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    > Investigacién Quimica “Ingenieria de tejidos”: contribucion de los polimeros al desarrollo de los procesos de regeneracion tisular Julio San Roman’, Alberto Gallardo’, Blanca Vazquez’, Antonio Lopez Bravo’ “Instituto de Ciencia y Tecnologia de Polimeros, CSIC. Juan de la Cierva, 3 - 28006 Madrid *Hospital Provincial de Avila. Jestis del Gran Poder. Avila a Ingenieria de Tejdos "Tis sue Engineering” constiruye una disciplina_relativamente nueva y un campo de inves- tigacion y desarrollo interis- iplinario que aplica los conocimientos de la bioingenieria, ciencias de la vida, cquimica,fisica y biologia, para resolver problemas clinicos y quirirgicos aso- ciados a la pérdida de tejido 0 al fallo funcional de Grganos (1). Aprovecha los principios de ingenieria de trans- pore, fendmenos de reacciones super- ficiales, asi como métodos de andlisis aplicados a los complejos procesos biolégicos que se suceden en el desa- rrollo y reparacién de tejidos biolégi- cos, Para ello, es necesatio el conoci- miento de la estructura molecular de sustratos y su relaci6n con las reaccio- nes bioguimicas que se producen. las especies normalmente implica- das en la ingenieria de tejidos son células vivas, asi como sus componen- tes extracelulares que par- ticipan en el desarrollo de dispositivos que permitan y estimulen 0 favorezcan la reparacién o restaura- ci6n de un Grgano 0 tejido dafiado (2,3). La idea de uilizacién de sustitutos de componentes 0 tejidos biologicos para reparar 0 reemplazar elementos dafiados es tan antigua como la historia misma Existen referencias descr tas en tratados de medicina con mas de 4000 afios de antigiedad, pues médicos especialistas de la antigua India ya describéan el uso de diversos ‘materiales para el tratamiento de diver- sas alteraciones faciales (1). a regeneraciOn y la sustitucién de tejidos no funcionales se desarrollan en base a estrategias que emplean como medio algin sistema polimérico, J sea de origen natural 0 ‘Blanca Vinquer artificial, siendo las de mayor importancia las siguientes (4) ~ Sustitucién con mate- riales tanto bioestables como biodegradables, de origen natural o sintétic. Algunos ejemplos con muchos afios de aplicacién son las valvulas cardiacas de disco oscilante recu- biertas con una capa de Jule Sen Romi Alberto Gallardo grafito, que presentan une superficie perfectamente pulida en contacto con la sangre, o injertos vasculares de Goretex (politetraluoretileno poroso) 0 de Dacron (polieilen tereftalato tej- do 0 trenzado) que constituyen vasos sanguineos artificiales y que sirven como soportes que, en circunstancias favorables, pueden proporcionar el medio adecuado para la formacion de tuna capa intima de células endoteliales Y reproducir con ello la situacién natu- nal del tejido no dafiado, ~ Xenoinjerts obtenidos @ panir de tejidos animales, que se tratan quimi- camente para estabilizarios y evitar en lo posible las reacciones inmunolégi- cas propias de cuerpos extrafios. Un ejemplo claro de ello son las valvulas a6mticas de tejdo porcino tratadas con glutaraldehido ~ Encapsulaci6n de células en céma- 1a de difusién, microcapsulas 0 sustra- 2000 Segundo Epeca, EnetoMor Ancles deka Real Sociedad Espafola de Qu > Investigacién Quimica En este articulo pretendemos presentar los principios de disefio y el desarrollo de sistemas poliméricos que en la mayoria de los casos han de utilizarse para conseguir una regeneracion tisular, ya sea mediante el cultivo celular o mediante la aplicacion de sistemas en el propio organismo humano, o la aplicaci6n eficaz de estimulantes o factores de crecimiento, de enorme importancia en los procesos de regeneracion tisular. tos reabsorbibles. Un ejemplo claro es el cultivo de condrocitos para reparar tejidos osteocondrales de ariculacio- nes, 0 el cultivo de osteoblastos para regeneracion de tejdo 6seo. Aplicacién ‘in situ" de sustancias espectfcas conocidas como factores de crecimiento que en combinacién con un soporte adecuado puedan uitlizarse como sistemas de vectorizacién y de dosificacién controlada en zonas del igre I: Factores mas importantes que afectan al carter biocompatble de materiales. organismo humano donde son necesa- fios, Existen muchos ejemplos de estos sistemas, como la aplicacion del factor TGF-B en combinacién con colégeno que estimula notablemente los proce- 05 de cicatrizacién de heridas y que- madura, En este articulo pretendemos presen- tar los principios de disefio y el desa- rrollo de sistemas poliméricas que en Ja mayorta de los casos han de utilizar- se pata conseguir una regeneracion tisular, ya sea mediante el cultivo celu- lar 0 mediante la aplicacién de siste- mas en el propio organismo humano, o la aplicacion eficaz de estimulantes 0 factores de crecimiento, de enorme importancia en los procesos de rege- neraci6n tisular. Desde un punto de vista puramente estructural, todo sistema que deba uti- lizarse como soporte para conseguir ‘un crecimiento celular tridimensional y aprovechar los productos que las pro- pias células generan para ir recompo- niendo un entramado tisular, es decit la matriz extracelular, debe tener unas caracteristicas especifi- cas que son esenciales para conseguir las fun- ciones de nutricién celular, divisi6n y mul- tiplicacién, generacién, ordenacién y consoli- dacion de tejido. Estas caracteristicas son menos rigidas cuando se trata de aplicar "in vivo" sistemas que activen la regeneracion tisular en el propio individuo, mediante et aporte de los factores de crecimiento. En cual- quier caso, existe una premisa que se considera hoy dia necesaria y es la dualidad Biocompatiildad - Biodegra- Gabilidad, Como muestra el esquema Ge la Figura 1, la biocompatibilidad est muy relacionada con la actividad superficial, pues de ello depende que €l sistema polimero/células/matriz, extracelular, 0 el sistema polimero/fac- tor de crecimiento sea aceptado 0 rechazado por el receptor. Ademis de clio, cualquier diseto debe presentar buenas caracteristicas biofuncionales pues como soporte debe ofrecer la suficente estabildad ¢ integridad para mantener unas condiciones