas compararon equipos Curasan PRP, Plateltex, GPS II, RegenLab y un
protocolo casero [30]. Obtuvieron un rendimiento de 2,75 veces, 3,43 veces, 1,89 veces, 1,55 veces y 1,77
veces en la concentracin de plaquetas y una recuperacin de plaquetas de 32,0%, 20,0%, 22,6%, 79,0% y
45,6%, respectivamente. Castillo y colaboradores compararon equipos Biomet GPS III, MTF Cascade y
sistemas Magellan Arteriocyte y mostraron que la recuperacin de plaquetas fue del 22,6%, 67,6% y 65,5%,

con un amento de 2,07 veces, 1,62 veces y 2,80 veces en la concentracin de plaquetas, respectivamente
[31]. Se obtuvo una alta recuperacin de las plaquetas y un aumento de 6,4 veces en la concentracin de
plaquetas, lo que hace un mejor uso de la sangre del donante y requieren un volumen ms pequeo para
obtener la misma cantidad de plaquetas. Nuestra preparacin de PRP es altamente purificada y casi no
contiene otros tipos de clulas derivadas de la sangre distintos de las plaquetas. Los leucocitos se deben
evitar en la preparacin de PRP debido a su potencial efecto proinflamatorio [23, 37, 45]. Sundman y colegas
recientemente llegaron a la conclusin con estudios in vitro, que los leucocitos aumentaron el perfil
catablico del PRP, ya que la concentracin de citoquinas catablicas (metaloproteinasa de matriz-9 e IL-1)
se correlacionaron positivamente con la concentracin de leucocitos, pero no hay correlacin entre el
contenido de leucocitos y los efectos clnicos in vivo que sea de nuestro conocimiento [45].

Factores de crecimiento y cuantificacin del contenido de citoquinas

Un total de 37 factores de crecimiento y citoquinas se cuantificaron en diferentes fracciones obtenidas
durante la preparacin del PRP: muestra inicial de sangre, PRP1, PRP2, activados por calcio de PRP2 (PRP2Ca), calcio ms PRP2 con trombina-activada (PRP2-Thr), PPP, y el lavado del cogulo. Slo 12 factores y
citoquinas se secretan a partir de plaquetas activadas, lo que se define por diferencia estadstica: PDGF-AA,
PDGF-AB, PDGF-BB, TGF-1, TGF-2, el EGF, IL-4, IL-8, IL-13, IL-17, IFN y TNF (Tabla 5). El TGF-3 y el IFN no
se detectaron en ninguna de las fracciones analizadas.

Los factores de crecimiento

La Figura 4 muestra las concentraciones de factores de crecimiento secretados durante la activacin de las
plaquetas (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, TGF-1, TGF-2 y EGF). El PDGF-AB y PDGF-BB mostraron cantidades
significativamente diferentes no slo en fracciones activados de PRP2, sino tambin en los cogulos de
lavados. El TGF-1 y TGF-2 se mostraron en cantidades significativamente altas en PRP2-Ca, pero no en
PRP2-Thr. El contenido en el cogulo de TGF fue el ms alto en comparacin con otros factores de crecimiento.
No tenemos ninguna informacin sobre el estado de activacin de las dos isoformas de TGF-, porque solo se
detect el TGF total.
Para comparar la secrecin del factor de crecimiento con otras publicaciones, se calcul la cantidad de
citoquinas secretadas por las plaquetas, ya que los diferentes protocolos descritos resultaron en diferentes
concentraciones de plaquetas. Po lo tanto expresado en 106 plaquetas, PRP2-Ca contena 7,9 5,6 pg PDGFAA, 37,6 14,9 pg PDGF-AB, 20,1 10,0 pg PDGF-BB, 318,6 118,4 pg de TGF-1, 965,2 389,5 fg TGF-2 y
438.5 195,3 fg EGF.
De acuerdo con nuestros criterios, los factores de crecimiento que ya estn presentes en el plasma son IGF-1,
con una concentracin de 105,30 48,44 ng / ml (p = 0,9734), y el factor de crecimiento de hepatocitos, cuyo
nivel fue 61,20 39,71 pg / ml (p = 0,1455). La concentracin plasmtica no dio una diferencia significativa con

