UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA LABORATORIO DE BIOQUIMICA

•Cinética enzimática •Medición de la Actividad Enzimática (AE) •Factores que afectan la AE •Inhibición enzimática •Regulación enzimática •Problemas

 Pedro Coila

Cinética enzimática
Estudia la velocidad de las reacciones enzimáticas y los factores que la afectan.
La Velocidad o Actividad Enzimática (AE) puede ser determinado midiendo la cantidad de S consumido (o P formado) en una unidad de tiempo bajo condiciones adecuadas de Tº y pH.

En la práctica es muy difícil determinar la cantidad de enzima, ya que se encuentran en cantidades muy pequeñas y por que la mayoría se encuentran formando complejos. También pueden existir enzimas que no estén catalizando. Por eso es más fácil determinar la AE ya que es directamente proporcional a su concentración.

Expresiones de Actividad Enzimática (AE)
La AE o velocidad de las enzimas puede ser expresado de las siguientes formas:
Nomenclatura común  Unidades Internacionales de AE (UI o U).- Son los micromoles de S transformado (o P formado) en un minuto (μmol/min). Nomenclatura SI  Katal (kat).- Son los moles de S transforma-do (o P formado) en un segundo (mol/s). Se pueden usar prefijos SI.
Problema: Cierta enzima cataliza a una velocidad inicial (vo) de 5,7 x 10-5 UI, exprese esta velocidad en katales y microkatales.

Actividad molecular
ACTIVIDAD MOLECULAR = NUMERO DE RECAMBIO = CONSTANTE CATALITICA (Kcat)

Es el número de moléculas de S transformado por una sola molécula de enzima en un tiempo dado (min o s).

Enzimas

Sustrato
H2O2 HCO3Acetilcolina

kcat (s-1)

Catalasa
Anihidrasa carbónica Acetilcolinesterasa

40,000,000
400,000 140,000

b-Lactamasa
Fumarasa Proteína RecA (ATPasa)

Benzilpenicilina
Fumarato ATP

2,000
800 0.4

Factores que afectan la AE
Numerosos factores influyen en la velocidad de las enzimas, entre ellas:
1. Temperatura
2. pH 3. Concentración de enzima

4. Tiempo de incubación
5. Inhibidores 6. Electrolitos y fuerza iónica

7. Sustancias químicas 8. Concentración de sustrato

1. Efecto de la temperatura
Velocidad de reacción
Vmáx Desnaturalización de la enzima

Tº óptima

0

10

20

30

40

50

60

70

Temperatura (ºC)

A medida que aumenta la Tº la AE también sube, pero solo hasta cierto grado, más allá de ese límite, la enzima se desnaturaliza. Cada enzima tiene su propia Tº óptima, al cual tiene máxima AE. Para la mayoría de enzimas de mamíferos la Tº óptima está entre 35 y 40ºC.

2. Efecto del pH
Velocidad de reacción
Vmáx

pH óptimo

4

5

6

7

8

9

10

11

pH

Cada enzima tiene un pH óptimo, al cual tiene máxima actividad. Por debajo y encima de este pH la actividad declina.

Los pH extremos generalmente inactivan a las enzimas. Algunas enzimas tienen un pH óptimo amplio. P. ej. Sacarasa: 3 7,5 de pH ¿Cómo afecta el pH? Modifica la ionización de ciertos grupos del sitio activo, del S o de ambos.

3. Efecto de la [E]
Bajo condiciones saturantes de S, la velocidad de reacción, es directamente proporcional a la [E].
Velocidad de reacción

50

100

150

0

10

20

30

40

Concentración de enzima (mM)

Luego, la recta declina debido a: - Depleción del S - Inhibición por el P

Problema: Si una enzima cataliza a una vo = 2,7 x 10-3 UI ¿Cuál será su velocidad si la [E] se triplica?

4. Efecto del tiempo de incubación
Velocidad de reacción 0

10

20

30

40

Tiempo (min)

En los momentos iniciales, la AE es directamente proporcional al tiempo de incubación, pero solo hasta cierto límite.

VO α tiempo
Luego, la AE declina debido a: - Agotamiento del S - Desnaturalización de la E - Inhibición por el propio P

5. Inhibidores enzimáticos
Los inhibidores son sustancias orgánicas o inorgánicas que unidos a la enzima disminuyen su AE.

