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66182G245 PDF
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Director
OSCAR A. PABON RINCN
Microbilogo con nfasis en alimentos
Docente Escuela de Tecnologa Qumica
Nota de aceptacin
____________________________
Firma del presidente del jurado
____________________________
Firma del jurado
____________________________
Firma del jurado
AGRADECIMIENTOS
CONTENIDO
RESUMEN
INTRODUCCIN
19
21
2. JUSTIFICACIN
23
25
25
4. MARCO TERICO
4.1. ETANOL
4.1.1. Qu es el etanol?.
4.2. HISTORIA
26
26
26
26
26
27
28
28
29
29
30
4.4.1. Introduccin
30
32
4.4.2.1. Temperatura
32
4.4.2.2. pH
32
4.4.2.3. Nutrientes
33
4.4.2.4. Aireacin
33
4.4.2.5. Productividad
33
33
33
34
34
4.4.3.4. Temperatura
34
35
35
35
35
35
36
36
37
38
39
40
40
45
45
46
47
48
52
53
53
53
54
55
5. METODOLOGA
57
57
5.2. MICROORGANISMO.
57
58
59
5.5. FERMENTACIN
60
62
63
63
63
64
64
67
6. RESULTADOS Y DISCUSIONES
6.1. DETERMINACIN DE LA LONGITUD DE ONDA DE MXIMA
ABSORBANCIA MTODO FENOL-CIDO SULFRICO.
68
68
70
72
73
73
74
78
82
86
87
91
92
92
93
94
96
96
97
101
101
102
106
106
106
111
112
113
114
115
115
116
7. CONCLUSIONES
117
BIBLIOGRAFA
121
NDICE DE FIGURAS
36
36
42
43
44
49
50
53
54
57
58
58
59
61
62
63
64
65
67
68
69
71
74
75
76
79
80
81
82
83
84
87
88
89
93
95
97
98
99
102
103
104
106
107
108
110
Figura 51. Comparacin % etanol obtenido para cada una de las levaduras
estudiadas
113
115
NDICE DE TABLAS
37
51
68
70
71
72
72
74
75
76
82
83
84
87
88
89
92
92
93
94
94
95
97
98
99
102
103
104
107
108
109
Tabla 33. Comparacin consumo de azcares para cada una de las levaduras
estudiadas
111
Tabla 34. Comparacin % etanol obtenido para cada una de las levaduras
estudiadas.
112
114
114
NDICE DE CUADROS
38
52
52
ANEXOS
124
125
126
127
128
129
130
131
132
RESUMEN
Las cepas Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 , ATCC 9080 y Candida utilis
ATCC 9950 presentaron un porcentaje de alcohol del 8 % (V/V), mientras que la
17
18
INTRODUCCIN
20
generando
as
repercusiones
en
la
economa
de
los
pases
Adicional a esto, la utilizacin del petrleo como fuente energtica trae como
consecuencia dao sobre el entorno natural, no solo, por la produccin de grandes
cantidades de dixido de carbono, el cual aumenta la absorcin de calor
contribuyendo al calentamiento global (Gallardo, 2007), sino tambin por el
impacto que tiene sobre el territorio en el que se realizan las explotaciones
(Snchez y Vargas, 2005). Estos fenmenos solo podran ser contrarrestados a
medida que aparezcan nuevos hallazgos, que aumenten considerablemente la
oferta de sustitutos y que disminuyan los efectos sobre el medio ambiente.
22
2. JUSTIFICACIN
El etanol ofrece diversas ventajas sobre los derivados del petrleo, como son:
menores precios de las importaciones, disminucin en el costo del combustible,
apoyo a producciones agrcolas, mejoramiento de las situaciones econmicas y
sociales en las zonas rurales, mayor seguridad energtica y reduccin de la
contaminacin, puesto que se ha comprobado que en trminos de generacin de
23
24
3. OBJETIVOS
25
4. MARCO TERICO
4.1. ETANOL
Las recurrentes crisis en los precios y el agotamiento de los combustibles fsiles
como el petrleo, el cual es clave en el desarrollo de la vida de la sociedad, hace
necesaria la investigacin, fomento y uso de nuevos combustibles. Uno de estos
combustibles es el etanol producido a partir de la fermentacin de los azcares
que se encuentran en los productos vegetales, el que debidamente procesado
poco a poco comienza a postularse como combustible en el mercado internacional
(Levtona, 2006).
4.2. HISTORIA
4.2.1. El etanol en el mundo. La utilizacin de los biocombustibles lquidos es tan
antigua como la de los mismos combustibles de origen fsil y los motores de
combustin interna. Las crisis energticas que sacudieron el siglo XX, y la
preocupacin mundial por la conservacin del medio ambiente, fueron el motor
para incentivar la bsqueda de nuevas fuentes energticas como el etanol (Grupo
Manuelita, 2007).
26
La historia del uso del etanol como combustible, se remonta al siglo XIX y su
lnea cronolgica desde entonces hasta la actualidad, describe, una serie de
acontecimientos importantes en el campo de la ingeniera automotriz, la
agroindustria, la ecologa y la industria energtica.
