La Biologia Celular y Molecular del Aparato de Golgi Cardenas Reygadas Rodolfo (10), Caballero Garcia Maria de Lourdes (4), Ca- fiedo Solares Irma (2), Castro Fernandez Cecilia (6), Cuapio Padilla Pedro (12), De la Chesnaye Caraveo Elsa (6), Delgado Sapién Gabriela (1), Escobar Islas Estanislao (6), Garcia Herrera David (3), Mergold Villasefior Claudia Alejandra (7), Murillo Romero Susana (12), Nieto Camacho Antonio (11), Ramirez Victo- tia Patricia (12), Roa Espitia Ana Lilia (2), Salazar Campos Maria Zayii (5), Sanchez Lozada Laura Gabriela (13), Segura Valdez Maria de Lourdes (3), Sierra Martinez Monica (8), Solis Guzman Maria Gloria (4), Suarez Boado Odalis. Barbara (15), Vega Segura Maria Alicia (1), Villavicencio Guzman Laura (9), Zavala Padilla Guadalupe Trinidad (14), Jiménez Garcia Luis Felipe (14). (1) Facultad de Medicina, UNAM, (2) Instituto Nacional de Pediatria. (3) Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. (4)instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. (5) Instituto de Investigaciones Antropolégicas, UNAM. (8) Centro Médico Nacional S-XXI, IMSS. (7) Insti- tuto de Biotecnologia, UNAM. (8) Hospital Juarez de México, SSA. (9) Hospital Infantil de Méxi- co “Federico Gomez", SSA. (10) ENEP-Iztacala, UNAM. (11) Instituto de Quimica, UNAM, (12) Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, (13) Instituto Nacional de Cardiologia “Iigna- cio Chavez". (14) Facultad de Ciencias, UNAM, (18) Centro Médico Nacional S-XXI, IMSS Fa- cultad de Ciencias, UNAM. Notas para el curso de Biologia Celular Avanzada I, Semestre Escolar 97-1 Maestria en Ciencias, Area: “BIOLOGIA CELULAR” Dr. Luis Felipe Jiménez Garcia Facultad de Ciencias Universidad Nacional Auténoma de MéxicoPresentacion Esta tercera edicién de las notas se realizé durante 1996. Como en la primera y segunda edicién, se elaboraré en el curso de Biologia Celular Avanzada |, que es una asignatura obligatoria del plan de estudios de la Maestria en Cien- cias (Biologia Celular), de la Division de estudios de Posgrado de la Facultad de Ciencias de la U.N.A.M. Esta nueva version toma como punto de partida la edicion anterior y los textos de Biologia Celular y Molecular modernos, asi como también textos cla- sicos. Durante el curso, se presentaron seminarios por parte de los estudian- tes y se impartiod clase por parte de profesor, a manera de introduccién. Posteriormente, se analizaron algunos de los muy abundantes articulos de in- vestigacion inal publicados durante 1995 y 1996 en revistas especializadas con arbitraje internacional. La parte final consistié en resumir la informacion y tedactar una version, en la que, la mayoria de la literatura fuera del afio de 1996. Asi, esta nueva edicién pretende ser, en esencia, una minirevision (mi- nireview) del tema por parte del grupo de Biologia Celular Avanzada |. EI presente escrito, incorpora micrografias electronicas y esquemas origi- nales para ilustrar algunas partes del trabajo. Sin duda, las ediciones posteriores deben mejorar substancialmente el tra- bajo, tanto por la revision de lo aqui escrito, como por la incorporacion de la literatura mas reciente que se produce cada ajio en este tema, que es de unos 600 articulos en promedio, de acuerdo con la informacion proporcionada en current contents y explorada a través de med-line.INDICE RESUMEN 1, INTRODUCCION 2. PRIMERAS OBSERVACIONES DEL APARATO DE GOLGI 3, MORFOLOGIA DEL APARATO DE GOLGI 4, FUNCIONES DEL APARATO DE GOLGI 4.1 GLUCOSILACION 4.2 SULFATACION 4.3 TRANSPORTE 5. MORFOGENESIS DEL AG 6. OTRAS FUNCIONES Y PERSPECTIVAS. 7. APENDICE CUADRO 1 20 20 22 22CUADRO 2 TABLA I TABLA 2 ESQUEMA GLOSARIO MAPA MOLECULAR 8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 23 24 24 25 25 26 27RESUMEN: Elaparato de Golgi (AG) constituye el cen tra de clasificacién en et trifico de protet- nas y lipidos a los lisosomas, vesiculas de secrecién y membrana plasmdtica. Cons- ta de una pita de sacos membranosos apla- nados que se diferencian en sus compartimientos “cis”, intermedio y “trans” y de vesiculas asociadas. En estos compartimientos, las unidades de carbo- hidratos de las glucoproteinas se modifi- can para su distribucién posterior. Deniro de sus principales funciones estan a glu- cosilacién, sulfatacion y trasporte. TRODUCCI En la célula eucarionte existen