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Directora
Mariela Carreo de Arango
MSc. Microbiologa Industrial
Codirectora
Yiseth Caicedo Rivera
Biloga. Especialista en Ingeniera Ambiental
A Dios,
Quien me da Fuerzas para Vivir.
A More,
Por su Apoyo Incondicional
Por todo su Amor y Compresin
Pero Especialmente por Siempre Estar.
Ana Bella
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Mariela Carreo de Arango del Centro de Innovacin en
Biotecnologa Industrial y Biologa Molecular (CINBIN), por su orientacin y
apoyo en la direccin de este proyecto, pero especialmente por su gran
amistad y confianza durante el desarrollo de este proyecto de investigacin.
A Yiseth Caicedo, Gerente de INVAGRIN, y Asesora en Residuos Slidos y
Produccin ms Limpia por su colaboracin en la codireccin y sobretodo por
su gestin en la consecucin de la prctica profesional.
Doctor Jos Urango Gerente Tcnico INDUPOLLO por la financiacin
brindada para llevar a cabo el presente proyecto.
Al personal del Laboratorio de Microbiologa del CINBIN por su apoyo en la
consecucin de los elementos para la realizacin de los anlisis
microbiolgicos y especialmente a los Doctores Jorge y Mariela por su
amistad y acogida como parte de esta gran familia
Al personal de la Granja Avcola "La Rosita": Rafael, Ramn y la Sra. Petrona
por su colaboracin y ayuda.
A mis compaeros y amigos: Nelsy, Lyda, Lesly, Lili, Claudia, Maria Andrea,
Mnica, Lucio, Oscar, Julianita, Juan Pablo, Diego, Enrique Luis y Wilmer,
con quienes compart alegras y tristezas, preocupaciones y aoranzas.
Al profesor Gregorio y Sra. Judith por su gran amistad.
A Edgar Sanin por todo su amor y comprensin. Por transmitirme fortaleza
para afrontar la vida con valor.
A mis familiares, a Nila, Lency, Gina, Efrn y a todas aquellas personas que
de una u otra forma contribuyeron al desarrollo de este proyecto.
CONTENIDO
Pg.
INTRODUCCIN
1. MARCO TEORICO
1.1 POLLINAZA
1.2 COMPOSTAJE
11
14
17
18
20
20
21
21
22
23
23
24
24
25
2. METODOLOGA EXPERIMENTAL
27
27
29
29
29
29
31
31
33
34
34
35
35
37
38
39
2.5.3.2 Inoculacin
40
40
40
42
42
43
45
3 RESULTADOS Y ANLISIS
47
47
48
48
50
52
57
76
77
77
77
82
82
86
4. CONCLUSIONES
98
5. RECOMENDACIONES
100
BIBLIOGRAFA
101
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Fig.1. Control de parmetros mediante sensores
15
18
28
30
32
35
37
37
37
Fig.10. Espectrofotmetro
37
37
Fig.12. Centrifuga
37
39
39
40
41
41
41
41
42
44
46
46
46
46
49
50
51
51
51
52
52
58
58
59
59
59
60
61
62
63
63
64
64
66
67
68
70
71
72
73
75
75
78
79
79
80
82
84
85
87
89
90
90
91
91
92
93
93
94
94
95
LISTA DE TABLAS
Pg.
Tabla 1. Riqueza media de los diferentes tipos de estircol
19
19
47
48
50
53
54
55
55
56
65
69
76
80
81
83
LISTA DE ANEXOS
Pg.
Anexo 1. Medios de cultivo para microorganismos benficos.
106
108
109
110
111
RESUMEN
TITULO:
COMPOSTACIN
ACELERADA
DE
LA
POLLINAZA
MEDIANTE
MICROORGANISMOS AEROBIOS PARA SU UTILIZACION COMO ABONO ORGNICO*.
AUTOR: NIO RIVERA, ANA BELLA**
PALABRAS CLAVES: Pollinaza, Compostaje, Abono Orgnico, Microorganismos aerobios,
Produccin Limpia.
DESCRIPCION:
Entre los abonos utilizados actualmente se destaca la pollinaza, cuya composicin en
macronutrientes mejora las caractersticas fisicoqumicas del suelo y se utiliza como
fertilizante en una amplia variedad de cultivos de tipo comercial. Con la realizacin del
presente proyecto se pretendi obtener un bioproducto comercializable constituido por un
selecto grupo de microorganismos aerobios (bacterias y hongos nativos) caracterizados por
su capacidad de elaborar sistemas enzimticos efectivos en la degradacin acelerada de la
pollinaza y con mayores ventajas competitivas en el mercado de los abonos orgnicos.