6. Electrolitos y fuerza iónica
Los iones (p.e. cationes) muchas veces son requeridos en el sitio activo de la E. La fuerza iónica de la solución en donde está la E influye en la AE (salting in y sallting out)

7. Sustancias químicas
La presencia de diversos químicos afectan la AE, sobre todo: -Agentes quelantes y -Agentes reductantes

8. Efecto de la [S]
En 1912, en la Universidad de Berlín, los investigadores que realizaron el primer estudio (cinético y matemático) del efecto de la [S] sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas, fueron: Leonor Michaelis y Maud Menten
Ellos observaron que cuando se mantenía constante la [E], y se aumentaba progresivamente la [S] se obtenía una gráfica hiperbólica.

EXPERIMENTO DE MICHAELIS-MENTEN

0

1

2

3

4

5

6

7

8

80 60

S + E ↓ P

AE (UI)

40 20

0 0 2 4 6 8

Sustrato (μmol)

Inicialmente, la v aumenta proporcionalmente a la [S] (cinética de primer orden), luego va disminuyendo (cinètica de orden intermedio) hasta que la velocidad se hace constante, así haya fuerte [S] (cinética de orden cero).

Gráfica y ecuación matemática de la hipérbola rectangular

Gráfica y ecuación enzimática de la hipérbola rectangular

Constante de Michaelis-Menten

Curva de Michaelis-Menten

Ecuación de Michaelis-Menten

Velocidad máxima (Vmáx)
Es la máxima velocidad de una reacción enzimática. En este momento, todas las enzimas están “trabajando” (no hay enzima disponible).

Constante de Michaelis-Menten (Km)
Funcionalmente, es la [S] al cual se alcanza el 50% de la Vmáx. Es una medida de la afinidad de la enzima por un determinado S. Todas las reacciones enzimáticas tienen su Km característico.
Cuanto > es la afinidad < es el valor de Km (y viceversa)

Si el Km es alto: menor velocidad Si el Km es bajo: mayor velocidad
Problema: ¿Cuál es el S preferido para la hexokinasa, cuyos sustratos y Km se muestran en la siguiente tabla?

Sustrato Galactosa Fructosa Glucosa Manosa

Km (M) 1 x 10-1 1,6 x 10-3 8 x 10-6 5 x 10-6

NOTA: Los valores Km de muchas enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.

En todo estudio enzimático, los dos parámetros cinéticos que deben ser determinados son: Vmáx y el Km.
Pero en la práctica, estos dos parámetros no pueden ser determinados, en forma exacta, utilizando la gráfica de MichaelisMenten, debido a:

La curva hiperbólica realmente nunca llega a contactar con la asíntota de la curva (que es el valor de la Vmáx). Y, si no se conoce el verdadero valor de la Vmáx, tampoco se podrá determinar el verdadero valor de Km.

Entonces, ¿Cómo poder determinar exactamente estos dos parámetros enzimáticos (Km y Vmax)? Frente al problema, muchos investigadores plantearon métodos matemáticos (conocidos como ploteos) para resolver este problema, entre ellos:  El Ploteo de Lineweaver-Burk  El ploteo de Eddie-Hofstee  El ploteo de Hanes-Woolf  El ploteo de Eisenthal y Cornish  Programas computarizados
Métodos disponibles en:
http://www.sbu.ac.uk/biology/enztech/determination.html

Ploteo de Lineweaver-Burk (1934)
También conocido como el ploteo del doble recíproco. El método consiste en aplicar el recíproco (inverso) a la ecuación de Michaelis-Menten (1/vo versus 1/[S]), obteniéndose una recta.

Ploteo del doble recíproco
Doble recíproco Ploteo directo

1 vo
-1 Km

Vmax vo 1/2
1
Vmax

1/S

Km

S

Ejemplo de cinética enzimática y ploteo de Lineweaver-Burk
Sustrato No Producto Velocidad Doble recíproco

1 2 3 4

[S] Absorbance v (mmole/min) 0.25 0.21 → 0.42 0.50 0.36 → 0.72 1.0 0.40 → 0.80 2.0 0.46 → 0.92

1/S 4 2 1 0.5

1/v 2.08 1.56 1.35 1.16

Datos

(1) El producto fue medido por espectrofotometría a 600 nm para 0.05 por mol (2) El tiempo de reacción fue de 10 min

v 0.5

Doble recíproco

Ploteo Directo

1.0

2.0

1/v
1.0

1.0 -3.8

0

0 -4 -2 0 2 4

0

1

2

[S]

Inhibición enzimática
Los inhibidores son sustancias (orgánicas o inorgánicas) que al ser añadidos al medio donde está actuando una E determinan su menor AE.