PRP2-concentraciones de Ca y PRP2-Thr, pero alcanz valores de 2,6 veces y 2,5 veces ms altos que el nivel
plasmtico, respectivamente, y consideramos los valores indicativos de la secrecin.
Informes sobre las citoquinas en PRP se centran principalmente en los factores de crecimiento TGF, PDGF,
VEGF, EGF, bFGF, HGF e IGF-1, y dispone de datos cuantitativos relevantes de PDGF, TGF y EGF. Mazzocca y
colaboradores informaron que se secreta de 1498,1 a 3,020.7 fg EGF por 106 plaquetas, un valor ms alto que
lo que encontramos [46]. En comparacin con nuestros resultados, el mismo grupo inform de una
concentracin de PDGF-AB similares (27,4-48,8 pg/106 plaquetas) y una secrecin de TGF-1 ligeramente
inferior (161,7-185,4 pg/106 plaquetas) [46]. Otros autores informaron valores similares para el TGF-1: 120
pg/106 plaquetas [47], 240 pg/106 plaquetas [48] y 55,4 a 126,7 pg/106 plaquetas [45]. Castilho y sus colegas
informaron valores similares a los nuestros con respecto a PDGF-AB (21,9-44,1 pg/106 plaquetas) y PDGF-BB
(33,3-42,3 pg/106 plaquetas) [31]. Las diferencias informadas refuerzan la necesidad de normalizacin de los
mtodos, con el fin de hacer factible los anlisis clnicos comparativos.
En nuestro estudio, el VEGF se detect en muestras PRP2-Ca de slo dos de los seis donantes (1,93 y 1,06 pg /
ml), siendo en todas las otras muestras, ms bajo que el lmite de cuantificacin del ensayo utilizado (1 pg /
ml). Segn el fabricante, las isoformas de VEGF-121 y VEGF-165 se pueden detectar con el ensayo. Esto est
en contraste con la mayora de la literatura sobre VEGF y PRP, en el que el VEGF se considera uno de los
principales factores: las concentraciones en sangre informadas por Eppley y colegas fueron de 155 110 ng /
ml [49] y de 50 10 pg / ml por el Dr. Sharkawy y colegas [27] y la activacin del PRP resultaron en un
aumento de 6,2 veces y 4,4 veces en la concentracin de VEGF, respectivamente.
Activamos PRP usando solamente cloruro de calcio (20 mM), y cloruro de calcio y trombina humana (25 UI /
ml). Se encontraron diferencias estadsticamente significativas para PRP2-Ca, pero no para PRP2-Thr slo para
TGF-1, TGF-2 e IFN. Incluso cuando las diferencias no eran grandes entre las dos fracciones activadas,
estos resultados sugieren una mejor secrecin del contenido de los grnulos cuando las plaquetas se
activaron utilizando solo calcio.

Citoquinas antiinflamatorias
La IL-1RA, IL-5 e IL-10 no mostraron ninguna diferencia significativa entre PRP2 activado y la concentracin
plasmtica (p = 0,6837, 0,1483 y 0,5361, respectivamente). A juzgar por el anlisis estadstico, la IL-4 es un
factor intraplaquetario; la concentracin en el plasma (52,86 1,63 pg / ml) y preparaciones de PRP activado
(55,53 1,01 pg / ml para PRP2-Ca y 55,04 1,30 pg / ml PRP2-Thr) fueron similares, pero la desviacin
estndar era pequea, por lo que las diferencias fueron estadsticamente significativas (P = 0,0079). La IFN
plasmtica (98,50 13,79 pg / ml) aument en 22,09% y 13,26% en PRP2-Ca y PRP2-Thr, respectivamente (P =
0,0305).La IL-13 era dos veces ms concentrada en ambos preparaciones activadas PRP2 en comparacin con
la concentracin plasmtica (28,91 31,67 pg / ml), pero estas diferencias se deben considerar solamente
indicativas, puesto que no fueron significativas (P = 0,0618 y 0,0509 para PRP2-Ca y PRP2-Thr,
respectivamente). Concentraciones de IFN, IL-4 y IL-13 se muestran en la Figura 5. Cuando PRP2 se activa
slo con cloruro de calcio se obtuvieron 34,9 23,8 fg/106 plaquetas para IFN, 30,3 28,0 fg/106 plaquetas
para IL-4 y 25,2 30,4 fg/106 plaquetas para IL-13.

