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Enzimas: Cinética enzimática, factores que afectan, inhibición, regulación. Coila P. FMVZ-UNA-P.

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Cinética enzimática, factores que afectan, inhibición enzimática, regulación y organización.
Cinética enzimática, factores que afectan, inhibición enzimática, regulación y organización.

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Pedro Coila

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA

•Cinética enzimática
•Medición de la Actividad Enzimática (AE)
•Factores que afectan la AE
•Inhibición enzimática
•Regulación enzimática
•Problemas

Estudia la velocidad de las
reacciones enzimáticas y los
factores que la afectan.
La Velocidad o Actividad
Enzimática (AE) puede ser
determinado midiendo la
cantidad de S consumido
(o P formado) en una
unidad de tiempo bajo
condiciones adecuadas de
Tº y pH.

Cinética enzimática

En la práctica es muy difícil determinar la cantidad de
enzima, ya que se encuentran en cantidades muy
pequeñas y por que la mayoría se encuentran
formando complejos. También pueden existir enzimas
que no estén catalizando.
Por eso es más fácil determinar la AE ya que es
directamente proporcional a su concentración.

La AE o velocidad de las enzimas puede ser expresado de
las siguientes formas:

Expresiones de Actividad Enzimática (AE)

Nomenclatura común Unidades Internacionales de AE
(UI o U).-Son los micromolesde S
transformado (o P formado) en un
minuto (μmol/min).
Nomenclatura SI Katal(kat).-Son los moles de S
transforma-do (o P formado) en un
segundo (mol/s).Se pueden usar
prefijos SI.

Problema: Cierta enzima cataliza a una velocidad inicial (vo) de
5,7 x 10-5 UI, exprese esta velocidad en katalesy
microkatales.

Es el número de moléculas de S transformado por una sola molécula
de enzima en un tiempo dado(min o s).

Actividad molecular

ACTIVIDAD MOLECULAR = NUMERO DE RECAMBIO = CONSTANTE CATALITICA (Kcat)

Catalasa

H2O2

Anihidrasacarbónica

HCO3-

Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

40,000,000

400,000

140,000

b-Lactamasa

Benzilpenicilina

2,000

Fumarasa

Fumarato

800

ProteínaRecA(ATPasa)

ATP

0.4

Enzimas

Sustrato

kcat(s-1

)

1.Temperatura
2.pH
3.Concentración de enzima
4.Tiempo de incubación
5.Inhibidores
6.Electrolitos y fuerza iónica
7.Sustancias químicas
8.Concentración de sustrato

Factores que afectan la AE

Numerosos factores influyen en la velocidad de las
enzimas, entre ellas:

1. Efecto de la temperatura

0 10 20 30 40 50 60 70

Temperatura (ºC)

Velocidad de reacción

Tº óptima

Vmáx

D
e
s
n
a
t
u
r
a
liz
a
c

n

d
e
la
e
n
z
im
a

A medida que aumenta la Tº
la AE también sube, pero
solo hasta cierto grado, más
allá de ese límite, la enzima
se desnaturaliza.

Cada enzima tiene su propia Tº óptima, al cual tiene máxima AE.
Para la mayoría de enzimas de mamíferos la Tº óptima está entre
35 y 40ºC.

2. Efecto del pH

4 5 6 7 8 9 10 11

pH

Velocidad de reacción

pH óptimo

Vmáx

Cada enzima tiene
un pH óptimo, al
cual tiene máxima
actividad. Por
debajo y encima de
este pH la actividad
declina.

Los pH extremos generalmente inactivan a las enzimas.
Algunas enzimas tienen un pH óptimo amplio. P. ej. Sacarasa: 3 -
7,5 de pH

¿Cómo afecta el pH?
Modifica la ionización de ciertos grupos del sitio activo, del S o de
ambos.

3. Efecto de la [E]

0 10 20 30 40

Concentración de enzima (mM)

Velocidad de reacción

50 100 150

Bajo condiciones
saturantesde S,
la velocidad de
reacción, es
directamente
proporcional a la
[E].

Problema: Si una enzima cataliza a una vo= 2,7 x 10-3UI
¿Cuál será su velocidad si la [E] se triplica?

Luego, la recta declina
debido a:
-Depleción del S
-Inhibición por el P

0 10 20 30 40

Tiempo (min)

Velocidad de reacción

4. Efecto del tiempo de incubación

En los momentos iniciales, la
AE es directamente
proporcional al tiempo de
incubación, pero solo hasta
cierto límite.

Luego, la AE declina debido a:
-Agotamiento del S
-Desnaturalización de la E
-Inhibición por el propio P

VOαtiempo

5. Inhibidores enzimáticos

Los inhibidoresson sustancias orgánicas o inorgánicas que unidos
a la enzima disminuyen su AE.