optimas del proceso regenerativo, pero junto a ello debe poseer un caracter biodegra- dable de tal forma que cuando se ha logrado un entramado celular adecua- do, es decir una vez cumplida su isin de soporte, debe desaparecer por biodegradacién 0 por bioreabsor- cién. En este sentido es fundamental conocer los mecanismos biodegradat- vos que conducen a la desintegraciéa del polimero soporte, asi como la naturaleza de los productos que se ‘generan como consecuencta del proce- 50 degradativo junto con los efectos tanto a nivel local como a nivel sisté- mico que puedan provocar,y las vias de eliminacién del medio en donde se aplican HistOricamente, los biomateriales poliméricos utilizados como soportes, matrices 0 andamiajes, fueron obteni- dos a pani de fuentes de origen natu- ral, tales como colageno, gelatina, seda, algodén y derivados de almidén, El desarrollo de la Quimica Macromo- lecular contribuyé @ conseguir lo que se llamé primera generacion de poli- eros biomédicos. La utilizacién de materiales poliméricos tales como el polietileno, politetrafluoretileno, algu- nos polimeros actlicos, poliésteres de la familia del politerefalato de etilen alicol, poliamidas, poliuretanos, 0 cau- chos de silicona, fue consecuencia de una adaptacién de materiales de uso muy generalizado en la década de los 50 y 60, més que producto del desa- ollo de polimeros especificamente disefiados para aplicaciones médico- quirirgicas. Sin embargo, durante algGn tiempo han demostrado su utli- dad y sobre todo su necesidad como soportes en los procesos de regenera- cidn tisular y en los de crecimiento > Julio San Romén, Alberto Gallardo, Blanca Vazquez, Anionic Lépez Bravo celular, Su caricter no biodegradable oblig6 a desarrollar nuevos sistemas que permitieran oftecer esta cualidad de tal forma que la investigacion y desarrollo en este campo esti en actualidad muy dirigida hacia la prepa~ racién y utlizaci6n de sistemas biode- gradables, teniendo en cuenta las caracteristicas esenciales que se han ‘mencionado anteriormente. El poten- cial de los materiales poliméricos bio- degradables fue reconocido ya en la década de los 60 cuando diferentes sis- temas de alto peso molecular prepara- dos a base de poli(acido lactico), politécido glicélico) y copolimeros, demostraron buenas propiedades y adecuada respuesta "in vivo" sobre todo en aplicaciones como hilos de sutura multifilamento reabsorbibles (5,6). Asi mismo, varios materiales de rigen natural como algunos tipos de colgeno y combinaciones de ellos con ‘Acido hialurénico, y derivados de quitosano, estén demostrando su efica- cia en el disefio y desarrollo de siste- mas soporte de pieles artficales de excelente comportamiento en grandes quemados, asi como en soportes para regeneracién “in situ’ de nervios peri féricos (7,8). El potencial desarrollo de este apasionante campo es enorme, con frecuencia se pueden encontrar espectaculares referencias en los medios de comunicacién social, ya sea prensa escrita, radio o televisién, en donde es cada dia mis frecuente encontrar noticias relacionadas con la regeneracién de tejidos y érganos hhumanos, ofreciendo esperanzas pro- metedoras a un buen niémero de pacientes y afectados cuya calidad de vida puede verse mejorada sensible- ‘mente, No obstante, es necesario ser sensatos y considerar que estamos asistiendo a la infancia de la ingenieria tisular, y que al margen de las noticias espectaculares, es necesario desde un punto de vista cientifico ajustase a los planteamientos razonados de un desa- rrollo congruente con el comporta- miento de los nuevos biomateriales poliméticos. Haciendo un breve repaso de los sis- temas poliméricos més utlizados en la actualidad, podemos considerar dos grandes grupos que describiremos a continuaci6n: Polimeros de origen natural y sus modificaciones y sistemas poliméricos sintéticos. Aunque es diff cil plantear una clasificaciOn diferen- ciada de ambas familias, ya que en la actualidad se recurre a la utlizacion de merclas, y sistemas compuestos de ‘ambos tipos, consideraremos esta clasi- ficacién. con objeto de conseguir una exposicin organizada de esta revision. MATERIALES POLIMERICOS DE ORIGEN NATURAL Y SUS MODIFICADOS Polimeros naturales a base de protet nas como el coldgeno, albGmina, seda © gelatina, se estén modificando qui- micamente por diferentes vias para mejorar su resistencia mecinica 0 ade- cuar su velocidad de degradacién y por lo tanto de reabsorci6n a Jos pro- cesos de regeneracién tisular, creci- miento celular, 0 dosificaci6n controla- da y dirigida. Una de las reacciones mis tradicionales es el entrecruzamien- to con dialdehidos, prinipalmente glu- taraldehido, para conseguir sistemas débilmente entrecruzados que pueden ser moldeados con for- mas y perfles adecuados a su aplicacién, Ademis de ello, puede conseguir- se un control de la densi dad, 0 de la porosidad y textura de los materiales entrecruzados, para ‘modular su velocidad de degradacién, lo que ha proporcionado un medio adecuado y bien tolerado para el desarrollo de las denominadas "Pieles Arti- ficiales' (7, 8). La Figura 2 muestra esqueméticamen- te las exapas de prepara- cién de un sistema espu- mado a base de coligeno entrecruzado con glutaral- dehido y sembrado "in vitro* con fibroblastos y queratinocitos, para con- seguir una piel sintética a parti de las células de un protecoras Figura 2 Esquema de dseoy iodegradabes paciente que lo necesite. En unas ppocas semanas, tres 0 Cuatto, ¢s posi- ble disponer de una superficie de este sistema con multipicacion celular suf- ciente para conseguir una buena rege- neracién epidérmica. Los pasos que se necesitan no estén exentos de resgos, pues uno de los factores necesarios es la esterilidad, que garantice unas con- diciones asépticas apropiadas, lo que exige unos estrictos controles ya que los sistemas tienen que ser a menudo rmanipulados para seguir mantener un medio rico en nutrientes y conseguir el desarrollo celular necesario en el mini- mo tiempo posible. El resultado de todo el proceso es una pie! semisinét- a, con los ingredientes celulares ade- ccuados a cada paciente, para conseguir ‘una segeneracion del