Este fue uno de los motivos que tuvo en cuenta el Congreso de la Repblica para
expedir la Ley 693 de septiembre 19 de 2001, cuyo objeto es controlar la
contaminacin del aire mediante el uso de oxigenantes en las gasolinas que
reduzcan la contaminacin producida por los motores de combustin interna.
Igualmente, establece que, a partir del 27 de septiembre del ao 2005, las
gasolinas que se utilicen en las ciudades con ms de 500 mil habitantes como
Bogot, Cali, Medelln y Barranquilla y, posteriormente,
para el 2006,
Las emisiones de monxido de carbono son menores en el caso del etanol, ya que
este producto es reducido por mezclas aire-combustible, con un contenido bajo de
este ltimo y exceso de aire. La combustin de etanol genera menor cantidad de
xidos de nitrgeno (NOX) que la gasolina y el diesel, debido a que su elevado
calor latente de vaporizacin proporciona un mayor enfriamiento del motor y una
temperatura de flama ms baja; teniendo en cuenta el riesgo inminente que
28
emisiones del dixido de carbono emitido por la flota vehicular. Con esto, se
espera un impacto positivo sobre el medioambiente, y en consecuencia en la salud
de las personas que habitan las ciudades. Los efectos positivos sobre el medio
ambiente se debe a que el etanol carburante (Cadena Agroindustrial, 2004):
Es un compuesto biodegradable.
Su combustin produce un efecto oxigenante.
Reduce la emisin de gases txicos de los vehculos tradicionales.
Reduce el efecto invernadero.
2C2H5OH + 2CO2
30
Las
principales
responsables
de
esta
degradacin
son
las
levaduras.
Puesto que gran cantidad de residuos que contienen carbohidratos de precio muy
reducido, pueden aprovecharse en la fabricacin de etanol; este tipo de
fermentacin a escala industrial, ha sido usada aos atrs por la humanidad para
la elaboracin de cerveza, vinos y en general bebidas alcohlicas y en la
actualidad se le est dando un valor agregado a la produccin de etanol para ser
utilizado como biocombustible.
concentraciones
del
sustrato,
biomasa
producida
entre
otras
(Biocombustibles, 2007).
4.4.2.2. pH. El pH tiene una gran influencia en los productos finales del
metabolismo anaerobio, por lo tanto es importante tener un control sobre esta
variable durante el desarrollo del proceso de fermentacin puesto que los
microorganismos poseen un pH ptimo en el cual tienen mayor velocidad de
crecimiento y rendimiento.
32
33
34
4.4.4.1. Fuentes con alto contenido de azcares. Como lo son azcar de caa,
remolacha, melazas y jugos de fruta. Son materias primas que poseen un alto
contenido de azcares simples y fermentables, como la glucosa, la fructosa, la
galactosa y la sacarosa, entre otros. La ventaja de utilizar este tipo de fuentes
consiste en que no es necesario realizar tratamientos previos para obtener los
azcares fermentables, puesto que estos ya se encuentran presentes.
4.4.4.2. Fuentes con alto contenido de almidn. Como por ejemplo el maz,
malta, cebada, avena trigo, arroz, sorgo y otros.
Estas fuentes deben ser tratadas previamente para obtener los azcares
fermentables. En el caso de los cereales, estos deben someterse previamente a
un proceso de hidrlisis del almidn, con el fin de romper este biopolmero en
azcares fermentables que estn
disponibles para
los microorganismos
(Biocombustibles, 2007).
Otros carbohidratos
Cenizas
Compuestos
nitrogenados
cidos no nitrogenados
Componentes
Agua
Sacarosa
Glucosa
Fructosa
Otras sustancias reductoras
Gomas, almidn,
pentosanos, cidos
urnicos, D-manitol y otros.
Carbonatos bases:
K2O
CaO
MgO
Na2O
cidos:
SO3
Cl
P2O5
SiO2
Protena bruta Protena
verdadera Aminocidos:
acido aspartico y glutmico
Acido aconitico, ctrico,
malico, oxalico, glicolico
Mesaconico, succnico,
fumarico, tartarico
Porcentaje en peso
(% p/p)
17-25
30-40
4-9
5-12
1-4
2-5
7-15
30-50
7-15
2-14
0.3-9
7-27
12-20
0.5-2.5
1-7
2.5-4.5
0.5-1.5
0.3-0.5
1.5-6
0.5-1.5
0.1-1
(Meade, 1986).
37
Cantidades variables
La gama amplia de las melazas que salen de las centrifugas debe ser de 85 a 92
grados Brix, lo cual equivale a aproximadamente 77 a 84 slidos por desecacin.
La norma ICONTEC 587 de 1994, define como miel fina o melaza (no cristalizable)
al jarabe liquido denso o viscoso, separado de la misma masa cocida final y de la
cual no es posible cristalizar ms azcar por mtodos usuales (Fajardo y
Sarmiento ,2007).
GENERALIDADES
Alimentacin rica.
