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Protein As
Protein As
espectrofotmetro
que permita
Este apunte fue tomado como ejemplo de la Universidad de Madrid, Facultad de Qumica pgina web: (http://www.um.es/bbmbi/).
H 2N
CO
NH 2
H 2N
CO
NH 2
CO
H 2N
NH CO NH 2
Biuret
Urea
NH
RC H
O
C
NH
RC H
HN
Cu2+
H CR
C
HN
H CR
Violeta-prpura
Complejo protena-Cu(II)
Para aumentar la sensibilidad de la reaccin del biuret, el complejo protenaCu2+ se hace reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteus, dando una
coloracin azul, con un mximo de absorcin a 650 nm. Esta coloracin se
atribuye a la reduccin del cido fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de
heteropolimolibdeno de composicin no definida, por medio de los residuos
tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las
protenas que forman el complejo con el Cu2+.
Las caractersticas del mtodo son:
La intensidad de la coloracin vara con la composicin de aminocidos
de la protena.
Es ms sensible que el ensayo del biuret. El rango es de 0,1-1 mg/ml.
La modificacin de Hartree incrementa la sensibilidad de 0,015-0,15
mg/ml.
Presenta muchas interferencias.
Complejo
Protena-Cu 2+
AA red.
Complejo
Protena-Cu 2+
AA oxid.
Reactivo Folin
oxid.
AMARILLO
Reactivo Folin
red.
AZUL
Mtodo de Bradford:
Consiste en la formacin de un compuesto de adsorcin de coloracin
azul entre los residuos de aminocidos bsicos de las protenas y el
colorante Azul Coomassie.
Absorbe luz a 595 nm.
El rango de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y
de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estndar).
Absorcin en el ultravioleta:
Las protenas poseen una banda de absorcin a 280 nm como
consecuencia de la absorcin de los residuos de tirosilo y triptofanilo
en esta regin del espectro.
Es un mtodo no destructivo.
El rango de concentracin que se puede determinar depende del
contenido de los aminocidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.
La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a
interferencias.
Mtodos inmunolgicos:
Son mtodos altamente especficos, basados en la reaccin antgenoanticuerpo.
Pueden ser de difusin radial, electrodifusin, precipitacin y
radioinmunolgicos.
Pueden alcanzar sensibilidades del orden de ng/ml.
I
T = ------I0
I
%T =--------- x 100
I0
A = log 1/T
La transmitancia T, se expresa normalmente en el rango de 0-100 %, pero la
absorbancia no tiene unidades y vara de 0 a .
Si 100 fotones de luz atraviesan una cubeta y salen por el extremo de la misma
slo 50, la transmitancia es = 0,5 o del 50 %. Si los 50 fotones atraviesan una
cubeta de las mismas dimensiones, slo saldrn 25, y as sucesivamente. Este
efecto fue formulado como ecuacin matemtica por Bouguer (1729) y Lambert
(1760) segn:
I
-k b
T = ----- = e
I0
Ley de Bouguer-Lambert
Ley de Buoguer-Lambert
Ley de Beer-Bouguer-Lambert
-k b c
T = I/I0 = e
Tubo
(n)
1
2
3
4
5
6
7
8
Albmina
patrn
(mL)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Agua
(mL)
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
Una vez realizadas las medidas, se limpian cada uno de los tubos de
ensayo con escobilla y jabn. Las marcas de rotulador se eliminan
fcilmente por frotacin con el estropajo. Se lava con abundante agua del
grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan en la gradilla
boca abajo hasta el da siguiente para que se sequen.
Obtencin de la recta de calibracin del mtodo de Lowry.
Puesto que el mtodo de Lowry es ms sensible que la reaccin del Biuret, lo
primero que hay que realizar es la preparacin de una solucin de protena
patrn ms diluida. A partir de la solucin de BSA de 10 mg/ml, que se ha
utilizado en la reaccin del Biuret hay que preparar una solucin de BSA de 0,2
mg/ml en agua.