reido sin recur a injertos, como la que se muestra en la Figura 3. En este caso comesponde a un sistema al que ademés se le ha agregado Acido hialur6nico, un polisa- cdrido que en asociacién con el colé- ‘geno forma sistenas de enorme impor- tancia desde el punto de vista biolégi- 0 (9,10). Los nutrientes que se indican cen el esquema ce le Figura 2 pueden procederinicialmente de un medio de cultivo, pero cuando se ha alcanzado rain de membranas seansscsannitgnnscins i) sonsina coxnenon Aces da Rel Soiodad Exptl de sini E Sonunda pce, FrxoMaz0 2000 > Investigacién Quimica Figara 3 Pil artificial (Laser skin) preparada mediante semibra y clio de ctluasepidérmicas humana sobre soportesreabsorbibles de sco hislurénico ycoligeo. un grado de multiplicacién celular aceptable, puede ser implantado en contacto con el telido epidérmico del paciente para que se culmine el proce- So regenerativo con el desarrollo de vasos sanguineos y finalmente de una verdadera piel. La utilizacién de los sistemas poliméricos biodegracables a base de coligeno-Acido hialurénico, proporciona el medio adecuado para que se vaya produciendo una sustitu- Cidn de estos polimeros por matriz extracelular segregada por las colonias celulares que crecen en el sistema. La situacién ideal es aquella en la que condluido el proceso regenerativo, los polimeros originales que constituian la matriz soporte han desaparecido por biodegradaci6n y reabsorci6n. En muchas ocasiones se considera necesario aumentar la estabilidad hidrolitica de este tipo de sistemas, En 80s casos la utlizacién de agentes de entrecruzamiento mas estables, como poli(etilen glicol), PEG, con extremos uimicamente activos, resulta muy efi- caz (9,11. Fl sistema puede utlzarse para entrecruzar albimina 0 colégeno, y ademés admite la adicién previa de compuestos biolégicamente activos como factores de crecimiento 0 citoki ras, A medida que el material polimér co se degrada, los elementos biol6gica- mente activos se lineran para propor- cionar la respuesta farmacolégica ade- cuada. Algunas escuelas han disefiado modificaciones de proteinas mediante reac- cién con agentes acilantes tales como cloruros de Acido, cloru- ros de sulfonilo y anhidridos de cidos carboxii- cos portadores de grupos etilé- nicos, que una vvez incorporados a las proteinas pueden ser entrecruzados por via radicales, libres con activa- ion fotoguimica, después de haberles adaptado a una geometria determinada, El sistema ha sido aplicado con bastante éxito en aplicaciones oftélmicas (12), Mediante la utilizacion de técnicas de ingenierfa genética y de fermenta- cion, se estin produciendo proteinas del tipo de la seda expresando secuen- cias peptidicas bioacivas. Este tipo de materiales puede ser utilizado en forma de fibras, como recubrimientos 0 coextruidos con otros polimeros para conseguir sistemas de malla tejida © trenzada que pueden ser utiizados como soportes de regeneraci6n tisular, con excelentes propiedades mecénicas, durante tiempos bastante largos (13). En esta misma linea sistemas poliméri- cos biomiméticos a base de unidades peptidicas de elastina se han produci- do recientemente mediante técnicas recombinantes. Estas unidades pueden ser entrecruzadas baio imadiacién B 0 y para conseguir peliculas mecdnicamen- te estables y de naturaleza hidroilica a las que se pueden incorporar oétulas y especies bioactiva (14,15). Los polisacdridos de cardcter bésico proporcionan sistemas muy utilizados por el organismo humano para dife- rentes funciones y pueden ser suscep- tibles de modificaciones muy intere- santes, Los glucosaminoglicanos, en virtud de su elevada capacidad de hidrataciOn y naturaleza ramificada, constituyen uno de los elementos tisu- lares principales para disipar cargas y proporcionar resistencia a la friccién Por su gran importancia en los proce- sos biodindmicos, el propio écido hia- lurénico, el sulfato de condroitna, la quitina y el quitosano se modifican quimicamente para conseguir propie- dades mecdnicas aceptables y contro- lar su velocidad de degradacion. Asi hidrogeles con un alto grado de hidrae tacién pueden preparatse mediante el entrecruzamiento de glucosaminoglica- nos con poli(etilen glicol) de medio o alto peso molecular (12). Las macro- moléculas de glucosaminoglicanos se desacetilan para conseguir grupos amino libres que posteriormente se hacen reaccionar con cadenas de polietilen glicol) que contienen gru- ‘pos terminales reactivos. En este senti- do, nuestto grupo esti. desarrollando nuevos sistemas de quitosano obtenido 4 partir de caparazones de langosta, modificado por polimerizacién con Acido acrilico. EI sistema polimérico formado es una red interpenetrada de poliécido zcrilico en las macromolécu- las de quitoseno, en la que ademis se produce lz formacién de copolimeros de injerto, mediante reacciones de tansferencia de las cadenas de poliéct- do acrlico en las unidades de glucopi- ranosa repetitivas del propio quitose- no. En la Figura 4 se presenta una micrografia de una red interpenetrada de quitosano preparada mediante esta técnica. Estos sistemas se comportan como hidrogeles con un elevado poder de hidratacién, pues legan a grados de absorcion superiores al 600 por cien, de tal manera que pueden dispersarse en forma de pequetias par- ticulas en un vehiculo no acuoso, pero miscible con el agua, por ejemplo eta- nol y cuando se ponen en contacto con el medio fisiol6gico son capaces de captar un gran volumen de agua, con el consiguiente cambio de dimen- siones, lo que puede ser utilizaco para la formacion de sopomtes biodegrads- bles "in situ’ que proporcionen un medio adecuado para la regeneracion de tejido blando, Sistemas a base de Acido hialurOnico modificado de forma parecida han sido descritos amplia- mente en la bibliografia (16) > Julio San Romén, Alberto G Polisacéridos de carfeter acido tales como la carboximetilcelulosa, carboxi metilquitina, y carboximetilalmidén, han sido modificados por diferentes técnicas para aprovechar su carécter le y su excelente biocom- patibilidad, y poder ser utilizados con éficacia como soportes de elementos piol6gicamente activos, ya sean facto- res de