Alimentacin menos rica: desecados sobre
pulpas, mezcla de diversos alimentos,
pulverizados de forrajes, suplemento de
ensilajes.
Lejas finales como alimento animal y para la
obtencin de aminocidos.
Vinazas para la obtencin de cido glutmico.
38
Cuadro 1. Continuacin
Fermentacin
4.4.6.1.
Microorganismos
utilizados
en
la
fermentacin
alcohlica.
En el caso de las levaduras, cuando stas toman el azcar del medio, se inicia
toda una serie de reacciones intermedias, conocidas como la ruta glicoltica o ruta
Embden-Meyerhof. A travs de este proceso bioqumico, las levaduras rompen los
azcares en energa, intermediarios tiles para el crecimiento de las clulas, y una
gran cantidad de productos finales (etanol, dixido de carbono y calor), los cuales
son excretados por las mismas.
Sin embargo, existen otros microorganismos que siguen otras rutas metablicas
distintas durante la fermentacin alcohlica. Muchas bacterias, como Zymomonas
mobilis, las cuales transforman los azcares a partir de la ruta de EntnerDoudoroff, la cual, por sus caractersticas, obliga al microorganismo a producir
menos biomasa (comparado con las levaduras) y canalizar ms carbono hacia los
productos finales.
41
2 Piruvato
Condiciones
anaerbias
2 Etanol + 2 CO2
Fermentacin alcohlica en
levaduras
(Lehninger, 1981)
42
La
C
C Piruvato
H3C
TPP, Mg+2
CO2
Piruvato
descarboxilasa
H
Acohol
deshidrogenasa
Acetaldehido
CH3
NADH + H+
NAD+
OH
CH2
Etanol
CH3
(Lehninger, 1981).
En las levaduras, la produccin de etanol se realiza principalmente sobre
sustratos sacarosados, jugos de remolacha, jarabe, aguas residuales o
melaza de azcar. Las principales caractersticas que debe tener una cepa
para la produccin de alcohol industrial son:
43
Gliceraldehido
3-Fosfato
2 Piruvato
2 Etanol + 2 CO2
(Leveau, Bouix. 2000).
La transformacin de piruvato a etanol y dixido de carbono ocurre de la
misma forma que para levaduras, como se mostr en la figura 3.
44
4.5. MICROORGAMISMOS
4.5.1. Levaduras. Las levaduras pueden ser definidas como hongos unicelulares
que se reproducen por gemacin o fisin. Las levaduras estn implicadas en
fenmenos de competicin por nutrientes, de antagonismo o de simbiosis en los
suelos, las aguas, los animales y los vegetales. Su presencia depende en primer
lugar de la disponibilidad de carbono orgnico, temperatura, pH y de la presencia
de agua (Leveau, Bouix. 2000).
El hbitat de las levaduras, puede ser en las capas superiores del suelo, en
materias orgnicas sobre todo de origen vegetal que sean ricas en carbohidratos;
estas pueden aislarse especialmente del suelo de los viedos y huertos, de las
superficies de uvas, manzanas y de la mayora de los frutos dulces. Son
arrastradas por el aire, junto con el polvo (Prescott y Cecil, 1992).
45
Las levaduras han sido usadas por el hombre desde hace milenios, en particular
en la fabricacin de bebidas alcohlicas y de pan.
46
Otros Iones: Otros iones que juegan papel importante son: calcio,
manganeso, zinc, hierro, bario, cloruro, sodio.
47
48
49
(http://www.n-t.ru/tp/nr/mk_p02.jpg)
Requerimientos
nutricionales:
Saccharomyces
cerevisiae
requiere
PORCENTAJE (%)
7
43
48
2
Hongo
Amastogomycota
Ascomycetes
Hemiascomycetidae
Endomycetales
Sacchaomycetaceae
Saccharomycetaidae
Saccharomyces
cerevisiae
Fungi
Ascomycota
Saccharomycotina
Saccharomycetes
Saccharomycetales
Saccharomycetaceae
Candida
utilis
(Leveau, Bouix. 2000)
52
los
polisacridos
son
hidrolizados
sus
constituyentes
53
(www.a14.san.gva.es/laboratorio/Web/Biot2001.htm)
Principio de funcionamiento
La corriente de ionizacin de llama hidrogeno-aire, en ausencia de cualquier
sustancia se debe a la presencia de iones H3O+ acompaados de trazas de
NO+ y NH3. Esta corriente de fondo se establece al someter la llama a una
diferencia de potencial.
55
56
5. METODOLOGA
(Autores)
5.2. MICROORGANISMO.
Se evaluaron las levaduras Saccharomyces cerevisiae silvestre, Candida utilis
ATCC 9950 y Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763; se les realizo el tratamiento
como se muestra en la figura 11. Se conservar un ejemplar en el cepario del
57
(Autores)
5.3. ANLISIS MICROBIOLGICO DE LA MELAZA.
Figura 12. Anlisis microbiolgico de la melaza.
(Autores)
58
5 mm de
(Autores)
59
5.5. FERMENTACIN.
Figura 14. Proceso de Fermentacin de melaza para Saccharomyces cerevisiae
silvestre.