Modo de acción de los inhibidores
Los inhibidores se unen a la enzima lo que ocasiona la pérdida parcial o total de la AE formando los complejos EI o ESI

Aplicaciones
El estudio de los inhibidores es importante por que proporciona información sobre:  El mecanismo de catálisis enzimática  La especificidad de la enzima  La naturaleza de los grupos funcionales del sitio activo

Aplicaciones del estudio de inhibidores:
Muchos compuestos actúan inhibiendo ciertas reacciones enzimáticas; y, por lo tanto, de toda una vía metabólica. Entonces, tiene aplicación en:  Medicina.- Antiinflamatorios, analgésicos, antibióticos, interferones, anticancerígenos, etc  Agricultura.- Herbicidas, insecticidas, plaguicidas, etc.  Guerras biológicas.- Gases nerviosos, venenos, etc.  Industria alimentaria Biotecnología, ect.

Tipos de Inhibición
1. Inhibición Irreversible.- Al retirar del medio el inhibidor, la enzima no recupera su AE. Entonces, el inhibidor ha destruido algún grupo funcional necesario para la actividad catalítica de la E. A menudo la unión la EI es covalente. Ejemplos: - Los organofosforados inhiben a la acetilcolinesterasa. - Agentes alquilantes como el yodoacetato (se unen a – SH) - La penicilina inhibe enzimas que sintetizan la pared bacteriana - Los metales pesados (Pb, As, Hg) .

Tipos de Inhibición
2. Inhibición Reversible.- Si el inhibidor es retirado del medio (por diálisis u otros medios) en donde está actuando, la enzima recupera su AE. Entonces, se dice que la E se ha reactivado. La unión EI es laxa. Existen 3 subtipos: -Competitiva -No Competitiva -Acompetitiva

Inhibición reversible (Mecanismo)
I

Competitiva
Sustrato

I

No competitiva
S

I

Acompetitiva
E
I

Esquemas

S

E
Compiten por Inhibidor el sitio activo E + S → ES → E + P ← + I ↓ ↑ EI
[I] sólo se une a [E] libre, y compite con el [S]; incrementando la [S] se revierte la Inhibición.

I

S

E

I I

S

Diferente sitio E + S → ES → E + P ← + + I I ↓ ↓ ↑ ↑ EI + S →EIS
[I] se une a [E] libre o al complejo [ES] ; aumentando la [S] no se revierte la inhib.

S

I

Ecuacíones y Descripciones

E + S → ES → E + P ← + I ↓↑ EIS
[I] sólo se une al complejo [ES], aumentando la [S] se favorece la inhibición.

Inhibición enzimática (Ploteos)
I
vo

Competitiva
Vmax

I

No competitiva
Vmax

I

Acompetitiva
Vmax

Ploteo directo

vo

I

I

Vmax’

I

Vmax’

Km Km’

[S], mM

Km = Km’

[S], mM

Km’ Km

[S], mM

Ploteo de Lineweaver-Burk

Vmax no cambia Km aumenta 1/vo
Intersect en el eje Y

Vmax disminuye Km no cambia 1/vo I

Vmax y Km disminuyen 1/vo
Dos líneas paralelas

I

I

1/ Vmax

Intersect en el eje X

1/ Vmax

1/ Vmax 1/Km 1/[S]

1/Km

1/[S]

1/Km

1/[S]

Ejemplo de un inhibidor competitivo
Domagk (1939)

Acido para-aminobenzoico (PABA)
La bacteria requiere PABA para la biosíntesis de ácido fólico

H2NPrecursor

-COOH

Acido fólico

Acido tetrahidrofólico

H2N-

-SONH2

Las sulfas tienen similar estructura con el PABA e Inhiben el crecimiento de la bacteria..