crecimiento 0 medicamentos especificos, asi como soportes de mul- tiplicacién celular. Asf, mezclas de estos polisacétidos con gelatina, a las que se les incorporan grupos acrilato 0 cinamato, permiten obtener hidrogeles entrecruzados por vie fotoquimica de excelentes propiedades (17). Ei entrecruzamiento de polisaciridos puede realizarse con buen resultado Figura Sistema plimérico poroso altsmeatshidofiioy biodegradable preparado por modifcacin de guitsano con poliidoacriico jallarde, Blanca aprovechando interacciones de caréc ter iGnico mediante la utiizacién de cadenas macromoleculares cargadas positive 0 negativamente. En este sen- tido, resulta muy interesante la insolu- bilizacion de microcépsulas de alginat s6dico cuando se ponen en contacto con soluciones que co: alginato sdico (un polisacérido de sido manurénico y acido glucurénico que se extrae de algas marinas) se pone en contacto con una solucién ue contiene sales cilcicas, de magne- sio 0 de bario, se forma un complejo polimérico que precipita. Este mismo ndmeno se observa ultilizando pol ‘meros catiénicos como polilisina, Este fendémeno se esta aprovechando efi cazmente para con- seguir la encapsule- cién de células con fines protectores desde el punto de vista inmunol6gico. La Figura 5 muestra la micrograffa de islotes pancredticos encapsulados en sis temas de alginato célcico- poliisina, El sistema resulta muy eficaz para el man- tenimiento activo de las células producto- ras de insulina, de tal forma que a estos Figura 5: Encapsulacin de islotes pancreticos com algnato-plilisina, Vazquez, Antonio Lopez Brovo sistemas se les conoce como "pancreas artificial’. El mismo protocolo puede ser aplicado 2 otras células como hepatocitos con buen resultado a corto o medio plazo, La enorme ventaja de estos sistemas es que pueden mante- nerse en cualquier zona del organismo en contacto con el flujo sanguineo. La cépsula de alginato-polilisina protege inmunologicamente el sistema y man- tiene las condiciones adecuadas de nnutricion y permeabilidad, No obstan- presentan una cierta rigidez, y su bbilidad a largo plazo resulta insufi- ciente, por lo que la vida media del sistema es bastante corta para pensar en su aplicacién alternativa como pro- uctores de insulina en diabéticos (8, 19). No obstante la investigacién en este campo es muy activa y se espera que en los proximos afios se lleguen 2 plantear soluciones mas eficaces. Muy interesantes resultan los com- plejos poli-i6nicos, PIC, que se fon por reaccién de polielectrolitos con cargas opuestas como los representa~ dos en la Figura 6, que pueden formar cépsulas estables 0 fibras, dependien- do de la manipulaci6n de las corres. pondientes soluciones. Bjemplos de ellos son los sistemas formados por polisacéridos de cargas opuestas como el gelano producido por Pseudomonas Elodea, cuya estructura quimica es la de un polimero aniénico formado por unidades de {(3)-B-D-glucosa-(1,4)-p- Deglucosa-(1,4)-L-ramnosa(1)] con Segunde Epoca. EneroMarz0 2000, noles do la Real Sociedad Espotola do a Segunda tpoca, FnetoNter20 2000 fala de Qvinico Anales de la Reol Sociedad Esp > Investigacién Quimica quitosano (2-amino-2-deoxy-(1-4}-B-D- glucanol. El gelano nativo contiene grupos carboxilicos libres junto con un 3-6% de grupos O-acetilo, en forma de sales s6dicas 0 potisicas, que interec- cionan eficazmente con los grupos amino libres de las cadenas de quito- sano, Cuando una solucién dituida de quitosano en Acido clorhidrico 0 en Acido acktico, ajustando el pH entre 5 y 55; se agrega gota a gota sobre una solucién de gelano 2 pH=6 y a una temperatura de 50°C con agitacin moderada, se consiguen gotas estables disperses en la soluci6n de gelano. Su interior esta constinuido por quitosano, mientras que e] exterior esté formado por una pelicula de gelano. Un tata- miento 2 50°C durante el tiempo ade- que puedan ofrecer un sopore para la regeneraci6n tisular. El quitosano y derivados presentan una gran capaci dad de formacion de complejos poli- i6nicos con polimeros carboxilicos muy diversos. Recientemente hemos estudiado la formacién de complejos iGnicos entre polimeros acrlicos porta- dores de grupos tipo Acido saliclico como sustiuyentes lateales, con qui- tosano de alto peso molecular. El siste- ma tiene una buena estabilidad y una capacidad de hinchamiento depen- diente del pH pudiendo ofrecer bue- nas caracteristicas no solo como sopor- te para regeneracion y crecimiento celular, sino ademds como sistema bit activo con propiedades farmacolégicas asociadas al residuo de Acido salictico. Figura 6 Formacion de cipsuis y fibas con sistemas polimérieoscargados, con formacién de complejos Salen, PIC. cuado proporciona perias gelificadas, estables en el medio agitado y que incluso pueden ser manipuladas y lavadas, conservando una resistencia ceptable (20-22). Ast mismo, la coex- irusién de las soluciones y secado de las mismas proporciona fibras de PI con buena resistencia mecfnica,hidra- tables y por supuesto biodegradable. Ensayos mecénicos de traccién han dado valores de resistencia mecinica de nudos, mayores incluso que el algodén aunque menores que la seda (Qi). Estos sistemas por lo tanto pue- den ofrecer buenas cualidades como encapsulantes celulares o de principios actives. A. partir de las fibras se pue- den fabricar malas tefidas 0 trenzadas co se comporta como un sistema de iberaci6n controlada de Acido salicti- co en tiempos muy largos, lo que supone una propiedad interesante en muchas aplicaciones (23) Algunos investigadores han compro- ado que el entecruzamiento combi- nado de cadenas poliméricas por via de formacién de complejos iénicos y enlaces covalentes, puede dar buen resultado en el disefio y aplicaciéa de sistemas microencapsulados 0 de matrices hidrogeles de elevada capaci- dad de hidratacion, Asi, soluciones acuosis de alginato s6dico/polialcohol vinilico pueden entrecruzarse por coa- cervacién idnica de] alginato y el entrecruzamiento covalente del pola cohol vinilico modificado y fotosensi- bilizado. De esta manera se consigue una excelente resistencia mecénica, estabilidad y propiedades permselect- vas que no se podrian alcanzar