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Guia 2
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GUA N 2:
MICROSCOPIA I
INTRODUCCIN
Las clulas son las unidades bsicas de los seres vivos. La mayora de ellas son de pequeo
tamao por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su
visualizacin. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 m) o
sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos lneas separadas por
1mm de distancia; si hay dos lneas a 200 m de distancia, veremos una sola lnea. Los
microscopios se utilizan para mejorar la resolucin.
El trmino clula fue usado por primera vez cuando Robert Hooke observ un trozo de
corcho en un microscopio de luz en 1665. Luego, Antony van Leeuwenhoek observ en
1670 varios tipos de clulas y finalmente, fue en 1838 cuando Matthias Schleiden y
Theodor Schwann propusieron a partir de sus observaciones microscpicas de diversos
tejidos la teora celular Todos los organismos estn compuestos de clulas, y todas las
clulas provienen de la divisin de otras clulas preexistentes. Estos descubrimientos
dieron as origen al nacimiento de la biologa celular contempornea.
Las clulas son muy pequeas y adems son traslcidas lo que hace imposible su
observacin por ojo humano desnudo. Es por eso que el microscopio ha sido y es una de las
herramientas ms utilizadas en biologa. El progreso en la construccin de nuevos
microscopios, as como el desarrollo y uso de nuevos mtodos de fijacin, corte y tincin
han permitido una serie de descubrimientos en los campos de la histologa, citologa y
bacteriologa, permitindonos entender cada vez con ms claridad la estructura de la clula
y su organizacin, lo que es una importante ayuda para la comprensin de su
funcionamiento.
FORMACIN DE LA IMAGEN
La luz posee una naturaleza dual y puede ser entendida al mismo tiempo como una
partcula y como una onda. La comprensin de este comportamiento, as como de algunas
caractersticas de la luz, es importante para entender el proceso de formacin de la imagen
en un microscopio, y cmo manejando ciertos parmetros fsicos podemos obtener
imgenes ms ntidas y de mayores aumentos.
La luz posee una determinada longitud de onda y viaja en el espacio con una determinada
velocidad. Cuando la luz llega a una superficie que separa dos medios transparentes una
parte de ella se refleja volviendo por el mismo medio en que se propagaba, y otra parte en
cambio es refractada, penetra en el segundo medio y cambia su direccin y velocidad. Esto
ocurre cuando la luz llega por ejemplo a una lente. Si sta es convergente, los rayos se
juntan en un punto, el que corresponde al foco. La distancia entre ese punto y el centro de la
lente es la llamada distancia focal.
Como ya vimos, la velocidad de la luz es diferente en el vaco que en otros medios. Esta
diferencia de velocidad puede compararse mediante el ndice de refraccin que corresponde
al cociente entre la velocidad de la luz en el vaco y la velocidad de la luz en un medio
determinado en el que sta incide.
Mientras ms se acerca un objeto al ojo, ms detalles de l pueden ser distinguidos, pero
hay una distancia lmite a la que se pueden acercar los objetos, y sobre esa distancia, ya no
se distinguen los objetos con claridad, y se hace necesario el uso de lentes o lupas para
aumentar el objeto en estudio. El aumento de una lente est dado por el lmite de cercana a
la que pueden llevar los objetos en el ojo humano y por su distancia focal. Si se quiere
aumentar an ms una imagen, se pueden colocar dos lentes en serie (objetivo y ocular en
el caso de los microscopios compuestos), y el aumento final logrado ser entonces el
producto del aumento de cada uno de ellos.
Si tiene en un microscopio un objeto a observar, los rayos de luz reflejados o emitidos por
el objeto que se sita fuera de la distancia focal de un lente (objetivo) al pasar por el objeto
son refractados y enfocados en un plano que se ubica ms all de la cara opuesta de la lente
obtenindose una imagen real que es invertida y de tamao distinto (mayor) al del objeto
original. A medida que el objeto se acerca al foco la imagen obtenida es ms grande.
Lente
Plano focal
FIGURA 3. Formacin de la imagen en una lente simple.