Sulfanilamida

Ejemplo de algunos inhibidores aplicados en medicina
Droga Lovastatina 5-fluouracil Metrotexate Alopurinol Cumadin Aspirina Captopril Uso terapéutico Hipercolesterolemia Cáncer Cáncer Gota Anticoagulante Antiinflamatorio Hipertensión art. Enzima afectada HMGCoA reductasa Timidilato sintetasa Dihidrofolato reductasa Xantino oxidasa Glutamil carboxilasa Ciclooxigenasa Enz.convert.angiotensina Tipo de inhibidor Competitiva Irreversible Competitiva Irreversible Competitiva Irreversible Competitiva

Regulación enzimática
El funcionamiento celular u orgánico requiere que todas las reacciones estén controlados, de modo que las vías metabólicas estén activas en ciertos momentos e inactivas en otros.
Todas las enzimas pueden ser reguladas por factores como Tº, pH, [S], [E], cofactores, etc. Pero estos factores en el organismo animal son casi constantes, por lo que poco influyen en la regulación. Existen otros mecanismos intracelulares que permiten la regulación de la velocidad de las reacciones enzimáticas

La regulación enzimática se refiere a la posibilidad que tienen las enzimas de variar la velocidad de las reacciones que catalizan al producirse determinados cambios en el medio.
Existen dos tipos de enzimas especializadas denominadas enzimas regulatorias (o moduladoras) que intervienen en la regulación del metabolismo y están ubicadas estratégicamente en las vías metabólicas: 1. Las enzimas alostéricas  Regulación Alostérica 2. Las enzimas reguladas por unión covalente  Regulación Covalente

Ubicación de las enzimas regulatorias

Generalmente, catalizan las primeras reacciones, permitiendo una regulación de una vía desde el inicio (principio de máxima economía)

1. Regulación alostérica
Las enzimas alostéricas presentan 2 sitios de unión funcionalmente distintos y separados: -Sitio activo.- Con actividad catalítica, sierve la unión con el S. -Sitio alostérico o regulador.- Sin actividad catalítica, sirve para la unión con una molécula efectora (= efector, modulador o regulador) por enlaces no covalentes.

Tipos de efectores
1. Efectores negativos o inhibidores.- Disminuyen la AE 2. Efectores positivos o activadores.- Aumentan la AE

Si la enzima posee: -Un solo efector (+ ó -) = monovalente -Dos o más efectores (+ ó -) cada uno con su sitio = polivalente

Características de las enzimas alostéricas
1. Generalmente, son poliméricas 

Alto PM
2. No cumplen la clásica cinética

micheliana.

3. Presentan 2 estados interconformacionales

interconvertibles. Ambos están en equilibrio. - R (relajado).- Es activo. Tiene alta afinidad por el S - T (tenso).- Es inactivo. Baja afinidad por el S

4. Pueden ser homeotrópicas (si su propio S actúa como efector) o heterotrópicas (si el efector es una molécula distinta al S)
6. Son bastante inestables o lábiles

Mecanismo y ejemplo de regulación alostérica Cinética
R = Relajado (activo)
vo

Modelos
Sitio alostérico

Cooperación
R

(+)
S

S

S

R R
(+)
vo
S

[S]

Sitio alostérico

Homotrópico (+) Concertado

A (+)

T
S

X
T
T = Tenso (inactivo) vo

R
[S]

Heterotrópico (+) Secuencial

I (-)
[S]

T

X

(-)

X

T

Heterotrópico (-) Concertado

2. Regulación covalente
Son enzimas que presentan 2 formas interconvertibles, con diferente composición, lo que origina cambios conformacionales en la molécula (estructura 3ria o 4ria). En la mayoría de los casos, las 2 formas de la enzima sólo se diferencia en la presencia de un grupo fosfato el cual se une covalentemente a la proteína. Entonces, las formas serían: 1. Forma fosfatada o forma a 2. Forma no fosfatada o forma b

Las kinasas: Son enzimas que agregan el grupo fosfato proveniente del ATP. Las fosfatasas: Son las enzimas que retiran el grupo fosfato.
Las 2 formas difieren en su grado de actividad, siendo una muy activa y la otra poco activa. Algunas veces la forma a es la activa y en otros casos la forma b.

Regulación covalente (por fosforilación)
Fischer, Kreb (1978)

OH
Protein

Kinasa
(fosforilación)

P
Conformational Change

Fosfatasa
(defosforilación)

Glycogen phosphorylase b

Glycogen phosphorylase a

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