Las citoquinas proinflamatorias

IL-17, TNF e IL-8 fueron las nicas citoquinas proinflamatorias que mostraron un aumento significativo a
partir del plasma al PRP2 activado (P = 0,0206, 0,0008 y <0,0001, respectivamente). La IL-1 aument su
concentracin de 3,6 veces en PRP1 y 9,5 veces en PPP en comparacin con la concentracin plasmtica (0,17
0,27 pg / ml), pero las diferencias se debe considerar indicativas ya que no fueron estadsticamente
significativas (P = 0,7543). Se obtuvieron los mismos resultados para el factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrfagos (P = 0,8456), con aumentos ms pequeas (aumento de 1,5 veces y 2,5 veces en
PRP1 y PPP, respectivamente; concentracin plasmtica: 5,48 8,49 pg / ml). En el caso de IL-7, no hubo
diferencias significativas entre las plasmtica (10,60 25,96 pg / ml) y PRP2 activado (P = 0,3592). La figura 6
muestra las concentraciones de citoquinas proinflamatorias para esos factores secretados durante la
activacin de plaquetas. Al calcular el contenido de plaquetas teniendo en cuenta la cantidad de citoquina
secretada durante la activacin de calcio, se obtuvo 98,5 10,4 fg/106 plaquetas para IL-8, 32.6 24.2 fg/106
plaquetas para IL-17, y 3,1 2,4 fg/106 plaquetas para TNF.

Mientras que el contenido de factores de crecimiento no fue mayor en el PPP, las citoquinas antiinflamatorias
IL-4 e IFN mostraron un aumento, pero no de IL-13 en PPA. Las citoquinas proinflamatorias IL-17 y TNF, se
incrementaron en PPA, pero no la de IL-8 despus de la segunda centrifugacin. La manipulacin de las
plaquetas in vitro, as como el estrs en la circulacin en el vaso sanguneo, provoca la secrecin de
mediadores citoplasmticos presentes en las plaquetas al entorno pericelular, independientemente de su
degranulacin. Entendemos que este es el origen de los cuatro citoquinas en el PPP. Revisiones recientes
discuten la existencia de diferentes grnulos [50-52]. Blair y Flaumenhaft revisaron la incorporacin de
protenas plasmticas en el citoplasma de la clula y despus en los grnulos , lo que significa que la rotura
de membranas de plaquetas puede liberar factores acumulados en el citoplasma que tambin se concentran
en los grnulos [50]. Ma y otros, informaron de que los diferentes receptores de superficie de las plaquetas
desempean un papel en la regulacin de la angiognesis, con la activacin mediada por PAR1 permitiendo la
agregacin de plaquetas y la secrecin de VEGF, mientras que la supresin de la liberacin de endostatina, y
con la activacin mediada por PAR4 tambin permite la agregacin de plaquetas pero suprime el VEGF y la
secrecin de endostatina [53]. Blanco y Rompietti sugirieron que esta teora de segregacin de factores en
diferentes tipos de grnulos, tiene ms sentido que la secrecin simultnea de factores pro-angiognicos y
anti-angiognicos que conduciran a la neutralizacin de los efectos de las protenas secretadas [52].

Las quimiocinas
Se encontr que ninguna de las quimiocinas analizadas ha aumentado su contenido durante la activacin de
las plaquetas a un nivel estadsticamente significativo, pero MIP-1 mostr un aumento de la concentracin
plasmtica (38,01 34,23 pg / ml) en comparacin con PRP2-Ca (118,39 82,39 pg / ml) y PRP2-Thr (96,76
49,60 pg / ml) - que consideran estos valores indicativos de un aumento, por lo que deberan ser estudiados

ms a fondo. La Eotaxina y MCP-1 mostraron concentraciones significativamente reducida en fracciones PRP

activado, la concentracin de eotaxina se redujo de una concentracin plasmtica de 50,62 16,95 pg / ml a
23,75 8,52 pg / ml en PRP2-Ca y 22,19 4,76 pg / ml en PRP2-Thr y el MCP-1 de concentracin de 245,59
187,52 pg / ml a 69,41 43,27 pg / ml en PRP2-Ca y 78,97 22,20 pg / ml en PRP2-Thr. La reduccin puede ser
causada por la degradacin de las quimiocinas por los productos secretados tras la degranulacin, o su
asociacin con molculas secretadas, y estas cuestiones tambin deben ser estudiadas ms a fondo.
Slo se encontr una publicacin para RANTES, reportando una concentracin plasmtica de 100 20 ng / ml
y una concentracin de 300 100 ng / ml en PRP activado [27]. Nuestra investigacin dio lugar a
concentraciones plasmticas de RANTES 2,76 1,97 ng / ml.
A juzgar por la composicin PRP que se describe aqu, nuestros resultados apoyan el uso de PRP en la curacin
de heridas y la regeneracin de tejidos, ya que altas concentraciones de PDGF y TGF se secretan a partir de
grnulos - de plaquetas despus de la activacin. Tambin se puso de manifiesto que los factores de
crecimiento son altamente retenidos dentro del cogulo, es as, como ya han demostrado otros autores,
seran liberados lentamente en vivo [54,55]. Estos factores de crecimiento tambin se describieron como
mitognicos y atrayente para las clulas madre mesenquimales, que pueden seguir secretando factores de
crecimiento y pueden mediar efectos regeneradores durante perodos ms largos de tiempo [56]. Nuestra
preparacin de PRP ahora debe ser probada in vitro en cultivos de clulas con el fin de revelar sus efectos
moleculares en diferentes tipos de clulas y en los ensayos clnicos con el fin de evaluar sus efectos in vivo en
diferentes patologas.