(Autores)
60
(Autores)
61
(Autores)
62
(Autores)
63
En la figura anterior se muestran las partes y los materiales con los cuales se llev
a cabo el montaje del biorreactor.
65
muestras
se
realizaron
aspersiones
con
alcohol
para
evitar
cualquier
Para la recoleccin del CO2, se tomaron tubos de vidrio y mangueras los cuales
iban dirigidos a una solucin de BaCl2 saturada y agua estril.
El electrodo de pH metro se introdujo en el mosto a un nivel adecuado para
garantizar la veracidad de la medida, este dispositivo contaba con sensor de
temperatura para verificar que esta fuera la adecuada.
La agitacin se realiz por medio de paletas de acero inoxidable, las cuales iban
conectadas a un motor que regulaba las revoluciones por minuto, este equipo de
agitacin es utilizado para el anlisis de aguas y es conocido como test de jarras,
en este caso se realizaron las adecuaciones necesarias para utilizar el motor y las
paletas como sistema de agitacin, este se realiz para aumentar el rea de
contacto entre las levaduras y el sustrato, adems de garantizar como se
menciono anteriormente que las muestras tomadas fueran homogneas, para la
posterior determinacin de los azcares.
Durante los primeros ensayos se introdujeron en la tapa dos jeringas las cuales
estaban conectadas con bolsas para suero que contenan acido lctico y NaOH 1
M, para que en caso de haber variaciones significativas de esta variable se
pudieran regular y mantener el pH ptimo en el cual se desarrollan las levaduras,
una vez se verifico que no hubieran variaciones drsticas de esta variable estas
jeringas fueron retiradas de la tapa.
66
67
6. RESULTADOS Y DISCUSIONES
6.1.
DETERMINACIN
DE
LA
LONGITUD
DE
ONDA
DE
MXIMA
Absorbancia
1,288
Patrn
1
2
3
4
5
6
7
Absorbancia
0
0,156
0,307
0,415
0,592
0,676
0,845
Absorbancia
y = 0,0138x + 0,0137
R2 = 0,996
0
20
40
60
80
Concentracin (mg/L)
Como se muestra en la grfica anterior, el mtodo presenta una correlacin de
0,996 a la presencia de azcares reductores totales, mostrando una relacin
directa entre la absorbancia y la presencia de los mismos, la formacin del
complejo es evidente por un color naranja que se hace ms intenso a medida que
la cantidad de azcares reductores totales aumenta.
La tendencia de la grfica es lineal mostrando un ndice de correlacin de 0.996
con el cual es posible realizar interpolaciones, para posteriormente elaborar la
curva de seguimiento de los azcares reductores totales en el proceso de
fermentacin.
69
1
2
3
4
5
6
7
70
Absorbancia
( =625nm)
0.084
0.158
0.354
0.415
0.650
0.780
0.826
1.112
Absorbancia
Absorbancia vs No de colonias
suspendidos y = 0,1496x + 0,0144
R2 = 0,9823
1,5
1
0,5
0
0
1
2
4
5
6
Absorbancia
UFC/mL
0.084
0.158
0.354
0.650
0.780
0.826
5.1*106
7*107
3.2*108
1.2*109
2.2*109
7.9*1010
71
Mtodo
Recuento en placa
profunda
Recuento en placa
profunda
Recuento en placa
profunda
Recuento en placa
profunda
NPM
Reporte
20*102 (UFC/g)
29*101 (UFC/g)
16*101 (UFC/g)
11*101 (UFC/g)
<3 (NPM/g)
En comparacin con la norma NTC 607 la melaza a utilizar cumple con los
conteos para Bacterias aerobias mesfilas, mohos, levaduras y coliformes totales.
72
(Autores)
Descripcin Macroscpica:
Colonias blancas, cremosas, hmedas, brillantes bordes irregulares y convexas.
Para la preparacin del inculo en cada ensayo, se tomo una colonia aislada de
aprox. 5 mm de dimetro, se suspendi en 10 mL de S.S.E y se le midi la
absorbancia a 625 nm utilizando un fotmetro Genesys 20.
73
Ensayo 1.