Se realiz la caracterizacin fsico-qumica y microbiolgica del sustrato, el aislamiento e
identificacin de los microorganismos aerobios en las etapas mesoflicas del compostaje, as
mismo se efectu un estudio de las variables de mayor incidencia en la bioaumentacion de
las especies (aireacin, concentracin de sustrato, temperatura y agitacin) obtenindose
unas condiciones apropiadas para su crecimiento, y posterior aplicacin a los residuos
orgnicos para finalmente realizar bioensayos de respuesta biolgica con extractos acuosos
del Abono Orgnico y as comprobar su eficacia en el porcentaje de germinacin,
crecimiento de la raz y el tallo de la plntula de Tomate.
Entre los resultados obtenidos vale la pena destacar que se aislaron de la pollinaza 19
especies de bacterias pertenecientes a los ordenes Pseudomonadales, Enterobacteriales,
Burkholderiales, Bacillales y Actinomycetales, y 8 especies de hongos de los gneros
Aspergillus, Penicillium, Cunninghamella, Curvularia, Trichoderma, y Saccharomyces los
cuales presentaron una disminucin de un 30 % en el tiempo de compostaje y el logro de la
temperatura mxima de la etapa termoflica hasta de 72C. En los ensayos de respuesta
biolgica evaluados estadsticamente mediante anlisis de varianza (ANOVA) el tratamiento
con pollinaza compostada present mayor porcentaje de germinacin (80%) y mayor
longitud de crecimiento de la plntula de tomate (Lycopersicon esculentum). Obtenindose
as un abono de orgnico de ptima calidad y sin patgenos.
*
**
Proyecto de Grado.
Facultad de Ciencias, Escuela de Biologa, UIS, Directora: Mariela Carreo Mcs
ABSTRACT
*
**
Thesis Project.
Science Faculty, Biology School, UIS, Mariela Carreo Mcs. Director
INTRODUCCIN
1. MARCO TEORICO
1.1 POLLINAZA
La pollinaza es uno de los residuos slidos ms importantes en trminos de
la posibilidad de afectar significativamente el ambiente en las granjas de
produccin, debido a su composicin y a las grandes cantidades generadas.
La poblacin avcola colombiana est compuesta por 380 millones de pollos
y 24 millones de ponedoras. Si un pollo produce diariamente 150 gramos de
pollinaza hmeda y cada gallina 100 gramos de gallinaza, y si el precio de
venta oscila entre 75 mil y 80 mil pesos la tonelada (ya deshidratada),
estamos frente a una cifras impresionantemente grandes en cuanto al dinero
que este subproducto puede representar para los Avicultores como ingreso
adicional al proveniente de su negocio de huevos y de carne.6
En una alta proporcin, en Colombia no se le adiciona nada a la gallinaza ni
a la pollinaza; en una investigacin que abarco 86 granjas avcolas, la
Corporacin Nacional para la Investigacin Agropecuaria, CORPOICA
encontr que solo en 5 o 6 la procesan. Sin embargo, poco a poco se ha ido
extendiendo la prctica de llevar a cabo un anlisis de suelos y a partir de
sus resultados enriquecerla con diferentes nutrientes, lo que da origen a
formulaciones especficas para cada cultivo en particular.7
Algunos avicultores y procesadores de pollinaza en Colombia la definen
como una materia prima fundamental, potenciada hoy por la tendencia
mundial, cada vez mayor de eliminar los qumicos en la fertilizacin. Le
anotan como principales ventajas, frente a los abonos qumicos:
6
7
Neutralidad del pH
Favorece un mejor intercambio tanto catinico como aninico en el
suelo
Retiene hasta el 80-90% de agua.
Materia
Seca %
P2O 5
K 2O
MgO
De vacuno
32
--
De oveja
De cerdo
De caballo
Purines
Gallinaza
35
25
100
8
28
14
5
17
2
15
5
3
18
0.5
16
12
5
18
3
9
3
1.3
-0.4
4.5
0.9
1.4
----
Producto
Tipo de
estircol
Macronutrientes
Micronutrientes
P2O 5
K 2O
Ca
Mg
Fe
Mn
Cu
Zn
H2O
Gallinaza
2,43
2,67
4,80
5,70
0,50
11
4,25
2,64
19
Bobinaza
Porcinaza
2,11
2,32
1,60
4,72
5,76
3,90
0,87
3,25
0,44
8,77
1,20
8,8
7,63
643
132
422
75
62
Equinos
2,65
1,95
2,92
Fuente: Restrepo R, 2001.