Conclusiones
Nuestro estudio ha optimizado un procedimiento para la preparacin de PRP de la sangre humana, la
recuperacin de ms del 50% de las plaquetas iniciales con una baja cantidad de otras clulas de la sangre.
Esta preparacin se activ y diferentes fracciones recogidas a lo largo del procedimiento fueron analizados con
el fin de determinar el contenido de factores de crecimiento. De 37 protenas cuantificadas, 12 resultaron ser
aumentadas slo despus de la activacin plaquetaria.

Figura 1. Rendimiento plaquetario, recuperacin y volumen del plasma rico en plaquetas luego del paso 2 de
centrifugacin. A: rendimiento, B: recuperacin, C: Volumen de PRP1

Figura 2. Efecto de la temperatura en la prdida plaquetaria en la fraccin del plasma pobre en plaquetas
despus del segundo paso de centrifugacin.

Figura 3. Variacin individual y diaria del PRP2 a 18 grados centgrados.

A. Recuperacin plaquetaria en PRP2

B. Rendimiento plaquetario en PRP2.Las muestras pertenecen a
diferentes donantes y el procedimiento realizado por diferentes investigadores en das diferentes.

Figura 4. Concentracin de factores de crecimiento secretados luego de la activacin plaquetaria.

A. Factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDFG) B. Factor de crecimiento derivado de plaquetas

AB C. DGFG- BB D. Factor de crecimiento endotelial (EGF) E. Factor de crecimiento transformante 1 (TGF)
F. TGF 2 *Diferencias estadsticamente significativas a partir de la concentracin plasmtica (Anlisis de la
varianza seguido de la comparacin mltiple de Dunnett para n=6, =0.05)

Figura 5. Concentracin de citoquinas anti-inflamatorias

A. IL-4 B. IL-13 C. IFN * Diferencias estadsticamente significativas a partir de la concentracin plasmtica

(Anlisis de la varianza seguido de la comparacin mltiple de Dunnett para n=6, =0.05)

Figura 6. Concentraciones de citoquinas proiinflamatorias

A. IL-18 B.IL-17 C.TNF * Diferencias estadsticamente significativas a partir de la concentracin

plasmtica (Anlisis de la varianza seguido de la prueba de comparacin mltiple de Dunnett para n=6 y
<0.05)

Tabla 1. Rendimiento y recuperacin plaquetaria luego de la centrifugacin de sangre entera.

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

RCF (x
g)
240
360
240
360
240
360
240
360
200
400
300
300
300
300
300
300
300

Tiempo de centrifugacin
(minutos)
8
8
16
16
8
8
16
16
12
12
5
19
12
12
12
12
12

Temperatura
(C)
8
8
8
8
16
16
16
16
12
12
12
12
5
19
12
12
12

Rendimiento
(veces)
2.5
0.9
1.3
0.5
2.6
1.1
1.6
1.8
2.4
0.6
0.2
0.7
1.6
0.8
1.8
1.3
1.7

Tabla 2. Cuantificacin de hemates y leucocitos en sangre entera y fraccin PRP1

Condicin
Volumen ( ml) Hemates ( 106/l) Leucocitos (103/l)
Sangre entera
4.1+/-1.4
4.05+/-0.28 (100%) 4.38+/-0.47 (100%)
1-240 x g, 8 minutos, 16C
1.7+/-0.2
0.02+/-0.00 (0.19%) 0.02+/-0.02 (0.21%)
2-360 x g, 16 minutos, 16C
2.2+/-0.1
0.00+/-0.00
0.00+/-0.00
3-300 x g, 5 minutos, 12C
1.5+/-0.4
0.03+/-0.01 (0.24%) 0.03+/-0.01 (0.28%)
4-300x g, 12minutos, 5C
2.0+/-0.1
0.01+/-0.00 (0.12%) 0.01+/-0.00 (0.12%)
5-300 x g, 12minutos, 12C
2.1+/-0.2
0.01+/-0.00 (0.13%)
0.01/-0.01 (0.08)
Valores expresados como Media+/- desvo estndar
n=3