Para ello se siguen la siguientes etapas:
1. Se rotula un tubo de ensayo de 10 ml con BSA 0,2.
2. Con una micropipeta se miden 200 ml de la solucin de BSA de 10
mg/mL y se vierten en el tubo de ensayo rotulado.
3. Con una pipeta de 10 ml, se aaden 9,8 mL de agua destilada al tubo de
ensayo.
4. Se toma una porcin de papel de Parafilm, se quita el plstico que la
recubre y por la parte que estaba protegida, se tapa el tubo de ensayo,
agitndose varias veces por inversin suave del tubo. Es importante que
se consiga una dilucin homognea de la solucin proteica.
Tubo
BSA 0,2
Agua
(n)
1
2
3
4
5
6
7
(mL)
0
0,1
0,2
0,3
0,5
0,7
0,9
(mL)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,5
0,3
0,1
fcilmente por frotacin con el estropajo. Se lava con abundante agua del
grifo y se enjuagan los tubos con agua destilada. Se dejan en la gradilla
boca abajo hasta el da siguiente para que se sequen.
Absorbancia (A)
Rango de linealidad
A
C
Concentracin (C)
Curvas de calibracin
Para comparar dos curvas de calibracin, se requiere medir la bondad del
ajuste de los patrones, De los valores estadsticos el coeficiente de
correlacin es el ms popular. Un valor de +1 indica una relacin lineal
perfecta entre la absorbancia y la concentracin.
Qu es la Sensibilidad?
Qu es el Rango?
Rango es el intervalo entre los niveles superior e inferior del analito, que se
han calculado con la precisin, exactitud y linealidad requeridos.
Rango de linealidad ser por tanto el intervalo entre las concentraciones ms
baja y ms alta de analito determinadas, para las cuales se cumple la ley de
Beer-Lambert.
Las etapas recomendables que hay que realizar para cada uno de los mtodos
son:
Se calcula la concentracin de protena que se ha colocado en cada uno de
los tubos de ensayo.
Como ejemplo: en el ensayo de Biuret, en el tubo 2 se han colocado 0,2 mL
de BSA 10 mg/mL y se han diluido a un volumen de 2 mL con agua. Por
tanto la concentracin de protena en el tubo ser:
(0,2 mL x 10 mg/mL) : 2 mL = 1 mg/mL
En papel milimetrado, se representan los valores experimentales de
absorbancia obtenidos frente a la concentracin de protena estndar
calculada de cada uno de los tubos, para cada mtodo ensayado.
Se ajustan los puntos obtenidos por el mtodo de mnimos cuadrados a una
recta, incluyendo el punto 0,0.
Se representan las rectas ajustadas en el papel milimetrado.
Se desprecian los puntos que se desven de la linealidad en un 5 % (intervalo
de confianza del 95%). Para ello, la absorbancia experimental
correspondiente a una determinada concentracin se compara con el valor
de absorbancia calculado mediante la ecuacin de la recta ajustada, y si
posee un valor superior al 5 % de desviacin se desprecia.
Si se ha despreciado algn punto, se repite el proceso de ajuste,
representacin y desviacin para cada recta.
En el cuaderno de Prcticas debe de quedar reflejada la representacin
grfica de todos los puntos experimentales obtenidos, junto con los de la
recta final ajustada por mnimos cuadrados, indicando los puntos
despreciados.
Igualmente se deben de expresar las ecuaciones de las rectas ajustadas junto
con los valores de los coeficientes de correlacin con cuatro dgitos como
mximo.
Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno
de los mtodos, y sus valores tambin son los correspondientes
coeficientes de absorcin de los complejos protena-reactivo.
Se determinan los lmites de deteccin y de cuantificacin para cada uno de
los mtodos, teniendo en cuenta que en los espectrofotmetros con lectura
digital, las medidas de absorbancia se realizan con una precisin de 0,001.
Igualmente, los rangos de linealidad, en el cual la respuesta de cada uno de
los mtodos es lineal, vendrn dados por los intervalos comprendidos entre
el lmite de cuantificacin y el valor de concentracin ms alta que cumple la
ley de Beer.