por cualquiera de los dos métodos exclust- vamente. El entrecruzamiento foroqué rico puede incluso realizarse cuando se aplica el sistema "in situ’ 24) POLIMEROS SINTETICOS EI medio fisiol6gico humano retine las condiciones apropladas para que se puedan producir procesos hidroliticos. Para ello los polimeros deben poseer enlaces hidroliticamente inestables, y la reaccion se debe poder realizar 2 pH fisiol6gico (entre 7,0 y 7,4) (25,26) Desde un punto de vista puramente quimico, la reactividad hidrolitica a nivel molecular depende en primer lugar de la funcionalidad de los grupos orginicos que forman la cadena princ- pal de os sistemas poliméricos y que se repite de unas unidades a otras. La Figura 7 muestra un esquema en donde se representan las funciones mis sensibles a los procesos hidrolit cos en condiciones fisioldgicas. Gru- pos funcionales tales como carbonato © anhidridos de Acidos carboxilicos junto con enlaces tipo éster_muestran una sensibilidad bastante alta 2 los procesos de hidrélisis, mientras que enlaces amida, ortoésteres 0 uretano son en principio menos sensibles. Ea el caso de sistemas macromoleculares, existen factores determinantes del pro- ceso biodegradativo como son el caticter hidrofilico del sistema (pol meros hidrofilicos son siempre mas sensibles que los hidrof6bicos), el grado de crstalinidad, ligado intima- mente con su morfologia (los microdo- minios cristalinos son siempre menos sensibles que las fases amorfas, mas accesibles), o incluso la forma y el tamafio del sistema sopore (sistemas porosos son mas ficilmente degrada bles que los sistemas densos). 1a familia de los poli(o-hidroxici- Gos) y en particular poli(écido D.L-lée- tico), PLA, polilacido glicdlico), PGA, y sus copolimeros con composiciones > Julio San Romén, Alberto Gallardo, Blanca Vazquez, Antonio Lépez Bravo Los sistemas poliméricos preparados a partir de los dcidos glicélico o lactico, ofrecen una interesante propiedad por la que se consideran materiales biodegradables y biocompatibles ya que el producto de biodegradacion de sus polimeros y copolimeros son los correspondientes dcidos glicdlico o lactico, que se eliminan del organismo a través del ciclo metabolico de Krebs como anhidrido carbonico y agua muy variadas, se estén utilizando desde hace mas de 10 afios en inge- nieria tisular como soportes 0 anda- miajes para que se produzca una buena reproduccién celular acompatia- a de la generaciOn de mattiz extrace- Julas. Los sistemas poliméricos prepara- dos a pats de los acidos glicslico 0 léctico ofrecen una interesante propie- ad por la que se consideran materia- les biodegradables y biocompatibles ya ue el producto de biodegradacién de sus polimeros y copolimeros son los correspondientes Acidos glicélico 0 ldetico, que se eliminan del organismo a través del ciclo metabélico de Krebs como anhidrido carbénico y agua (25). Tanto el dcido lctico como el dcido slicélico conducen a polimeros de ajo peso molecular cuando se tratan de preparar por policondensacién, pero sus propiedades mecénicas y su estabilidad hidrolitica depende en buena medida de su peso molecular, siendo necesatio alcanzar pesos mole- caulares elevados para conseguir esta lided hidrolitica y mecénica durante el tiempo necesario para obtener un buen proceso regenerativo. Por ello, como se muestra en el esquem I, estos polimeros y sus correspondientes copolimeros se pre- paran por reaccién de apertura de anillo del derivado cicico hexa- gonal conocido como lactida 0 glicolida, La polimerizacién por apertura de anillo se consigue mediante la aplicacion de cataiza- dores tales como fluoruro de antimo- nio, cloruro de zinc, 6xido de zinc, cloruro de estafio, aunque el mas utilizado, apro- ado hace bastantes afios por Ja FDA americana, es el octo- ato de esto, 2-tl hexanoato de esta- fio, en proporciones de un 0,02 - 0,5% ya temperaturas de 130-150°C, Previa- mente, el correspondiente dimero cicli- co puede obtenerse con bastante facili- dad mediante la condensacién de Acido glicélico 0 de Acido léctico. La copolimerizacién de lactida y glicolida proporciona copolimeros de variada composicién y microestructura, desde sistemas tipo bloque hasta la distribu- cion al azar de ambos tipos de unida- des. Consecuentemente, las propieda- des fisico-quimicas de los sistemas dependen de su microestructura, ya que tanto la flexibilidad o rigidez de las cadenas, como la morfologia micro- cristalina (maf y distribucién de cristalitos distribuidos en la matriz, amorfa), dependen de ello. Estas pro- piedades han sido aprovechadas para el disefio de sistemas de porosidad controlada que han demostrado su efi cacia como soportes para la regenera- ibn tisular tanto de tejido conectivo como de tejido 6se0, cartlaginoso o incluso como guias para la regenera- cin de nervios periféricos. La Figura 8 muestra la seccion transversal de un tubo poroso confeccionado mediante técnica de extrusi6n de de copolimero 1-GA con una composicién 50/50, y cristales de sal comin de tamaiio seleccionado entre 200 y 300 jum. Los tubos extrui- dos con un dimetco exterior de 3 mm ¢ interior de 1,3 mm se mantienen sumergidos en agua a temperatura ambiente durante 24 horas para solubi- lizar los cristales de sal consiguiendo und estructura con un 85% de porosi- dad (27). Resulta bastante interesante la aplicacion de técnicas basadas en Segurd paca, Enero Morz0 2000 Quimica a z 3 a tecnologia de supercriticos para la pre- paracién de sistemas porosos y encap- sulados en ausencia de disolventes. La tecnologia de supercrticos utiliza fun- damentalmente anidrido carbénico a altas presiones como disolvente, como dispersante 0 como eluyente, La des- presurizacion proporciona sistemas porosos en forma de esponias o lami- nas, microesferas o capsulas porosas, pudiendo controlar la porosidad mediante el método de despresuriza- i6n utiizado. La gran venta de estos métodos frente 2 los disolventes o dis- persantes clasicos, es la ausencia de toxicidad del anhidrido carbénico y la garantia de que no quedan restos de disoivente que puedan presentar e tos t6xicos en aplicaciones. Un sistema polimérico clésico en el diseio de microesferas