al menos 2 grandes compartimientos que se relacionan con el flujo de informacin genética propues- to por el dogma Central de la biologia mole- cular: a) ef niicleo y b) el citoplasma. El nticleo esté involucrado en los fenéme- nos de replicacién y control de la expresién genética a nivel transcripcional y postrans- cripcional. El citoplasma interviene en los mecanismos de control genético a nivel tra- duccional y pos-traduccional. Durante la traduccién, participan al menos 2 tipos de ribosomas en la sintesis de proteinas: a) ri- bosomas libres que no se unen a membranas y que sintetizan proteinas que permanecerén en la célula y, b) ribosomas unidos a mem- branas, que formaran muchas de las lla- madas proteinas de exportacién. En el reticulo endoplismico rugoso (RER) se pro- ducen las proteinas que, por la presencia de un péptido seffal, se internalizan en el lumen y pasan entonces al compartimiento celular inmediato, que es el aparato de Golgi. En ambos compartimientos membranosos ocu- rre una serie de glicosilaciones que modi- fican a esas proteinas postraduccionalmente, PRIMERAS OBSERVACI! DEL APARATO DE GOLGI En 1898 el microscopista Camillo Golgi (1843- 1926), médico y citélogo, realizé in- vestigaciones sobre la estructura del siste- ma nervioso y desarrollé una tincién especial de plata, que le permitié descubrir unas es- tructuras en el citoplasma de las células nerviosas. Estas pequefias estructuras ha- bian sido observadas por Santiago Ramén y Cajal, quién utilizé una técnica pareci- da, pero no la reporté porque no fue re- producible. En un comunicado elaborado por Golgi: “Sur la structure des cellules nerveuses” (Golgi, 1898), el autor describe la exis- tencia de una pequefia estructura intrace- lular en forma de pequetias placas, hilos y puntos, y reporta que esta estructura es di- ferente en cada tipo de célula nerviosa que estudié. Ademdas de ello, Golgi hizo pre- paraciones de células de la fascia dentada del hipocampo, de las células de Purkinje en el cerebelo, de ganglios intervertebra- les y varias mas. Las mejores observacio- nes las logré en células de Purkinje del cerebelo del tecolote Strix flammea (en la actualidad Asio flammeus). La descripcién que hize Golgi fue la siguiente: “El aspecto caracteristico de este apara- toreticular interno puede deberse fun- damentalmente a la forma de listén y sus ramificaciones, al modo en que éstos se di- viden y anastomosan sobre si mismos (espe cialmente en las células grandes, en donde se observa un trayecto netamente tortuoso), a la presencia de este aparato de plaquitas finas 0 de discos pequefios redondeados y transparentes en el centro y, en fin, al color especial, amarillento que toman las ramifi- caciones por efecto de la reaccién. Sin em- bargo, el aspecto ms caracteristico del aparato resulta de su organizacién en con- junto: en tanto que estdé netamente limitado hacia el exterior, a tal punto que, como ya loindiqué, la zona de la sustancia celular com- prendida entre el limite mismo del aparato y Ja superficie de la célula aparece perfecta- mente libre en forma de un borde claro y re- gular, hacia el interior; por el contrario, las ramificaciones de la red se pierden en dife- rentes planos. Las ramificaciones provenien- tes del plano periférico, en parte se presentan como expansiones cortas que se terminan en abultamientos finos piriformes, en parte tam- bidn formando los abultamientos. Los discos pequeiios nodales ya indicados, las cuales, sin embargo, representa de alguna forma, el centro de donde emanan‘ otras ramificacio- nes mas finas que se unen a ramificaciones provenientes de otros puntos, caracterizan- do la verdadera estructura reticular” (Fi- gura 1). Figura 1. Appareil Réticulaire Endocellulaire (Golgi C. 1898. Sur la Structure des cellules Nerveu- ses, Arch. Ital, Biol. 30: 60-71) Mas adelante Golgi detalla la técnica que utilizd para evidenciar esta estructu- Ta. “Para obtener !a reaccién localizada del revestimiento periférico de las células ner- 10 viosas, utilicé casi exclusivamente el méto- do rapido, que consiste en el endurecimien- to de los trozos de tejido nervioso con la mezcla osmio-bicrémica (solucién de bicro- mato de potasio al 3%, 2 0 3 partes, solucién de deido ésmico al 1%, una parte) y en el paso sucesivo de las piezas en las solucio- nes