Absorbancia inoculo= 0,210
Concentracin
(g/L)
180
142,58
138
121,33
114,32
55,6
38,64
20,6
16,98
Absorbancia
0,760
0,604
0,585
0,516
0,487
0,781
0,547
0,298
0,248
Factores de
dilucin
3/10000
3/10000
3/10000
3/10000
3/10000
1/1000
1/1000
1/1000
1/1000
Concentracin (g/L)
20
40
60
Tiempo (h)
Ensayo 2
Absorbancia inoculo= 0,189
Tabla 10. Ensayo 2 concentracin 180 g/L
Concentracin
(g/L)
175,92
168,19
165,53
161,18
145,97
83,89
64,08
44,37
20,82
Tiempo (h)
0
4
8
12
16
24
27
32
48
Absorbancia
0,742
0,71
0,699
0,681
0,618
0,361
0,279
0,626
0,301
Factores de
dilucin
3/10000
3/10000
3/10000
3/10000
3/10000
3/10000
3/10000
1/1000
1/1000
Concentracin
Azcar (g/L)
20
40
60
Tiempo (h)
Al determinar el Porcentaje de alcohol obtenido para la concentracin de 180 g/L
se obtuvo es siguiente resultado
75
Concentracin (g/L)
177,96
155,385
151,765
141,255
130,145
69,745
51,36
32,485
18,9
Concentracin
(g/L)
20
40
60
Tiempo (h)
Como se observa en la grafica, durante las primeras 16 h del ensayo la levadura
no ha metabolizado cantidades apreciables de azcar por la cantidad de levadura
presente, considerando que en este periodo la poblacin de microorganismo se
76
Por lo tanto el tiempo ptimo de fermentacin para una concentracin de 180 g/L
de melaza es de 48 h.
Como se observa en el cromatograma del etanol absoluto (ver figura 29) el tiempo
de retencin es de 1.083 minutos, para el destilado el tiempo de retencin es de
0.850 minutos y para el metanol (ver figura 30) el tiempo de retencin es de 0.60
minutos por lo tanto podemos atribuir la presencia de etanol en el destilado por
mostrar tiempos de retencin cercanos, condiciones ptimas para la produccin
de etanol y el proceso de destilacin se dio a una temperatura de ebullicin de
aproximadamente 78 C (el aumento en la temperatura de ebullicin del etanol se
debe a la presencia de slidos disueltos); de la misma forma podemos concluir
que el destilado no presenta otros compuestos orgnicos puesto que en el mismo
no se observan picos importantes y teniendo en cuenta que el detector utilizado
FID es muy sensible para compuestos orgnicos.
78
79
80
81
Ensayo 1
Absorbancia inoculo= 0,202
Concentracin
(g/L)
193,71
179,22
158,06
155,74
136,61
104,72
98,06
66,27
29,66
Factores de
dilucin
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/1000
Absorbancia
0,682
0,632
0,559
0,551
0,485
0,375
0,352
0,242
0,423
Concentracin
Azcar (g/L)
20
40
60
Tiem po (h)
82
Ensayo 2.
Absorbancia inoculo= 0,161
Tiempo (h)
0
3
8
12
15
24
27
32
48
Absorbancia
0,68
0,51
0,473
0,45
0,442
0,411
0,391
0,272
0,441
Factores de
dilucin
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/1000
Concentracin
Azcar (g/L)
20
40
Tiempo (h)
83
60
Tiempo (h)
0
3
8
12
15
24
27
32
48
Concentracin
Azcar (g/)
20
40
60
Tiempo (h)
Como se observa en la grfica la concentracin de azcares disminuye
con
86
Ensayo 1
Absorbancia=0.174
Tabla 15. Ensayo 1 concentracin 250 g/L.
Tiempo
(h)
0
8
15
24
32
48
56
72
Concentracin (g/L)
231,99
208,8
181,63
162,07
154,82
127,64
86,34
48,66
87
Ensayo 2
Absorbancia= 0.196
Tabla 16. Ensayo 2 concentracin 250 g/L
Tiempo (h)
0
8
15
24
32
48
56
72
Concentracin
(g/L)
222,57
220,04
184,17
182,36
168,59
117,86
95,76
79,82
Absorbancia
0,628
0,621
0,522
0,517
0,479
0,339
0,278
0,234
Factores de
dilucin
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
Concentracin
(g/L)
227,28
214,42
182,9
172,215
161,705
122,75
91,05
64,24
con
Para esta concentracin podemos observar como la levadura tolero este aumento
de azcares en el medio mnimo de sales y aument el porcentaje de alcohol
como era de esperarse, aunque algunas referencias bibliogrficas (Ros, et al.
2005) reportan que a 250 g/L el proceso de respiracin celular es defectuoso y por
ende la produccin de alcohol,
91
Ensayo 1
Ensayo 2
163,02
164,05
183,33
155,10
162,17
142,75
Promedio
(g/L)
159,06
163,11
163,04
Desviacin
Estndar (g/L)
5,60
1,33
28,69
Ensayo 1
Ensayo 2
4
5
6
5
6
7
92
Promedio
(% V/V)
4,5
5,5
6,5
Desviacin
Estndar (% V/V)
0,71
0,71
0,71
% Alcohol Obtenido
(V/V)
180
200
250
4,5
5,5
6,5
7
%Alcohol (V/V)
6
5
4
3
2
1
0
180
200
250
6.5.2.10. Comparacin
concentraciones
Saccharomyces
para
cerevisiae
silvestre.