para dosifica cin controlada de medicamentos factores de crecimiento es la polile- caprolactona), interesante sistema pot su cardcter semicristalino (el polimero de alto peso molecular presenta una temperatura de fusin de 61°C y por su baja temperatura de transicién vitrea, -60°C, confiere a la cap: tona una gran capacidad para preparar polimeros y copolimesos con propie- dades muy diferentes, desde sistemas rigidos a muy flexibles tipo elastomer co, como son toda una extensa gama de copolimeros de t-caprolactona con (D,L-lactida (29-31), La incorporacién de segmentos largos de unidades de caprolactona en copolimeros con Acido lactico 0 Acido glicélico propor- Figura 8: Tubos porosos de ‘opolimeros (ido lcico ako lio 50/50) egraosporexmstiny ado de mez cO0 zits de sal comin re. 17), Se aplican para la regeneracion de nervios pesos. Figua 9: Redes en forma de alla de bras Dlodegradables con supericie adeeusda coasttayen un soporte excelente para adhesion y proliferation (ref 32) ciona un sensible aumento de la flexibilidad y de su capacidad para formar fibras con buenas caracte- risticas de adhesion y pro liferaci6n celular. En le Figura 9 se presentan de forma esquematica las Figura 10: Micrografia de icroscopiaeleeonica de barsido de fbras entradas de poliGcid gictico)(@)yde | sgrinulo echlar de condocitos después de 3 diss de haber sido sembradas (ef. 32,33). poliméticos biodegradables (32). La Figura 10 muestra las micrografias obtenidas por micrascopia electtinica de barsido SEM de fbras biodegrada- bles de politécido glic6lico) que tam- bién pueden ser preparadas a partir de copolimeros de la composicion adecuada. Las fibras con un diémetro inicial de 13 jum se recubren comple- tamente de condrocitos después de 3 dias de haber sido sembradas. La pro liferaci6n celular y Ja matriz extracelu- lar que se genera en un espacio de tiempo razonable proporciona un tej- do en el que va desapareciendo la red polimérica inicial por biodegradacién 62, 33). Existen muchas modificaciones de sistemas basados en Acido glicdlico 0 Acido lactico preparados por copolime- rzacion al azar 0 en blogue, introdu- ciendo componentes hidrofilicos que modifican notablemente el comporta miento hidrolitico. Asi, Cohn y Younes (30 han descrito con detale la sintesis y caracterizacion de una amplia gama 4e copolimeros de etilen glcol - dcido léctico y Sawhney y Hubell (35) han preparado terpolimeros de D,L-lactida glicolida y e-caprolactona a los cuales incorporan segmentos largos de poli(etilen glicol) utilizando cadenas de este polimero activadas en su extre- ‘mo como iniciadores de la polimeriza- cién por apertura de anillo de los tres ‘componentes mencionados. Para esos funciones de adhesin y | proliferaci6n desarrolladas por células sobre fibras entrelazadas de sistemas | a > Julio San Romén, Alberto Gallerdo, Blance Vazquez, Antonio Lopez Bravo QUEMA TT ? a fe cxeceonenl mismos fines han wiliza do copolimeros triblo- que a base de polietilen glicol-polipropilen gli col-polietilen glicol, conocidos comercial- mente como "Pluronic", con los que se puede controlar 0 modular el caracter hidrofilico de los sistemas. Una varian- te interesante que se ha desarrollado como fibras monofilamento para aplicaciones quirirgicas tales como hilos de sutura 0 clavos reabsor- bibles, pero que tam- bién pueden utlizarse eficazmente como soportes de porosidad controlada, es la poli- dioxanona. Como se representa en el esque- ma I, la estructura qui- mica de la polidioxano- na es la de un poliéster- Ger altemante que resulta de la poli- merizaci6n por apertura de anillo de p-dioxanona catalizada por octoato de estafio u otros catalizadores derivados organometilicos, a temperaturas moderadas con Io que se evitan las posibles reacciones de degradacion térmica o de retroceso, asi como otros procesos de transesterificaci6n al azar que son frecuentes en este tipo de procesos de polimerizacién si la tem- peratura de reaccién es relativamente elevada >150°C (36). Otros sistemas e copoier poi (icolda-coarbonato de imetilens) oli (lcd co-crbonat de wimeteno) - cS (00m ‘Figura 1: SEM de morfologs superficial (2) estructura dea pared () ‘de tubosy placa porosasbiodegradables a base de poiicdo Kisco) 0 Seid lictien¥ -aprolactona muy flexibles se pueden preparar por copolimerizacién del carbonato de tri- metileno con glicolida o lactida dando lugar a copolimeros que alternan unio- nes carbonato y uniones éster carboxi- lico G7). Si la. reacci6n de copolime- rizacién se realiza con una mezcla de lactida y glicolida, es posible obtener copolimeros al azar y completar con bloques de policarbonato de trimetile- no) con buenas propiedades mecini- cas como fibras monofilamento (12 Soluciones viscosas utlizando disol- ventes volatiles como cloroformo o cloruro de metileno, con una concen- tracién de copolimero de un 8-10%, pueden proyectarse a través de una boquilla de pequefio diémetro (200- 300 yum) sobre un mandril o varilla giratoria que va formando una red porosa a medida que el disolvente se evapora con grados de porosidad de un 85-90%. La Figura 11 muestra macrograffas obtenidas por SEM de la superficie extema (Figura Ta) y de la seccién transversal (Figura 11b) en las que se observa la estructura de poros interconectados como consecuencia de Ja proyeccion y secado de los sistemas poliméricos mediante esta técnica. La técnica es aplicable a todo tipo de polimeros siempre que se pueda utii- zar un disolvente volatl. La Figura 12 muestra la estructura y morfologia de una fibra hueca preparada por esta técnica a partir de un terpotimero de ficido lactico/Acido glicélico/e-capro- Jactona La preparacién y aplicacion de poli(anhidrides) de Acidos carboxiicos han resultado interesantes como siste- mas de caricter hidroflico controlado y resistencia hidrolitica relativamente reducida. Su estabilidad biodegradativa puede modularse combinando la lon- gitud de cadena alifftica que separa Jos grupos anhidridos. Si la fongitud del segmento aliftico es pequefia, los sistemas poliméricos resultan bastante hidrofiicos y polares, y su velocidad de biodegradacién sera relativamente elevada. Por el