65
11
12
RIVERO & CARRACEDO. Efecto del uso de la gallinaza sobre algunos parmetros de fertilidad
qumica de dos suelos de pH contrastante. Revista Facultad Agronmica, 1999. Vol. 25 p.83
13
Ibid., p.90
14
1.2 COMPOSTAJE
1.2.1 Compostaje Aerobio El compostaje es un proceso biolgico aerobio,
que bajo condiciones de aireacin, humedad y temperaturas controladas y
combinando bases mesfilas (temperatura y humedad medias) y termfilas
(temperatura superior a 45%), transforma los residuos orgnicos
degradables, en un producto estable e higienizado, aplicable como abono o
sustrato. Es decir, el compostaje es:
19
20
10
Ibid., p.18
TCHOBANOGLOUS, George. Gestin integral de Residuos Slidos. Madrid. 1994. p.47.
11
23
Ibid., p.48.
12
Este proceso comienza por encima de 40C, provocando una disminucin del
crecimiento de la microflora mesfila la cual es sustituida por la termfila al
igual que se eliminan la mayora de mesfilos patgenos, hongos y
elementos biolgicos indeseables. Esta etapa es crucial para la higienizacin
del material, por lo que es conveniente mantener las condiciones que
permitan su mxima prolongacin.
Estas temperaturas inician, sin embargo, una nueva explosin de actividad
por parte de microorganismos termfilos contenidos en la materia orgnica,
conduciendo a condiciones mesfilas hasta la metabolizacin completa de
los sustratos simples quedando los materiales ms resistentes degradndose
a ritmos mucho ms lentos.24
Fase Mesotrmica II. Cuando la materia orgnica se ha consumido, la
temperatura empieza a disminuir alcanzando niveles iguales o inferiores a los
40C en este momento las bacterias y los hongos mesfilos, reinvaden el
interior del compost utilizando como fuente de energa los materiales mas
resistentes a la biodegradacin, tales como la celulosa y lignina presentes en
los residuos. La temperatura descender paulatinamente hasta presentarse
en valores muy cercanos a la temperatura ambiente, en estos momentos se
dice que el material se presenta estable biolgicamente y se da por
terminado el proceso. A esta etapa se le conoce generalmente como etapa
de maduracin.25
Desde el punto de vista microbiolgico la finalizacin del proceso de
compostaje se tipifica por la disminucin de actividad metablica a niveles
mnimos. Las poblaciones microbianas se presentan en fase de muerte por
agotamiento de nutrientes. El proceso de compostaje es, pues, una compleja
interaccin entre el sustrato, los microorganismos, la aireacin y la
produccin de agua y de calor.
En los procesos industriales de compostaje a travs del compostaje aerobio,
donde se apila la materia orgnica, existen zonas interiores de las pilas con
menor presencia de oxgeno y, por lo tanto, menor actividad microbiana de
carcter aerobio. Un correcto volteo de la pila reinicia el proceso debido a la
Ibid., p.50.
NEGRO, M. Op. cit., p. 10
24
25
13
14
agua saturar los poros e interferir la distribucin del aire a travs del
compost. En procesos en los cuales los principales componentes sean
substratos tales como aserrn, astillas de madera, paja, hojas secas, se
necesita una mayor humedad, mientras en materiales como los residuos de
alimentacin, etc., la humedad necesaria es mucho menor.
Temperatura: Durante el proceso de compostaje la temperatura vara
dependiendo de la actividad metablica de los microorganismos. De acuerdo
a este parmetro, el proceso de compostaje se puede dividir en cuatro
etapas: mesfila, termfila, enfriamiento y maduracin.
15
16
Sistemas cerrados.
Este sistema de compostaje se realiza
normalmente en reactores cerrados. Los sistemas mecnicos se disean
para minimizar la produccin de olores y la duracin del proceso controlando
las condiciones ambientales tales como el flujo de aire, La temperatura y la
concentracin de oxigeno. Se dividen en sistemas de flujo pistn y
dinmicos30
17
31
18
VALOR
30-35:1
75-150:1
Tamao de partcula
Contenido en humedad
Aireacin
Temperatura
Agitacin
Control pH
Tamao
Bacterias Oxignicas
Bacterias Anoxignicas
Mohos y Levaduras
Actinomicetos
Pseudomonas
Bacterias Fijadoras de N
19
. Ibid., p.28.
NEGRO, M y SOLANO, M. Laboratory composting assays of de solid residue resulting
from flocculation of oil mill wastewater with different lignocellulosic residues. Compost
Science and Utilization, 1996. 4 (4), 62-71.