Segn
la
33 L de etanol
Ensayo 2
Ensayo 1
Ensayo 2
5
6
7
0,120
0,150
0,180
0,150
0,180
0,210
Alcohol
Terico (L)
0,178
0,218
0,272
Ensayo 1
Ensayo 2
Promedio
67,42
68,81
66,18
84,27
82,57
77,21
75,84
75,69
71,69
94
Desviacin
Estndar
11,92
9,73
7,80
Melaza
(Kg)
0.540
0.660
0.825
Etanol
Obtenido (L)
0,135
0,165
0,195
Etanol
Terico (L)
0,178
0,218
0,272
%
Rendimiento
75,84
75,69
71,69
0,3
Etanol (L)
0,25
0,2
0,15
Etanol obtenido
0,1
Etanol terico
0,05
0
180
200
250
rendimiento alto y disminucin en los costos de la materia prima que la de 200 g/L,
el aumento en el porcentaje de alcohol de esta concentracin justifica el
incremento del costo de la materia prima, teniendo en cuenta que 30 Kg de
melaza tiene un valor de $20.000, conociendo que la diferencia entre estas
concentraciones es de 20 g esto equivale a un aumento de $13,33 de materia
prima. La concentracin de 180 g/L comparada con la de 250 g/L presenta un
rendimiento mayor pero la concentracin de 250 g/L produce dos grados de
alcohol ms que la de 180 g/L con lo cual el aumento en la materia prima que es
de $46,67 es justificado. Como se concluye en el anlisis de la figura 32 la
concentracin ptima para los siguientes ensayos ser de 250 g/L.
(Autores)
Descripcin Macroscpica:
Colonias blancas, cremosas, brillantes, bordes redondos y convexas.
Ensayo 1
Absorbancia = 0.155
Tabla 24. Ensayo 1 concentracin 250 g/L.
Tiempo (h)
0
8
15
24
32
48
56
72
96
Concentracin
(g/L)
242,86
225,11
215,33
168,59
160,98
141,41
111,7
98,66
49,38
Absorbancia
Factores de
dilucin
0,684
0,635
0,608
0,479
0,458
0,404
0,322
0,286
0,15
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
Concentracin de
Azcar (g/L)
50
100
Tiem po (h)
150
Ensayo 2
Absorbancia = 0.186
Concentracin
(g/L)
247,21
234,89
228,01
210,62
195,16
163,51
108,8
85,98
64,6
Absorbancia
Factores de
dilucin
0,696
0,662
0,643
0,595
0,552
0,465
0,314
0,251
0,192
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
Concentracin de
Azcar (g/L)
50
100
Tiem po (h)
98
150
Tiempo (h)
0
8
15
24
32
48
56
72
96
Concentracin
Azcar (g/L)
50
100
150
Tiempo (h)
Como muestra la grfica 42 la concentracin de azcares disminuye con respecto
al tiempo de una manera aproximadamente lineal durante todo el proceso de
fermentacin, por lo que se puede afirmar que la cepa de Saccharomyces
cerevisiae ATCC 9763 tolera porcentajes de azcares superiores a las
concentraciones ptimas (10% - 18% de azcares) en comparacin a la cepa ya
99
100
presentado para el etanol absoluto 1.083 minutos (ver figura 29), y se aleja del
presentado por el metanol absoluto 0.600 minutos (ver figura 30), con lo que
podemos concluir la presencia de etanol en la muestra, tanto por el tiempo de
retencin como por la temperatura de ebullicin del fermento y la ausencia de
otros compuestos orgnicos, puesto que en el cromatograma no se observan
picos importantes y teniendo en cuenta que el detector FID es sensible para este
tipo de compuestos.
(Autores)
Descripcin Macroscpica:
Colonias blancas, cremosas, brillantes, bordes redondos y planas.
101
Ensayo 1
Absorbancia = 0.255
Tabla 27. Ensayo 1 concentracin 250 g/L.
Tiempo
(h)
0
8
15
24
32
48
56
72
96
Concentracin
(g/L)
217,86
204,46
193,22
179,09
170,4
152,64
149,02
103,73
55,18
Absorbancia
0,615
0,578
0,547
0,508
0,484
0,435
0,425
0,3
0,166
Factores de
dilucin
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
Concentracin de
Azcar (g/L)
50
100
Tiempo (h)
102
150
Concentracin
(g/L)
220,76
212,43
203,37
191,41
169,31
152,64
135,25
87,07
50,47
Absorbancia
0,623
0,6
0,575
0,542
0,481
0,435
0,387
0,254
0,153
Factores de
dilucin
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
103
Concentracin
(g/L)
219,31
208,445
198,295
185,25
169,855
152,64
142,135
95,4
52,825
En la grfica anterior se observa que para esta cepa y al igual que la anterior la
cada de los azcares es aproximadamente lineal, esto puede deberse a que esta
cepa es utilizada en la produccin de alcohol, por lo cual se ve que no presenta
fase de latencia durante el proceso de fermentacin si no que entra en fase
exponencial, por lo que durante todo el proceso la cada de los azcares es
104
colonias aisladas.
(Autores)
Descripcin Macroscpica:
Colonias blancas, cremosas, brillantes, hmedas de bordes redondos y planas.