de nitrato de plata al 0.75 o al 1%. En especial, hay que hacer ensayos sucesivos para encontrar el tiempo mas adecuado para la reaccién especial,” (Golgi, C. 1898). Durante mucho tiempo se dudé de la existencia de esta estructura hasta que, en la década de 1950 a 1960, la microscopia electronica despejé las dudas y se demos- trd que el aparato de Golgi esta presente en todas las células. Su estructura basica es de una o varias pilas de sacos delgados y aplanados, asociados con vesiculas. Con el desarrollo de nuevas téenicas, se pudo afinar més el conocimiento acerca de la estructura y la funcién del aparato de Gol- gi. Actualmente, se puede definir al AG como una estructura dinémica que esta en intima relacién con el reticulo endoplasmic. 3. MORFOLOGIA DEL APARATO DE GOLGI El AG es una estructura polarizada que esta formada por uno o més apilamientos de s4- culos 0 membranas aplanadas en forma de disco, de superficie lisa Ilamados cisternas, que en conjunto, constituyen una estructura que recibe e] nombre de dictiosomas o pilas. Los dictiosomas tienen dos caras : una inter- na o Cis, y una externa o Trans. Una region de saculos en posicién entre ambas caras constituye la region media. La porcién mas externa del lado cis se denomina red cis Golgi (CGN) y la cara mds externa del lado trans la red rrans Golgi (TGN). La interfase entre el RE y el AG, rica en vesiculas es llamada la zona intermedia, En 1974 Rarnbourg er al, por medio de anilisis estereosedpico de eé- lulas ganglionares espinales, observaron queentre las regiones cis y trans existe una sec- _conectan a regiones de seleccién denomina- cién media formada por saculos fenestrados. das redes cis y trans respectivamente. El es- Las cisternas cis como las trans, a su vez se Figura 2a, Micrografia electrénica del aparato de Golgi (AG) de una célula animal (notocorda de embrian de pollo, Gallus domesticus, 50 000 X). Reticula endoplasmico rugoso, RER. Figura 2b. Micrografia electronica del Aparato de Golgi (AG) dc una célula de planta (epitelio de fruto de papaya, Carica papaya, 50 000 X), Pared Celular, PC. pacio que existe entre cada cisterna es de tar interrumpide por fenestraciones (Bloom aproximadamente 150 A. En cortes longitu- xy Fawcett, 1975) (Figuras 2a y b). dinales se aprecia como las cisternas se es- trechan en su porcién central y se dilatan Con el empleo de microscopia de alto hacia los extremos donde su perfil puede es- voltaje se observé en células de ganglios iespinales que la estructura tridimensional del AG es como una red perinuclear externa, formada por listones anastomosados y rami- ficados, los cuales, por medio de andlisis estereoscépico, s¢ encontré que son hetero- géneos a lo largo de las regiones saculares y que alternan con regiones tubulares no com- pactas que forman puentes (Figura 3). (CARA TRANS DEL GOLG! VESICULA DE J SECRECION ° Luz Det. ‘GOLGI VESICULAS RODEA- DAS DE COP'S Y CLATRINA PROVE- NIENTES DEL RER, Figura 3. Esquema tridimensional del aparato de Golgi. Las cisternas estan rodeadas por una zona de la cual se excluyen otros orgénulos; sin embargo, pueden observarse algunos ribo- somas libres en la periferia. Existe una con- tinuidad entre la interfase del RE y la red cis Golgi en forma de vesiculas y tubules. Una gran diversidad de estudios ha indi- cado que el AG no tiene una compasicién uniforme desde un extremo de la pila al otro. ‘Con algunas excepciones, las membranas de Ja cara externa son considerablemente mds delgadas que las de la cara interna, las dife- rencias de grosor oscilan entre $0 a 60 A semejantes alas observadas en el RE. La red trans Golgi (TGN) cuye papel en Ja clasificacién y seleccién de derivados vesiculares en el AG, es ahora claro, puede estar formada por redes de tabulos membra- nosos 0 por una red tubular residual peque- 12 fia 0 tibulos ramificados, Este sistema de redes es una estructura dindmica que estd dada por la estrecha interaccién estructural del Golgi con microtubulos del citoesquele- to. La formacién de los tébulos parece estar mediada por proteinas citosdlicas, pues, se encontré un complejo de una proteina de 40 kDa, esociada a otras proteinas de aproxi- madamente 30, 60 y 80 kDa que parecen participar en el proceso (Banta, 1995). Saraste et al. (1995) proponen la existen- cia de un sitio de transicién entre