33
34
20
Almidn
Amilasa
Dextrinas
Maltosa
Celulosa
Glicgeno
Glucosa
Glucosa
Glucosa
35
21
Sacarosa
Glucosa + Fructosa
Maltasa
Maltosa
Glucosa
2CH3COCOOH + 4H
36
37
Ibid., p.519
Ibid., p.519
22
1.4
CRITERIOS DE SELECCIN DE LOS MICROORGANISMOS
ACELERADORES.
El objetivo principal de este proyecto fue la obtencin de un grupo de
microorganismos oxignicos que acten en conjunto en la aceleracin del
GARZON, M., GUTIERREZ, E. y RIOS, J. Produccin a escala de laboratorio de un pool de
microorganismos aceleradores de compostaje. Tesis de Grado. Ingeniera Qumica UIS, p.30
39
MADIGAN, M., MARTINKO, J., y PARKER, J. Op. cit., p. 521.
38
23
24
42
43
Ibid., p.32.
GRAY, K y BIDDLESTONE; A. The Chemical Engineering. London. 1973. p 89.
25
26
2. METODOLOGA EXPERIMENTAL
27
Toma de Muestras
(Pollinaza sin
compostar)
C/ N /P/ K
Materia
Orgnica
pH
Temperatura
Textura
Color
Anlisis Microbiolgico
Calidad
Sanitaria
Caracterizacin
Microbiolgica
Recuento de
Microorganismos
Benficos.
Recuento Total:
*Mesfilos
aerobios
*CT
*CF
*Mohos y
Levaduras
*CSR
Salmonella
Siembra y
AISLAMIENTO
Microorganismos
en medios
Selectivos y
Diferenciales.
*Nitrificantes
*Rhizobium
*Azotobacter
*Streptomyces
*Pseudomonas
*Lactobacillus
28
Control de variables
pH, TC, aireacin,
tiempo
29
26 C
56
das
1 ml
1 ml 1 ml 1 ml
Recuento
UFC/gr
1 ml
Agar Chromocult
+ 1ml de dilucin
225 ml AP +
25 gr. Pollinaza
9 ml de AP + 1ml
dilucin
Agar de Recuento
+ 1ml de dilucin
10 ml Homogenizado
37 C
6-12 h
37C
Cmara de
Anaerobiosis
72 horas 37C
12-24 horas
Enriquecimiento selectivo
37 C
24-48
horas
Siembra Brilla
Pruebas Bioqumicas y
serolgicas
Presencia / Ausencia
Salmonella
30
31
MUESTRA
POLLINAZA SIN
COMPOSTAR
(25 Gramos)
INCUBACION
Caldo Tioglicolato
37C 24, 48horas, y
25C 7 das
Caldo/Agar Nutritivo
Agar Kanamicina
(AN / AK)
Agar MacConkey
(Mck) -Medio Pollinaza
modificado 20%
Agar Sabouraud,
(Sab)-YGC
INCUBACION
T=37C
t=24 horas
INCUBACION
T=37C
t=48 horas
INCUBACION
T=25C
t=48 horas
REPIQUES
(AN, AK)
T37C, t: 24h
REPIQUES
(McK)
T37C, t: 24h
REPIQUES
(Sab) (YGC)
T25C, t: 120h
OBSERVACION
Macroscpica y
Microscpica
OBSERVACION
Macroscpica y
Microscpica
OBSERVACION
Macroscpica y
Microscpica
AISLAMIENTO
Bacterias Gram+
AISLAMIENTO
Bacterias Gram -
AISLAMIENTO
Hongos
IDENTIFICACION
Pruebas
Bioqumicas
IDENTIFICACION
Pruebas
Bioqumicas
IDENTIFICACION
Pruebas
Bioqumicas
32
33
2.4
SELECCIN
ACELERADORES.
DE
MICROORGANISMOS
OXIGNICOS
34
35
Calor Hmedo. Los medios de cultivo y las diferentes partes del montaje se
esterilizaron en un autoclave elctrico de 15 litros de capacidad y presin
mxima de trabajo de 15 libras de presin (psi).
Calor seco. Para la esterilizacin del material de vidrio se emplearon estufas
elctricas de 200 Watts con temperatura mxima de calentamiento de 220C.
Equipos de Calentamiento. Para el calentamiento de los medios de
cultivo se emplea una estufa elctrica con controlador de temperatura.
En las curvas de crecimiento se emple un bao termostatado (Memmert)
con controlador automtico de temperatura y agitacin como el que se
muestra en la figura 7.
Sistema de aireacin. Se emplearon bombas de acuario con 0.6
volmenes de aire con mangueras de catter estril.
Agitacin. La agitacin se realiz en placas magnticas con nivel de
agitacin variable como el sistema mostrado en la figura 8.
Cuantificacin de la Biomasa. Cmara de Neubauer. Para efectuar
conteo directo al microscopio. (Fig.9).