6. Electrolitos y fuerza iónica

Los iones(p.e.cationes) muchas veces son requeridos en el sitio
activo de la E.
La fuerza iónicade la solución en donde está la E influye en la AE
(saltingin y salltingout)

7. Sustancias químicas

La presencia de diversos químicos afectan la AE, sobre todo:
-Agentes quelantesy
-Agentes reductantes

8. Efecto de la [S]

En 1912, en la Universidad de
Berlín, los investigadores que
realizaron el primer estudio
(cinético y matemático) del
efecto de la [S] sobre la
velocidad de las reacciones
enzimáticas, fueron:
Leonor Michaelisy Maud
Menten

Ellos observaron que cuando se mantenía constante la
[E], y se aumentaba progresivamente la [S] se obtenía
una gráfica hiperbólica.

2

1

3

4

5

6

7

8

0

0 2 4 6 8

Sustrato(μmol)

A
E
(
U
I
)

80

60

40

20

0

S
+
E

P

EXPERIMENTO DE MICHAELIS-MENTEN

Inicialmente, la v aumenta proporcionalmente a la [S]
(cinética de primer orden), luego va disminuyendo
(cinèticade orden intermedio) hasta que la velocidad
se hace constante, así haya fuerte [S] (cinética de
orden cero).

Gráfica y ecuación matemática de la
hipérbola rectangular

Constante de
Michaelis-Menten

Gráfica y ecuación enzimática de la
hipérbola rectangular

Curva de Michaelis-Menten

Ecuación de
Michaelis-Menten

Velocidad máxima (Vmáx)

Es la máxima velocidad de una reacción enzimática.
En este momento, todas las enzimas están
“trabajando” (no hay enzima disponible).

Si el Km es alto: menor velocidad
Si el Km es bajo: mayor velocidad

Constante de Michaelis-Menten(Km)

Funcionalmente, es la [S] al cual se alcanza el 50% de la Vmáx.
Es una medida de la afinidad de la enzima por un determinado S.
Todas las reacciones enzimáticas tienen su Km característico.

Cuanto > es la afinidad < es el valor de Km (y viceversa)

Problema: ¿Cuál es el S preferido
para la hexokinasa, cuyos
sustratos y Km se
muestran en la siguiente
tabla?

Sustrato

Km (M)

Galactosa

1 x 10-1

Fructosa

1,6 x 10-3

Glucosa

8 x 10-6

Manosa

5 x 10-6

NOTA: Los valores Km de muchas enzimas son próximos
a los de la concentración fisiológica de sus sustratos
, de
forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer
grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

En todo estudio enzimático, los dos parámetros cinéticos
que deben ser determinados son: Vmáxy el Km.

La curva hiperbólica realmente nunca llega a contactar con
la asíntota de la curva (que es el valor de la Vmáx).
Y, si no se conoce el verdadero valor de la Vmáx, tampoco
se podrá determinar el verdadero valor de Km.

Pero en la práctica, estos
dos parámetros no
pueden ser
determinados, en forma
exacta, utilizando la
gráfica de Michaelis-
Menten, debido a:

El Ploteode Lineweaver-Burk
El ploteode Eddie-Hofstee
El ploteode Hanes-Woolf
El ploteode Eisenthaly Cornish
Programascomputarizados

Métodosdisponiblesen:

Entonces, ¿Cómo poder determinar exactamente estos dos
parámetros enzimáticos (Km y Vmax)?

Frente al problema, muchos investigadores plantearon métodos
matemáticos (conocidos como ploteos) para resolver este
problema, entre ellos:

http://www.sbu.ac.uk/biology/enztech/determination.html

Ploteode Lineweaver-Burk(1934)

También conocido como el ploteodel doble recíproco.
El método consiste en aplicar el recíproco (inverso) a la ecuación
de Michaelis-Menten(1/voversus 1/[S]), obteniéndose una recta.

Ploteodel doble recíproco

Vmax

Km

S

vo

1/S

1

vo

Doble recíproco

Ploteodirecto

1
Vmax

-1

Km

1/2

Datos

No

1
2
3
4

0.25
0.50
1.0
2.0

0.42
0.72
0.80
0.92

Absorbancev (mmole/min)

[S]

0.21
0.36
0.40
0.46

(1) El producto fue medido por espectrofotometría a 600 nmpara 0.05 por mol
(2) El tiempo de reacción fue de 10 min

Velocidad

SustratoProducto

Doble recíproco

1/S

1/v

4
2
1
0.5

2.08
1.56
1.35
1.16




1.0

0.5

0

v

Ploteo Directo

Doble recíproco2.0

1.0

0

1/v

-4 -2 0 2 4
1/[S]

0 1 2

[S]

1.0

-3.8

Ejemplo de cinética enzimática y ploteo de Lineweaver-Burk

Los inhibidores son sustancias (orgánicas o inorgánicas)
que al ser añadidos al medio donde está actuando una E
determinan su menor AE.

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