el RE y AG denominado pre-Golgi. Esta regién pre- senta una morfologia variada entre los dife- rentes tipos de células. Se ha descrito que la funcién de esta regién es capturar y regresar a las proteinas residentes del RE con pépti- do sefial (KDEL) que escapan hacia el AG. Itin e# al, (1995) han sugerido la bidireecio- nalidad del tréfico que ocurre entre el com- partimiento intermedio y el reticulo endoplismico, y entre el compartimiento in- termedio y el aparato de Golgi, baséndose en evidencias bioquimicas y morfoldgicas que apoyan la existencia de esta regién in- termedia con identidad propia. Varios autores han descrito una intima interaccién estructural entre Golgi y los mi- crotiibulos, y el trénsito vesicular hacia este compartimiento. Se ha observado que la formacién del AG tiene lugar por la formacién de vesiculas de superficie lisa que previamente han suftido una gemacién del RE. Estas vesiculas se fusionan para formar la cisterna cis, que a menudo recibe el nombre de cara de madu- racién, Las vesiculas membranosas deriva- das del extremo cis de la pila, son diferentes a las del extremo trans. (Bloom y Fawcett, 1975) En un estudio reciente realizado en ente- rocites de pollo (Fath, 1995) se aislaronmembranas de Golgi que presentaron carac- teristicas bioquimicas de cisternas y de la TGN. Empleando técnicas de microscopia electronica, de inmunofluorescencia ¢ inmu- notransferencia, observaron que la dineina y lamiosina | se encontraban asociadas a mem- branas de Golgi. La miosina 1 se observé en todas las membranas de la fraccién del Gol- ai y la dineina se encontré en aquellas con caracteristicas de TGN. Ambas proteinas se unen a los microtubulos (MT’s) en forma dependiente de ATP. Con base en estos re- sultados, se propone que la dineina mueve a Jas membranas del Golgi junto con los MT’s ala corteza celular a través de un citoesque- Jeto rico en actina, donde la miosina 1 facili- ta la liberacién local de vesiculas de la membrana rans. Warren ef al. (1995) propusieron un mo- delo con dos rutas mediante el cual, el apa- rato de Golgi puede desensamblarse durante Ja mitosis. La primera ruta, con formacién de vesiculas recubiertas de COP’s, contintia durante la mitosis pero con inhibicién de su transporte (fusién heterotipica). La segunda Tuta que incluye la formacién independiente de COP’s, en el cual se da la fusién homoti- pica o reparadora de fenestras no funciona ocasionando la formacién de tibulos. Yamamoto (1995) reporta que existen diferencias sexuales en la morfologia de AG en hepatocitos de rata, hallazgo que demos- traron empleando un anilisis tridimensional por microscopfa electronica. Menciona que Ja morfologia de este organelo varia en ta- majio entre hembras y machos, siendo me- nor en éstos. 4.1 GLUCOSILACION, La glucosilacién es una modificacién pos- traduccional de los residuos de aspargina (Asn) que forman parte de las secuencias Asn-X-Thr y Asn-X-Ser en proteinas de se- crecién y de membrana tanto de procarion- ‘tes como de eucariontes (Alberts er ai/.1994), En general se acepta que el AG tiene una funcionalidad compartimentalizada, debido aque se han determinado algunos de los pro- cesos en lugares especifico. Asi mismo, se ‘han encontrado algunas proteinas propias del AG. Lo anterior es apoyado por el trabajo de Lahtinen er al, (1996) quienes reportaron uuna proteina de 58 kD que esta presente en la regién cis-Golgi y cuya funcién no ha sido establecida; la secuenciacién del gene reve- 16 la existencia de una regién transmembra- nal a través de la cual la proteina se puede integrar a la membrana. Las diferencias fun- cionales entre las subdivisiones cis, media y, trans del AG fueron descubiertas por lo- calizacién de las enzimas involucradas en el proceso de los oligosacdridos N-unidos en distintas regiones del organelo (Alberts et al 1994) Asi, la eliminacién de manosas ocu- ‘tre en las regiones cis y media, la adicién de N-acetil-glucosamina (GleNAc) en la region media, la adicién de Gal en la region trans y la adicién de N-acetil-neuraminico (NANA) enel TGN. Sin embargo, no es claro si cada proceso realizado por cada enzima diferente es completamente restrictivo a una cisterna en particular o si la distribucién es graduada através de los sacos de Golgi, por lo que las enzimas de accién temprana estarian