contrario, si se eligen derivados de 4cidos de cadena larga, los polianhidridos resultan poco pola- res y de carfcter sensiblemente hidro- fobico, siendo mas resistentes 2 los procesos biodegradativos. lin general la formaci6n de enlaces tipo anhidrido se realiza por deshidro-acilacion de dos grupos carboxilicos. Se preparan tipicamente por reacciones de conden- sacién en solucién o en estado fundi do a presin reducida, en dos fases. La primera consiste en la preparaci6n de prepolimeros por reaccién de diécidos tales como el Scido fumrico, el dcido succinico 0 el de cadena mas larga, lo sebicico, con anbidrido acético y una segunda fase de verdadera pol- Segunda fpeca, EnetoMerza 2000 Fspaticle de Quimica Soxseda ‘Aral do a Res secs del foal Sad sade unc E Sep as, Enea 2000 > Investigacién Quimica Figura 12; SEM de fbr huecaspreparaas por proyeecin de soluiones concetradas de ‘Sstemaspolimerios iodegradables y morfologia ‘porosaabieria de una ecco transversal de la paced de as brs merizacion a vacio y temperatura rela- tivamente elevadas como muestra el esquema I (38-40). Algunos sistemas desarrollados por Langer y col. 8,40) como soportes para liberacién contro- lada de agentes quimioterapéuticos como implantes en tumores cerebrales, han sido aprobados por la FDA ameri- cana y comercilizados bajo la marca registrada "Gliadel’. Albertsson y Lundmark (41) han des- ctito series de elastémeros termoplésti cos biodegradables basados en copol meros de bloque de polianhidridos y polietilen glicol, que presentan buenas propiedades como formadores de fibras con resistencia meciinica y flexi bilidad y por su estructura molecular se biodegradan mediante procesos de erosi6n superficial, ya que resultan bastante hidrof6bicas y por lo tanto no pemmiten la penetracién de moléculas de agua en el interior del material. Bsta posibilidad, que también la oftecen algunos poliortoésteres, es aprovecha- da para la preparacion de sistemas de liberacién controlada de medicamentos y factores de crecimiento que permiten disefiar procesos de aplicacién de larga duracién sin que se observen efectos secundarios apreciabls. Recientemente, A. Mikos y col. (42+ 45) han puesto de manifiesto que es posible utilizar sistemas de polimeros de fumarato de propilen glicol, que contienen dobles enlaces polimeriza- bles por via radical en condiciones fisiol6gicas, para preparar y aplicarsis- temas autocurables in situ’ © cemen- tos a los que se agregan Factores de crecimiento como hormona de creci- miento, GH, factor de crecimiento de fibroblastos, FGF, o proteina morfoge- nética, BMP, con objeto de estimular la regeneracion tisular en cavidades 6seas 0 incluso de tejido conectivo que necesiten ser regenerados. El siste- ma polimérico a base de fumarato de propilen glicol es biodegradable, y puede ser mezclado con monémeros vinilicos 0 acrilicos para dar lugar por procesos de polimerizacién radical activada a redes entrecruzadas de caracter hidrofilico 0 hidrofébico. Asi, ka polimerizaciOn de sistemas a base de poli(fumarato de propilen glicol) con metacrilato de metilo al que se agregan cantidades adecuadas de fac- tores de crecimiento, que se activa con un sistema clisico a base de peroxi- do/amina, proporciona sistemas de H ‘ESQUEMA IIT 2 9 ' \ Lotion | oo = 1 woe ego ' i (ex,¢030 ry | * i ; (cost ce toton | wos wey i 180 [at curado "in situ’ que pueden liberar el componente bioldgicamente activo durante tiempos muy largos. Finalmen- te, el sistema se biodegrada lentamente hasta conseguir 0 bien su total reab- sorcién o bien una integracién tisular que garantiza la ausencia de reaccio- nes a cuerpo extraio y de infecciones en el tedo donde ha sido aplicado. El sistema esté dando excelentes resulta- dos tanto en su fase de experimenta- ion animal como en la fases prectini- cas que se llevan 4 cabo en la Clinica Mayo. Por otra parte, si el metacrilato de metilo se susttuye por vinil pirrl- dona, se consiguen sistemas hidrofil- cos de liberacién relativamente ripida y se garantiza su reabsorcién total ya {que los segmentos de cadena resultan- tes de la biodegradaci6n a base de cadenas de poli(vinil pirrolidona) resultan solubles en el medio fisiolgi- co, siendo eliminados por las vias habituales de excrecién a través del rifén. Finalmente, es necesario considerar una amplia familia de sistemas alta mente hidrofilicos y con propiedades muy interesantes por su capacidad de asociacion con compuestos pola- res y SU respuesta frente a condicio- nes fisiologicas especificas. Se trata de los sistemas basados en poli(alco- hol vinilico) y los desarroltados en base 2 poli(etlen glcol) y copolime- Vaio Loh > Julio San Roman, Alberto Gallardo, Blanca Vazquez, Anionio lopez Bravo 108. El polialcohol vinttco) es posi- blemente el tnico polimero de cade- nas hidrocarbonadas con caricter biodegradable tanto en condiciones aerobias como anaerobias (46). El mecanismo de biodegradacién enzi- matica de poli(alcohol vinilico) PVA utilizando cepas de pseudomonas se describe en el esquema IV. Sakai y col. (47,48) han demostrado que se produce una reacciOn de oxidaci6n catalizada enziméticamente por alco- hol oxidasa SAO via Brhidroxi ceto- na, para dar lugar a B-dicetona que se escinde por accién de la f-diceto- na hidrolasa, y recientemente Matsu- mura y col. (46) han propuesto un nuevo mecanismo biodegeadativo uti lizando cepas de alcaligens faecalis a través también de B-hidroxicetonas, 12 capacidad biodegradativa de deri- vados de PVA resulta interesante ya que permite el disefio y la prepara- cién de una gran variedad de siste- mas con propiedades muy diversas mediante la incorporacién de cade- nas de PVA en sistemas no biodegra- dables, reacciones de injerto en cadenas biodegradables con carécter hidrofébico 0 incluso modificaciones estructurales de la propia cadena de PVA mediante reaccién de algunos de sus grupos hidroxilicos. Con ello se consiguen sistemas sensibles a alteraciones de temperatura a nivel local, muy relacionado con el creci- miento de ciertos tumores, o frente a condiciones de hidrataciOn determi- nada, 0 incluso el disefio de sistemas entrecruzados de gran capacidad de absorcion