Microscopio electrnico: La luz se reemplaza por un haz de electrones que se
obtienen al calentar un filamento en un tubo al vaco. Estos electrones son desviados en un
campo electromagntico que cumple la funcin de condensador, y concentrados en el plano
donde se coloca el objeto. Al pasar a travs del objeto, los electrones son parcialmente
deflectados; el grado de deflexin de ellos depende de la densidad electrnica de la
muestra. Debido a la baja densidad electrnica de las muestras biolgicas, para aumentar el
contraste de las muestras se usan metales pesados que aumentan la interaccin de sta con
los electrones incidentes. Despus de pasar por la muestra, los electrones se colectan en un
objetivo donde se forma la imagen, sta se ve finalmente sobre una pantalla fluorescente, o
en una placa fotogrfica.
Las imgenes logradas en este tipo de microscopio son siempre en blanco y negro, y las
zonas ms oscuras corresponden a zonas de mayor densidad electrnica en la muestra. Su
poder de resolucin es del orden de 4 A, y permite lograr aumentos de hasta 1.000.000 de
veces. Sin embargo, una desventaja es que se necesitan cortes extremadamente finos y las
muestras deben someterse a procesos de preparacin (deshidratacin) antes de ser
colocadas al vaco para ser observadas.
ACTIVIDADES PRCTICAS
ACTIVIDAD N1: Clculo del aumento y lmite de resolucin del microscopio.
La funcin principal del microscopio es aumentar la resolucin, la cual nos permite
observar detalles de los objetos que no es posible ver con el ojo humano. Al aumentar la
magnificacin, el tamao observado del objeto, tambin debe aumentar la resolucin; de
otro modo, veramos slo una imagen de gran tamao pero sin nitidez.
El poder de resolucin de un microscopio se define como la capacidad que permite hacer
perceptible por separado, dos puntos situados muy prximos entre s en el objeto. Esta
capacidad est determinada por la apertura numrica (NA) de la lente, siendo directamente
proporcional a sta, e inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada ().
Poder de resolucin =
NA
0,61 *
Lmite de resolucin =
0,61 *
NA
Teniendo claros estos conceptos, podemos comenzar el estudio de los componentes del
microscopio, para llegar a calcular el aumento de las imgenes y la distancia mnima que
podemos llegar a distinguir al realizar una observacin en un microscopio compuesto.
Procedimientos y observaciones
1. Observe cuidadosamente los distintos componentes del microscopio que le ha sido
asignado. Comprelos con el esquema que fue entregado en la gua, y asegrese de
comprender la funcin precisa de cada uno de ellos antes de comenzar cualquier
observacin microscpica.
2. Anote el poder de aumento y apertura numrica de los lentes objetivos. Estos valores se
encuentran en la parte cilndrica o can de los lentes.
Aumento (X)
Apertura Numrica (NA)
1,0
1,3 - 1,5
Procedimientos y observaciones
1. Tome el trozo de cebolla que le ha sido entregado, y corte un trozo pequeo del tejido
en forma transversal. Levante cuidadosamente el epitelio de la cebolla y tire de l hasta
obtener un trozo adecuado de tejido que le permita realizar una buena observacin
microscpica. Si el trozo que usted cort es demasiado grande, crtelo para darle un
tamao adecuado.
2. Coloque una gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta
Pasteur con gotario o una piceta.
3. Sobre la gota ubique un trozo de catfilo de cebolla de tamao adecuado para que pueda
ser cubierto posteriormente por el cubreobjetos. Su muestra debe quedar completamente
cubierta por el agua.
4. Ponga una gota de azul de metileno a un lado de su muestra e incline el portaobjetos de
tal modo que el colorante baje por capilaridad hasta atravesar el tejido. Limpie el
exceso de colorante con un papel absorbente.
5. Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y
colquelo en un ngulo de 45 sobre el portaobjetos. Deslcelo hasta ponerlo en
contacto con la muestra de catfilo de cebolla y djelo caer gradual y lentamente sobre
ella. Trate de evitar la formacin de burbujas de aire pues interferirn con su
observacin.
6. Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar
pelusas sobre el cubreobjeto.
7. Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo10X y prosiga
aumentando gradualmente el aumento.
8. Realice en su informe un dibujo esquemtico del tejido de la cebolla antes y despus de
la tincin, describiendo brevemente lo observado.
BIBLIOGRAFA
Introduccin a la biologa celular 2a. ed. Alberts, Bruce, 1938. 2006.
Biologa celular y molecular 4a. ed. Lodish, Harvey. 2002.
Biologa celular y molecular de De Robertis. De Robertis, Eduardo M. F; 2000.