presen- tes principalmente en la cisterna cis y, las enzimas de accién posterior principalmente en la cistenia trans, sin exclusividad en los compartimentos diferentes (Alberts ef al. 1994), Sin embargo Mirazimi er ai. (1996), dan evidencia de la restrictividad enzimdtica a través del efecto que produce la brefeldina ‘A (BFA) en el procesamiento de una gluco- proteina de la cdépside de un rotavirus y de ‘una proteina propia del RE, pues la BFA cau- sa un reciclamiento dé las enzimas de la par- te cis/medio del AG provocando una endo H resistencia, detectada para la proteina viraly no para la del RE, lo que sugiere, por un lado, la glucosilacién por vias diferentes (en diferentes compartimientos del AG) y por otro, la importancia de la adecuada glucosi- lacién para la funcién bioldgica normal (dis- tribucién de infectividad y de produccién de progenie, acumulacién en RE, modificacién de movilidad electroforética). Los dominios transmembranales sencillos (TMDS) presentes en las enzimas residentes para la glucosilacién en Golgi sirven para que dichas proteinas no se muevan més all4 del aparato de Golgi. Existen dos teorias en las que se propone, por un lado que estos TMDs se asocian en forma oligomérica en Golgi . Otra teoria dice que estos dominios median la segregacién lateral de las enzimas entre dominios lipidicos. La construccién del complejo de oligo- sacdridos unidos a N (aspargina) requiere de una accién secueneial de enzimas localiza das en diferentes partes del AG. La al,2 manosidasa (Mann I) continta el arreglo de Jos residuos de manosa comenzado en el RE, se deja un nticleo de pento-manosas al cual se agrega GIcNAc por la B-1,2-N-acetilglu- cosaminatransferasa 1 (NAGT 1). La al,3- 1,6-manosidasa II (Mann II) remueve dos residuos mas de manosa permitiendo 1a adi- cién final de GleNAc por la B-1,2-N-acetil- glucosamina transferasa I]. Cada rama dela molécula puede ser elongada por la adicién de galactosa (Gal) por la B-1,4-galactosil- transferasa (GAIT) y dcido sidlico (NANA 0 SialyIT) por la o-2,6-sialiltransferasa (ST) (Rabouille et al. 1995) Munro (1995) utilizé mutantes en los dominios de retencién de la sialil transfera- sa(ST) y observé que el dominio luminal mds que los TMDs son los que permiten el reco- nocimiento por parentesco, aceptando por lo tanto, el modelo de seleccién lipidica y que la eficiencia en la retencién de la ST esta relacionada con la longitud del TMD. Rabouille ef a/. (1995) observaron la dis- tribucién de la NAGTI, Mann Il, GalT y ST con técnicas de inmunomarcado de criosec- ciones de células HeLa y encontraron que NAGTI ¥ Mann Il estaban en la zona media y trans y que GALT y SialylT se encontra- ban en trans y TGN, por lo que observaron que no hay exclusividad en la ubicacién de las enzimas, sino que se da un sobrelapamien- to ensu distribucién, no obstante lo anterior no significa que todas las enzimas sean acti- vas alo largo de todo el Golgi. Se ha repor- tado una sialoglucoproteina (MG-160) de membrana que se encuentra en la cistema media del AG de neuronas de rata, la cual contiene 5 sitios potenciales de glucosila- cién, Las evidencias funcionales muestran que la MG-160 participa en sefiales de trans- duccién y no se ha encontrado homologia con otras enzimas y proteinas de membrana del ‘AG (Gonatas, 1995). La adicién de oligosacaridos mediante uniones de tipo N no son las anicas modifi- caciones que sufren las proteinas a su paso a través del Golgi. Algunos azicares son adi- cionados en los grupos OH de determinados residuos de serina 0 treonina de la cadena. Esta 0-glucosilacién es mediada por una se- rie de enzimas glicosil transferasas (N-acel- til-galactosaminiltransferasas) que utilizan nucledétidos de azticares en el lumen del apa- rato de Golgi para adicionar uno a uno resi- duos de azticares a una proteina. La N-acetilgalactosamina es adicionada prime- ro, seguida por un numero variable de resi- duos de azicar que van desde unos cuantos hasta 10 0 més (Alberts et al.,1994) La O- glucosilacién realizadaen el aparato de Golgi es a tal grado secuenciada en la adicin de los azicares, que en algunos trabajos la uti- lizan para hacer un seguimiento de proteinas desde el RE hasta el AG y la TGN (Locker et al. 1995), La manosidasa esté presente en la cister- na media/trans en la mayorfa de las células,