Espectrofotmetro de Absorcin Atmica DR/200. Permite cuantificar la
turbidez (%T) de los medios lquidos, la cual se relaciona con la
concentracin de clulas mediante la escala de McFarland. (Fig.10)
Equipo de Filtracin: empleado para filtracin al vaco de la biomasa
de hongos, consta de un elenmeyer de 500 ml con salida lateral
conectado a una bomba de Vaco. (Fig.11).
Centrfuga HERMLE Z 230 A: equipo utilizado para la centrifugacin
de hongos y levaduras con el fin de concentrar la mayor cantidad de
biomasa de los hongos identificados para su posterior conservacin y
preservacin. (Fig.12)
36
37
en medio slido (Agar Nutritivo) para todas las combinaciones posibles de los
microorganismos.
La prueba consisti en una siembra inicial abundante de la especie X a
analizar en la mitad del rea superficial de una caja de petri, dejndose
incubar durante 24 horas, posteriormente se siembra la otra especie Y en la
misma caja mediante una estra perpendicular y muy cerca de la siembra
inicial, incubndose durante 48 horas a 37C. El periodo inicial de 24 horas
permite que el microorganismo X produzca una cantidad suficiente de
sustancias que inhiban o favorezcan el crecimiento de la otra especie.
Las pruebas eran de compatibilidad positiva si ambas especies presentaban
un buen crecimiento sin distincin entre los dos tipos de colonias, por el
contrario las pruebas eran negativas si se observaba un retroceso en el
crecimiento de alguna de las especies, sta inhibicin en el crecimiento
poda verse de dos formas, la primera es el crecimiento de la estra
ocasionando un repliegue de la siembra abundante aqu se dice que la
especie Y inhibe el crecimiento de X, la segunda es el crecimiento normal de
la especie X (siembra abundante), inhibindose totalmente la extensin de la
estra, en este caso la especie X es la inhibidora del crecimiento en la otra
especie.
De acuerdo a estos primeros resultados, a las especies que no presentaban
indicios de inhibicin entre s se les realiz un estudio mas a fondo de
crecimiento en medio lquido con el fin de determinar la factibilidad de la
produccin conjunta de las especies, la cual representara ventajas en
trminos econmicos de produccin en un posible proceso a mayor escala.
En este ensayo se cultivaron juntas las especies que no representaron
inhibicin empleando como medio de cultivo caldo Tioglicolato modificado
con pollinaza al 20%.
2.5.3 Determinacin de la cintica de crecimiento. Para el caso de las
Bacterias, y la Levadura las pruebas se realizaron por duplicado en frascos
de 500 ml con un volumen de 350 ml de medio de cultivo, partiendo de un
inculo de 2.8*108 clulas para cada uno de ellos (Fig.13 y 14).
Para los hongos se realizaron pruebas por duplicado en una serie de 11
frascos de vidrio de 300 ml con un volumen de medio de cultivo de 150 ml
38
39
40
41
Filtracin al Vaco
Secado 50C- 6 h
Pesado en Balanza de
Precisin
2.5.4 Aplicacin sobre residuos Avcolas. Esta etapa tiene como fin
evaluar el desempeo de los microorganismos y la dosificacin adecuada del
pool, aplicando el conglomerado microbiano en procesos de compostaje de
residuos orgnicos
2.5.4.1 Determinacin de la dosificacin adecuada del inculo. Al
realizar una bioaumentacin es necesario tener en cuenta en que proporcin
y cantidad se encuentran distribuidas las diferentes especies dentro del
ecosistema de una pila de compostaje y hacer una adicin de carga
microbiana que conserve estas proporciones. De esta manera se asegura
que no habr una alteracin marcada de las relaciones simbiticas de los
microorganismos; que de presentarse podran traer beneficios o perjuicios
para el desarrollo del proceso del compostaje.
Para determinar la dosificacin adecuada del producto se evalu el
desarrollo de dos sistemas de compostaje uno sin bioaumentacin y otro con
la adicin de inculo en cantidades especficas (cada uno por duplicado), en
stas pruebas no se vari la proporcin de las distintas especies microbianas
en el inculo: Bacillus y Bacterias Gram negativas (enterobacterias)
Oxignicas 81%, Pseudomonas 1.6%, Actinomiceto 16% y Hongos 1.4%.