106
Concentracin
(g/L)
232,36
211,7
206,47
199,75
196,49
191,05
190,69
187,43
181,63
81,99
78,01
73,3
Absorbancia
0,655
0,598
0,583
0,565
0,556
0,541
0,54
0,531
0,515
0,24
0,229
0,216
Factores de
dilucin
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
Concentracin de
Azcar (g/L)
50
100
150
Tiempo (h)
Ensayo 2
Absorbancia = 0.203
5
107
200
250
0,665
0,608
0,597
0,571
0,553
0,526
0,515
0,503
0,498
0,245
0,236
0,224
Factores de
dilucin
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
1/4000
Concentracin de
Azcar (g/L)
50
100
150
200
250
Tiempo (h)
108
El tiempo de retencin obtenido para este destilado, fue de 0,983 minutos lo cual
indica la presencia de etanol (ver figura 29) en la muestra puesto que los tiempos
de retencin obtenidos en ambos cromatogramas son similares, as como tambin
se puede descartarse la presencia de metanol puesto que el tiempo de retencin
est alejado del presentado por el metanol (ver figura 30).
Tambin se puede concluir que no hay otros compuestos orgnicos, puesto que
en el cromatograma no se observan picos importantes teniendo en cuenta que el
detector FID es sensible este tipo de compuestos.
Concentracin (g/L)
234,17
213,515
208,905
200,835
195,945
188,335
186,16
182,355
178,55
82,895
79,275
74,75
109
Concentracin
de Azcar (g/L)
50
100
150
200
250
Tiempo (h)
En la grfica anterior se muestra el seguimiento de azcares reductores para los
ensayos realizados en el estudio de la levadura Candida utilis ATCC 9950, como
se observa en la misma y a diferencia de Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 y
ATCC 9080, durante las primeras 96 horas del ensayo los azcares del medio no
haban sido degradados de manera considerable, es decir, que la fase de latencia
de la levadura se prolong hasta las 96 h, tiempo en el cual el proceso de
fermentacin para las otras cepas ya haba culminado; esto puede deberse a que
Candida utilis presenta una fase de latencia ms larga, es decir, que requiere ms
tiempo para adaptarse al medio lo que indica que el tiempo de acondicionamiento
previo a la fermentacin no fue suficiente por lo cual al entrar al proceso todava
estaba cursando dicha fase, a las 96 horas empez su fase exponencial por lo que
los azcares en el medio se degradaron de manera ms rpida y de forma lineal al
igual que para las cepas Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 y ATCC 9080 ,
esto ocurri hasta las 168 horas, tiempo en el cual las levaduras entraron en fase
estacionaria por lo que la cada de azcares en el medio es casi constante, a las
192 horas termina el proceso de fermentacin, puesto que desaparece la espuma,
la produccin de gas, llegando hasta un valor de azcares reductores totales de
110
74.75 g/L en promedio, una concentracin mayor a la presentada por las cepas
anteriores lo cual indica que degradaron menor cantidad de azcar pero
produjeron igual cantidad de alcohol.
Al determinar el Porcentaje de alcohol obtenido para la concentracin de 250 g/L
se obtuvo es siguiente resultado.
Porcentaje de etanol (%v/v) = 8 %
En promedio, la cepa Candida utilis ATCC 9950, produjo un porcentaje de alcohol
del 8 % (V/V), igual al producido por las cepas Saccharomyces cerevisiae ATCC
9763 y ATCC 9080. Probablemete el proceso de fermentacin para estas
levaduras fue frenado por la cantidad de alcohol producida la cual afecta la fluidez
de la membrana de las clulas e inhibe la produccin de algunas enzimas
citoplasmaticas importantes para sus proceso vtales, puesto que al determinar la
cantidad de azcar final en el medio fue de 74,75 g/L, es decir, que todavia tenian
los azcares necesarios para continuar la fermentacin.
Tabla 33. Comparacin consumo de azcares para cada una de las levaduras
estudiadas.
Consumo Total de
Azcares g/L
Microorganismo
Saccharomyces
cerevisiae silvestre
Saccharomyces
cerevisiae ATCC 9763
Saccharomyces
cerevisiae ATCC 9080
Candida utilis ATCC 9950
Ensayo 1
Ensayo 2
Promedio
(g/L)
Desviacin
Estndar (g/L)
183,33
142,75
163,04
28,69
193,48
182,61
188,05
7,69
162,68
170,29
166,49
5,38
159,06
159,78
159,42
0,51
111
La cepa con menor consumo de azcar fue Candida utilis con un valor de 159.42
g/L produciendo con esta cantidad de azcar el mismo porcentaje de alcohol que
las otras dos cepas, adems de presentar la menor desviacin estndar lo cual
indica la reproducibilidad de los ensayos, no obstante se debe tener en cuenta que
esta cepa presenta una fase de latencia ms larga lo cual implica un aumento en
el tiempo de fermentacin. La cepa con mayor consumo de azcares reductores
totales fue la Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, con un valor de 188.05 g/L
en promedio, pero presenta un buen porcentaje de alcohol y un tiempo corto
durante el proceso de fermentacin. Saccharomyces cerevisiae silvestre presenta
un bajo consumo de azcares reductores totales pero un bajo porcentaje de
alcohol, por lo que no es un microorganismo apto para la fermentacin alcohlica.