de agua 0 fluidos fisiolo- ggicos, que ademas de mantener su carfcter biodegradativo proporciona ung excelente biocompatibilidad. Hidrogeles a base de PVA y sistemas modificados han sido utilizados como dilatadores o separadores en vértebras cervicales (49) o sistemas porosos hidrofilicos reabsorbibles (50). Los sistemas 2 base de PVA pueden entrecruzarse o ser insolubi- lizados en agua mediante ciclos de congelacién y descongelacion 0 por via quimica como es la acetalizacion con dialdehidos. Estos procesos se han aprovechado para conseguir !a formacién de microcépsulas para el aislamiento y mantenimiento celular Incluso es posible conseguir el entre- cruzamiento mediante la formacién de complejos a partir de soluciones de mezclas de PVA y polietilen glicol, con sulfato s6dico/hidréxido potisi- co para formar membranas 0 siste- mas de encapsulacién celular (51), Por otro lado, materiales basados en polietilen glicol), PEG, y deriva- dos han sido ampliamente utilizados en multitud de dispositivos biomédi- os y en sistemas de dosificacién de medicamentos y principios activos, habiendo sido el propio PEG aproba- do por a FDA como aditivo en ali- mentos y en productos farmacéuti- cos. Uno de los aspectos mas intere- santes es la posibilided que oftece para la preparaci6n de sistemas con grupos reactivos en sus extremos que pueden intervenir en reacciones de curado ‘in situ" o que permiten el disefio de sisternas micro macropo- rosos con excelente biocompatibili- dad, carfcter hidrofilico controlado y reabsorcién con garantia, sin peligro de generacion de productos toxicos. Asi, resulta interesante la preparacion de macromonémeros que incorporan grupos vinilicos 0 acrilicos en sus extremos de cadena y pueden utili- zarse en el disefio de sistemas auto- curables por polimerizacién radical activada a temperatura fisiolégica con per6xido/amina 0 fotoquimica- mente, El esquema V muestra el mecanismo de reaccién de macromo- nomeros acrilicos de sistemas de copolimeros de bloque preparados por copolimerizacién de polietilen alicol de bajo o medio peso molecu- lar y lactida. La funcionalizacién de los extremos de cadena de los poli La capacidad biodegradativa de derivados de PVA resulta interesante ya que permite el disefto y la preparacion de una gran variedad de sistemas con propiedades muy diversas mediante la incorporacion de cadenas de PVA en sistemas no biodegradables, reacciones de injerto en cadenas biodegradables con cardcter hidrofobico o incluso modificaciones estructurales de la propia cadena de PVA mediante reacci6n de algunos de sus grupos hidroxilicos. Joos ola fa! Soke Egat do ica B Segue fpco, fe Noo 2000 > Investigacién Quimica Una de las propiedades mas interesantes de estos sistemas es que a baja temperatura, 25-30°C, la disolucion presenta baja viscosidad, mientras que cuando se eleva la temperatura a 35-37°C la viscosidad aumenta bruscamente, lo que puede ser aprovechado para administrar sistemas de liberacién controlada por inyeccion parenteral. meros formados se consigue por reacciOn con cloruro de Acido acti co 0 metacrilco, dando lugar a siste- mas telrafuncionales que conducen a Ja formacién de redes tridimensiona- les. Gracias a ello no es fundamental Ja obtenci6n de sistemas de alto peso molecular y pueden utilizarse sin problemas olig6meros o macromon6- meros de relativamente bajo peso molecular, 1000 - 2000 Daltons (52). Sistemas poliméricos que presentan una transiciOn sol-gel en solucion acuosa cuando se eleva la temperatu- ra en un intervalo de valores proxi- mos a la temperatura fisiologica estén llamando mucho la atencién como sistemas de dosificacién de elementos bioactivos dependientes de la temperatura. Copolimeros de poliCetilen glicol) con poli(propilen slicol) "Pluronics", o bien copolime- 10s de bloque de PEG-poli(butilen glicol)-PEG asi como de PEG- poli(lactico-co-glicSlico)-PEG, pre- sentan en solucién acuosa transicio- nes muy interesantes desde un punto de vista aplicado, para disefiar y pre- parar soportes de crecimiento celular o sistemas adhesivos hidrosolubles que puedan actuar como sistemas de dosificacién controlada bajo estimulo téxmico (53-55). Una de las propieds- des mas interesantes de estos siste- mas es que a baja temperatura, 25- 30°C, la disolucién presenta baja vis- cosidad, mientras que cuando se leva la temperatura a 35-37°C la vis- cosidad aumenta bruscamente, lo que puede ser aprovechado para administrar sistemas de liberacion controlada por inyecciOn parenteral Esta transicién esta relacionada con la formacion de una estructura tipo micelar de baja viscosidad, y la consiguiente ruptura de la misma asociada al incremento de temperatu- 1a 655). En definitiva, el considerable pro- greso desarrollado en los tltimos afios en el disefio y preparacién de sistemas poliméricos complejos con propiedades especificas, asi como un buen aprovechamiento de sus interacciones con el medio biologi- co activo, tanto a nivel celular como 4 nivel estructural con proteinas, enzimas, etc., abre unas excelentes expectativas de desarrollo en un campo multidisciplinar de enorme repercusion social y econémica. Puede considerarse que estamos siendo testigos de lo que pueden ser los primeros pasos de un revo- lucionario futuro en [a conserva- ci6n, crecimiento y regeneracién tisular, Del esfuerzo cooperative entre los diferentes especialistas en campos comprometidos de la cien- cia de materiales y las ciencias médicas dependerd el progreso de la "Ingenieria de Tejidos' en los préximos aftos Ag > Julio San Romén, Alberto Gallardo, Blanca Vazquez, Antonio Lopez Brove BIBLIOGRAFIA 1. C.W. Pack JR, A. Mikos, LV. Melnire, Prospecus of Tissue Engi- reefing, en “Frontiers in Tssue Engineering’, Ed. C. W. Patick, A G. Mikos, LV. Melntie, Elsevier Science Ld, UK, 1998, p3 2. F.G, Heineken, R Slalak, Tissue engineering: a brief overview, J io- ‘mechanical Engingering, 133, 111-120 (991) 3. Langer, J.P, Vacant, Tissue engineering, Sconce, 260, 920-926 (3993) 4. ME. Nimni, Polypeptide growch factors: targeted delivery systems, Biomaterials, 18, 1201-1225 (1997) 5. D. F. 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