Instituto Tecnologico de La Paz

Tcnicas Bsicas y experimentales

Electroforesis
Lidda Mariam Calixto Heredia
26 de Noviembre de 2014

Introduccin
La electroforesis es el movimiento de las partculas cargadas contenidas en un
medio debido a la influencia de un campo elctrico. La electroforesis constituye
una de las tcnicas ms poderosas para la purificacin de molculas biolgicas.
La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud
depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se
desplazan cuando se ven sometidas a un campo elctrico.
Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las
biomolculas en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se
trata de una tcnica fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede
realizar con fines preparativos.
Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una
velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico)
con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesta por el
medio en el que se desplaza.
Fuerza del campo elctrico = fuerza de friccion

q=carga (C)
f=coeficiente de friccion (C,V.s/m 2=kg/s)
E=intensidad del campo (V/m=N/C)
v=velocidad de la molecula (m/s)
El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas
de cada molcula, esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las
molculas grandes y asimtricas poseen un mayor coeficiente de friccin que las
pequeas y compactas.

La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica,

Z=numero entero
e= carga del electrn
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de
cada molcula define su separacin en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo,
se van separando progresivamente unas de otras.
Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por iones,
que son atrados y as recubren los iones de la muestra, lo que altera el
comportamiento de stos en el campo. Todo ello hace que el tratamiento terico
cuantitativo de la electroforesis sea muy difcil y que esta tcnica resulte poco til
para obtener informacin precisa sobre la estructura de las molculas. Sin
embargo, es enormemente til como tcnica analtica y preparativa.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:
De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en todo la
disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o
frontera con el disolvente
Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes
migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que soporta
a este. En este caso no se determina la movilidad, sino que el nico
objetivo de la tcnica es separar los componentes de la muestra.
Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso.
Medios de soporte para realizar la electroforesis
La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar
perturbaciones mecnicas y corrientes de conveccin durante la separacin. En
algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza
a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal de
separacin es la magnitud de la cargade cada componente de la muestra. Otros
medios de soporte (geles, medios semislidos o gelatinosos) estn formados por
polmeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a travs de la cual
deben avanzar las molculas de la muestra, que queda embebida en el medio de
soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin es notable y los factores de
forma y tamao adquieren una alta relevancia en la separacin.

Medios de baja friccion

Papel
Acetato de celulosa
Separacin principalmente por carga

Medios de elevada friccion

Gel almidon
Gel poliacrilamida
Gel de agarosa
Gel de agarosa +
poliacrilamida
Separacin por carga, tamao y forma

Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa
Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la
adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para
detectar y recuperar los componentes separados.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn
caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la
poliacrilamida.
Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agaragar). Se disuelve en caliente (50-60 C) y al enfriar solidifica formando un gel, de
alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla
de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su
proporcin se consiguen porosidades, siempre menores que la de los geles de
agarosa.
Agarosa + poliacrilamida: porosidad intermedia
Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate) es
un detergente aninico que se une a las protenas, desnaturalizndolas en una
conformacin extendida recubierta de molculas de SDS. Como consecuencia, el
tamao de la molcula de protena es directamente proporcional a su longitud en
aminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la
recubre, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa molecular.

Modos de disposicin del soporte

Horizontal

En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas, y en soportes similares

(especialmente, acetato de celulosa), para protenas.

En gel de almidn o de agarosa, para protenas y especialmente para cidos

nucleicos. Casi siempre el tampn cubre el gel (para evitar que se seque debido al
calentamiento sufrido al pasar la corriente), denominndose por ello electroforesis
submarina.
Soporte impregnado de disolucin tampn por capilaridad, disuelve la muestra y
mantiene el contacto elctrico.
Se aplica la muestra depositndola (pipeta o aplicador especfico) como una gota
sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un pocillo creado en el
gel.

Vertical

Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no se

desliza), para protenas o para cidos nucleicos de pequeo tamao.
El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido
entre 2 placas rectangulares.
Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las
cubetas o compartimentos del nodo y ctodo.
La muestra se deposita con micro pipeta llenando un pocillo creado al polimerizar
el gel.
En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un
solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composicin
ligeramente diferente).