Recuperacin
(%)
66.6
30.4
52.7
19.5
69.3
33.2
10.4
73.7
82.7
24.2
57.7
28.2
62.7
30.3
73.6
53.7
69.1

Tabla 3. Rendimiento y recuperacin plaquetaria luego de centrifugar PRP1

Corrida

RFC(x g)

Tiempo(minutos)

Rendimiento

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

200
700
200
700
450
450
450
100
800
450
450

7
7
17
17
12
12
12
12
12
5
19

1.8
1.4
2.1
3.6
2.7
2.8
3.2
1.4
3.3
1.8
2.5

Recuperacin Recuperacin
PRP2
PPP
47.1
51.3
39.7
0.0
55.9
8.5
97.4
0.5
75.5
3.6
78.1
3.4
88.9
5.3
38.9
52
93.2
0.0
48.3
20.1
65.7
0.0

Total
98.4
39.7
64.4
97.9
79.1
81.5
94.2
90.9
93.2
38.4
65.7

Tabla 4. Efecto de la temperatura sobre la preparacin del plasma rico en plaquetas

12 (C)
PRP1 (300 x g,
5 minutos)
Recuperacin
90.6+/-21.7
plaquetaria (%)
Rendimiento plaquetario
3.1+/-0.7
(veces)
Volumen de PRP1
26.7+/-0.7
PRP2 ( 700 x g, 17
minutos)
Recuperacin
80.3+/-26.6
Rendimiento
9.3/-2.6
Anlisis de la varianza (n=3, =0.05)

18 (C)

Valor P

87.8+/-22.8

1.0000

2.9+/-0.6

0.5066

27.6+/-1.9

0.7000

86.0+/-46.9
8.8+/-3.6

1.0000
0.8248

Tabla 5. Comparacin estadstica (valor q) de la concentracin de citoquinas entre Plasma y PRP activado
Citoquina

PDGF-AA

PRPcalcio
6.674

PRP-Trombina y calcio

5.931

Resultados

Factor secretado plaquetario

PDGF-AB

9.352

9.556

Factor secretado plaquetario

PDGF-BB

8.072

7.886

Factor secretado plaquetario

IGF-1

0.038

0.302

Factor plasmtico

TGF-1

5.912

4.143

Factor secretado plaquetario

TGF-2

5.574

3.850

Factor secretado plaquetario

TGF-3

No detectado

EGF

9.243

8.386

Factor secretado plaquetario

IL-5

2.568

2.539

Factor plasmtico

IL-6

0.303

0.388

Factor plasmtico

Eotaxin

5.829

6.169

bFGF

0.101

1.173

Factor plasmtico

G-CSF

0.081

0.097

Factor plasmtico

GM-CSF

0.711

0.716

Factor plasmtico

HGF

2.657

2.469

Factor plasmtico

IFN

4.188

2.514

Factor secretado plaquetario

IL-1

0.480

0.590

Factor plasmtico

IL-2

0.869

0.882

Factor plasmtico

IL-2R

0.604

0.256

Factor plasmtico

IL-4

4.894

4.003

Factor secretado plaquetario

IL-7

1.881

1.739

Factor plasmtico

IL-1RA

1.216

0.856

Factor plasmtico

IL-8

10.590

9.597

Factor secretado plaquetario

IL-10

1.433

1.357

Factor plasmtico

IL-12

2.079

1.070

Factor plasmtico

IL-13

3.884

3.901

Factor secretado plaquetario

IL-15

0.001

0.337

Factor plasmtico

IL-17

3.911

3.902

Factor secretado plaquetario

VEGF

No detectado

IFN

No detectado

IP-10

3.131

3.288

Factor plasmtico

MCP-1

4.247

4.392

MIG

1.462

1.136

Factor plasmtico

MIP-1

0.750

1.046

Factor plasmtico

MIP-1

3.341

2.442

Factor plasmtico

RANTES

0.463

0.839

Factor plasmtico

TNF

6.752

4.584

Factor secretado plaquetario

Determinacin de citoquinas secretadas por plaquetas usando la prueba de Tukey post-hoc, valor q =3.68 (k=3,
n=6,=0.05) *Diferencia estadsticamente significativa

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