Para Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080 es la cepa con menor consumo de
azcares y buen porcentaje de alcohol, reuniendo as dos de las caractersticas
importantes para un microorganismo potencial en un proceso de fermentacin
alcohlica.
Tabla 34. Comparacin % etanol obtenido para cada una de las levaduras
estudiadas.
% Alcohol obtenido
(V/V)
Microorganismo
Saccharomyces
cerevisiae silvestre
Saccharomyces
cerevisiae ATCC 9763
Saccharomyces
cerevisiae ATCC 9080
Candida utilis ATCC
9950
Ensayo 1
Ensayo 2
Promedio
(% V/V)
Desviacin
Estndar (% V/V)
6,5
0,71
0,00
0,00
0,00
112
Figura 51. Comparacin % etanol obtenido para cada una de las levaduras
estudiadas.
% Alcohol (V/V)
7
6
5
4
3
2
1
0
Saccharomyces
cerevisiae
silvestre
Saccharomyces
cerevisiae ATCC
9763
Saccharomyces
cerevisiae ATCC
9080
Candida utilis
ATCC 9950
Levadura Estudiada
113
Ensayo 1
Ensayo 2
Promedio
Desviacin
Estndar
66,18
77,21
71,69
7,80
88,24
88,24
88,24
0,00
88,24
88,24
88,24
88,24
88,24
88,24
0,00
0,00
Las cepas Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 y ATCC 9080 y Candida utilis
ATCC 9950 presentan un rendimiento del 88.24 % el cual es bueno para procesos
de fermentacin a escala industrial, y Saccharomyces cerevisiae silvestre presenta
un rendimiento inferior de 71.69 % por no ser una cepa usada en procesos de
fermentacin.
Alcohol Obtenido
(L)
Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 1
Ensayo 2
Alcohol
Terico
(L)
0,180
0,210
0,272
0,240
0,240
0,272
0,240
0,240
0,272
0,240
0,240
0,272
114
Etanol (L)
0,250
0,200
0,150
Etanol Terico
0,100
Etanol Obtenido
0,050
0,000
S. cerevisiae
S. cerevisiae
silvestre
S. cerevisiae
ATCC 9763
ATCC 9080 C. utilis ATCC
9950
Levadura Estudiada
Debido a que el medio mnimo de sales enriquecido con melaza era esterilizado
antes del proceso de fermentacin, se realizaron tinciones a ste encontrando as
115
116
7. CONCLUSIONES
117
118
El tiempo de fermentacin total para Candida utilis ATCC 9950 fue de 192
horas, el doble del presentado para las cepas de Saccharomyces cerevisiae
ATCC 9763 y ATCC 9080 que fue de 96 h, lo cual se debe a que Candida
utilis, tiene una fase de latencia mayor a la presentada por las cepas
anteriores.
Esto la hace menos eficiente en procesos de fermentacin, puesto que 96
horas adicionales generan un aumento en los costos de la produccin lo
cual no es rentable a la hora de realizar una fermentacin a escala
industrial, adems teniendo en cuenta que el rendimiento obtenido para
esta cepa es el mismo que para Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 y
ATCC 9080.
119
8. RECOMENDACIONES
se
recomienda:
120
BIBLIOGRAFA
Briceo, Carlos O., Calero, Claudia Ximena. 2004. Etanol como Combustible para
Vehculos. Carta Trimestral 1 de 2004 CENICAA.
Colombia.
Disponible
en:
http://www.manuelita.com/html/sitio/index.php?view=vistas/es_ES/pagina_219.php
#2
Fajardo C., Erika E., Sarmiento F., Sandra C. 2008. Evaluacin de melaza de caa
como sustrato para la produccin de Saccahromyce cereviseae. Pontificia
Universidad Javeriana de Colombia. Facultad de ciencias Bsicas. Microbiologa
Industrial. Bogota 2008.
Madigan T., Michael, Martinko M., Jhon, Parker, Jack. Brock Biologa de los
microorganismos. Pearson Prentice Hall. Dcima edicin. p: 957-985
Meade P., George. 1986. Manual del Azcar de Caa. Montaner y Simn S.A
Barcelona. p: 305-325
Prescott Cate, Samuel, Cecil Gordon, Dunn. 1992. Microbiologa Industrial. Aguilar
Madrid. p: 110-158
Ros del Risco, Carlos A., Fajardo, Mario, Prez M., Juan Carlos. 2005. Evaluacin
de una cepa de levadura para fermentar diferentes concentraciones de miel Apis
mellifera. Estacin experimental apcola Cuba.
Skoog, Douglas A., Holler, James, Nieman, Timothy A. 2001. Principios de Anlisis
Instrumental. Mc Graw Hill. Quinta edicin. Captulo 27. p: 759.
122
Recursos Electrnicos:
http://www.n-t.ru/tp/nr/mk_p02.jpg. Consultado el 11 de julio de 2009
123
ANEXOS
124
125
126
127
128
129
130
131
132