42
43
44
45
45
de
46
3. RESULTADOS Y DISCUSION
Unidades
Mtodos
Pollinaza
Abono
Orgnico
%
%
g K/Kg Base Seca
mg/Kg Base Seca
mg/Kg Base Seca
%
%
g/cc
C
Calcinacin
*S.M 4500
Ion Selectivo
S.M 4500-P-E
S.M 3112-B
Gravimetra
Gravimetra
33,49
3,27
60,96
2,18
0,35
80,40
45,14
1,110
28
35,50
3,18
33,50
2,38
0,20
52,57
46,22
1,11
26,5
Temperatura
pH
Potencimetro
5,8
6,9
Fuente: Laboratorio de Calidad Ambiental de la Corporacin Autnoma Regional del canal
de Dique. *S.M Estndar Methods Edicin 20.
46
47
Recuento
Coliformes Totales
Pollinaza (UFC/gr)
Abono Orgnico
(UFC/gr)
9 X 106
23
3 X 10
Mesfilos
3 X 10
4 X 102
Mohos y Levaduras
2 X 107
2 X 107
Ausencia
Ausencia
Coliformes Fecales
Salmonella
<3
*CSR
1 X 10
Ausencia
UFC/gr Unidades Formadoras de Colonias por gramo de compost.
*CSR Clostridio Sulfito Reductor.
48
UFC/g de compost
1,0E+07
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
5
15
25
Dias de compostaje
CT
CF
49
Pollinaza
UFC/gr*
Abono Orgnico
UFC/gr
Rhizobium
Azotobacter
Streptomyces
2 X 102
1 X 102
3 X 102
3 X 104
3 X 105
4 X 106
3 X 104
Lactobacillus
9 X 102
4 X 104
Microorganismos
Bacterias Nitrificantes
14
3 X 103
Pseudomonas
*UFC/gr Unidades Formadoras de Colonias por gramo.
Color
Rosado
Tamao
Mediano
Forma
Elevada convexa
Bordes
Irregulares
Aspecto
Brillante
Lisa de consistencia
Mucoide
Superficie
50
Color
Tamao
Pequea
Forma
Plana
Bordes
Irregulares filamentosos
Aspecto
Opaco y mate
Lisa de consistencia
blanda
Superficie
Color
Crema
Tamao
Mediana
Forma
Elevada Convexa
Bordes
Irregulares lobulados
Aspecto
Brillante
Superficie
Mamelonada Mucoide
Color
Blanco lechoso
Tamao
Pequea
Forma
Plana
Bordes
Redondo
Aspecto
Opaco
Lisa
de
blanda
Superficie
51
consistencia
Color
Crema
Tamao
Pequea
Forma
Plana
Bordes
Irregular lobulado
Aspecto
Opaco
Lisa
de
blanda
Superficie
consistencia
Color
Blanco lechoso
Tamao
Mediana
Forma
Elevada Convexa
Bordes
Irregular lobulado
Aspecto
Superficie
Brillante
Mamelonada Mucoide
52
cepas
cepa 1
cepa 2
cepa 3
cepa 4
cepa 5
cepa 6
cepa 7
cepa 8
cepa 9
cepa 10
cepa 11
cepa 12
cepa 13
cepa 14
cepa 15
cepa 16
cepa 17
cepa 18
cepa 19
Caractersticas Macroscpicas
Color
Superficie Forma Aspecto
Caractersticas
Microscpicas
Cocobacilos Gram negativos
rectos no esporulados
Bacilos Gram negativos rectos
no esporulados
Bacilos Gram negativos rectos
no esporulados
Bacilos Gram negativos rectos
no esporulados
cocobacilos Gram negativos
curvos no esporulados
Bacilos Gram negativos rectos
capsulados
Bacilos Gram negativos rectos
no esporulados
coco-Bacilos Gram negativos
no esporulados
Cocobacilos Gram negativos
no esporulados
Bacilos Gram negativos rectos
y curvos no esporulados
Bacilos Gram negativos
levemente curvos no
esporulados
Bacilos Gram negativos rectos
y curvos no esporulados
Bacilos Gram positivos
endospora central
Bacilos Gram positivos
Endospora Terminal
Bacilos Gram positivos
endospora central
Bacilos Gram positivos
endospora central
Bacilos Gram positivos
filamentosos
Bacilos Gram positivos
filamentosos
Bacilos Gram positivos
filamentosos
Rosada
Mucoide
Plana
Brillante
Translcida Blanda
Convexa Opaca
Rosada
Blanda
Plana
Blanca
Blanda
Convexa Brillante
Rosada
Mucoide
Plana
Crema
Blanda
Convexa Brillante
Rosada
Blanda
Plana
Brillante
Brillante
Opaca
Translcida Blanda
Convexa Brillante
Blanca
Blanda
Plana
Rosada
Blanda
Convexa Brillante
Translcida
pigmento
Blanda
verde
Convexa Brillante
Beige
Mucoide
Convexa Brillante
Blanca
Blanda
mucoide
Plana
Opaca
Brillante
Translcida Blanda
Convexa Brillante
Amarilla
Blanda
Plana
Opaca
Amarilla
dura
Plana
Opaca
Blanca
Dura
Plana
Opaca
Crema
Mucoide
Convexa Brillante
Rosada
Mucoide
Convexa Opaca
53
Cepa
1
Cepa
2
Cepa
3
Cepa
4
Cepa
5
Cepa
6
Cepa
7
Cepa
8
Cepa
9
K/K
K/A
A/A
A/A
K/A
A/A
A/A
K/K
K/K
K/K
K/A
K/K
K/A
K/K
K/K
R/A
K/K
K/K
-/+
-/-
-/+
-/-
-/+
-/+
++/+
-/+
-/-
(-)
(+)
(-)
Voges
Proskauer
37C
Ureasa
DNAsa
+
d
Reduccin
+
+
(+)
+
+
+
+
de Nitratos
Fenilalanina
(-)
+
Deaminasa
Malonato
+
d
+
+
Oxidasa
Catalasa
+
+
+
+
+
+
+
+
+
K= reaccin alcalina. A= Reaccin acida. R= Rojo: reaccin que ocurre en la superficie del
medio de Lisina por la deaminacin del aminocido por el gnero Proteus. d= dbil 1 a 3
das
47
54
Produccin de cido
en medio Basal OF
(1% de Carbohidrato)
Glucosa
Fructosa
Galactosa
Manosa
Rhamnosa
Xilosa
Lactosa
Sacarosa
Maltosa
Manitol
H2S
Reduccin de NO3
Gas
Fenilalanina deaminasa
Hidrlisis
Oxidasa
Motilidad
rea
Almidn
DNA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Cepa 13
Motilidad
+
+
Acido
+
+
Gelatina
+
+
Gas
+
Acetona
+
Catalasa
+
+
Hidrlisis de Almidn
+
+
Crecimiento en NaCl 7%
+
Hidrlisis de Casena
+
Ubicacin de la espora
C*
T*
C: central / T: terminal
+
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
C
Taxonmica
de
los
55
GRAM
NEGATIVAS
BACTERIAS
GRAM
POSITIVAS
HONGOS
ESPECIE
Serratia marcescens
Cedecea davisae
Kluyvera cryocrescens
Enterobacter aglomerans
Enterobacter aergenes
Klebsiella oxytoca
Proteus vulgaris
Alcaligenes denitrificans
Acinetobacter calcoaceticus
Pseudomonas putida
Pseudomona fluorescens
Pseudomona cepacia
Bacillus subtilis
Bacillus macerans
Bacillus licheniformis
Bacillus megaterium
Streptomyces griseus
Actynomices pyogenes
Nocardia corallina
Aspergillus fumigatus
Aspergillus flavus
Aspergillus penicilloides
Penicillium chrysogenum
Cunninghamella achinulata
Curvularia spp
Trichoderma vride
Saccharomyces cerevisae
49
56
3.3
SELECCIN
ACELERADORES
DE
GRUPOS
DE
MICROORGANISMOS
Ibid., p. 298
57
100X
100X
58
100X
100X
100X
59
100X
60
Luz Ultravioleta
100X
61
Agar Cetrimide
100X
62
sobre
carbohidratos
pectinas.
100X
B. megaterium
B. macerans
63
100X
Actinomicetos:
Nocardia corallina: Bacilos irregulares, en pares o aislados o filamentosos
ramificados. Son gram positivos o gram variables y a veces se tien de
manera no uniforme, poseen grnulos metacromticos. No mviles, no
endosporados. Oxignicos son eficaces en el tratamiento de residuos de
degradacin difcil como los lignocelulsicos, adems es til frente a
compuestos aromticos como rastros de plaguicidas y herbicidas. (Fig. 49)
Figura 49. Crecimiento macroscpico (AK) y microscpico de Nocardia
corallina.
100X
64
Hongos y Levaduras:
Aspergillus fumigatus y Aspergillus flavus: en la tabla 13 se enumeran las
caractersticas macroscpicas y microscpicas de estas dos especies de
hongos Deuteromycetes.
Tabla 13. Caractersticas macroscpicas y microscpicas de Aspergillus
fumigatus y Aspergillus flavus.
Aspergillus flavus
Aspecto
aterciopelado
o
pulverulento fino. Reverso de la
colonia incolora a roja.
*Cabeza conidiana: Va de verde *Cabeza conidiana: Amarilla-verdosa
claro a verde oscuro, su forma tpica claro a verde oscura.
de columna a veces muy compacta.
*Vescula: en forma de mazo, frtil *Vescula. En las especies de cabeza
a partir de la mitad o 3/4 partes grande Globosa o subglobosa y en
forma de mazo o de pera en las
superiores.
especies de cabeza pequea.
*Fialides o Esterigmas: una sola *Fialides: uni o biseriadas o con las
serie llevada directamente por la dos caractersticas presentes en la
microscpicas
misma variedad incluso en la misma
vescula.
vescula.
*Conidiforo: corto, liso, coloreado *Conidiforo: Hialino en general
rugoso, pero puede variar de muy
de verde en la zona terminal.
rugoso a liso.
*Conidias: redondas o elpticas, *Conidias: Elpticas inicialmente y
luego globosas o subglobosas y de
equinuladas ligeramente rugosas.
tamao variable. Esclerotes: varan de
color caf a negro, su forma es
*Cleistotecios: no presente.
globosa, subglobosa o alargada.
65
40X
40X
40X
40X
66
40X
10X
10X
40X
40X
40X
67
Agar Czapec
Agar extracto
de Malta
Agar Sabouraud
Agar YGC
51
68
Caractersticas
macroscpicas
Penicillium chrysogenum
(Thom)
Cunninghamella achinulata
(Thaxter)
Hbitat
Las
esporangiolas
estn
implantadas
en
pequeos
esterigmas dando la apariencia de
macetas, son esfricas u ovoides y
miden entre 11 y 14 m de largo las
esporangiolas son ornamentadas
por espinas muy finas (Fig. 55) que
se pierden cuando el hongo
envejece.
Cosmopolita frecuente en el suelo. Se ha aislado en diferentes pases
Productor
de
Penicilina
en aunque no esta extremadamente
pequea cantidad.
diseminado, se asla del suelo, del
aire y de diferentes plantas.
69
40X
40X
40X
70
macroscpicas
microscpicas
40X
40X
40X
40X
de.
71
40X
40X
Esporangiola
40X
40X
40X
Hifas
hialinas
40X
Esporangiolas ornamentadas
72
40X
40X
40X
73
74
40X
75
Pollinaza
20%
Pollinaza
40%
Pollinaza
80%
Agar
Nutritivo
Serratia marcescens
+
+
++
+
Kluyvera cryocrescens
+
+
+
Enterobacter aglomerans
+
++
++
Enterobacter aerogenes
++
+
Klebsiella oxytoca
+
+
Alcaligenes denitrificans
+
Acinetobacter calcoaceticus
++
+
Pseudomonas putida
+
+
Pseudomona fluorescens
+
++
++
++
Pseudomona cepacia
+
++
+
Bacillus subtilis
+
+
+
Bacillus macerans
+
+
++
Bacillus licheniformis
+
Bacillus megaterium
+
+
+
+
+
+
Streptomyces griseus
++
+
Actynomices pyogenes
++
+
Nocardia corallina
+
+
+
+
Aspergillus fumigatus
+
+
+
+
Aspergillus flavus
++
+
Aspergillus penicilloides
+
Penicillium chrysogenum
+
+
+
Cunninghamella achinulata
+
++
++
+
Curvularia spp
+
++
Trichoderma vride
+
++
Saccharomyces cerevisae
+
++
++
+
(-): crecimiento escaso/no crecimiento. (+): crecimiento. (++): crecimiento abundante
76
77
108 cel/ml
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0
1,5
11
13
17
22
26
31
tiempo (h)
aireacin 26 C
aireacin 37 C
A pesar de que el ensayo con aireacin a 26C emple dos horas mas (24 h)
para alcanzar la fase estacionaria que el ensayo sin agitacin a 37C, se
obtuvo un mayor numero de clulas en ste, hecho que es muy importante
ya que el objetivo es lograr es una bioaumentacin mayor de
78
1,40
1,20
108 cel/ml
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0
1,5
11
13
17
22
26
31
tiempo (h)
Agitacin 26C
Agitacin 37C
1,40
1,20
10 8 cel/m l
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0
1,5
Agitacin 26C
sin agitacin 37C
aireacin 37 C
9
11
Tiempo (h)
sin Agitacin 26C
aireacin 26 C
sin aireacin 37C
79
13
17
22
26
Agitacin 37C
sin aireacin 26C
31
Parmetro
agitacin 26C
sin Agitacin 26C
agitacin 37C
sin agitacin 37C
aireacin 26 C
sin aireacin 26C
aireacin 37 C
sin aireacin 37C
Nmero de
generaciones
4
3
3
3
4
3
3
3
Tiempo (h) de
generacin
6,07
8,50
8,05
6,29
5,43
8,00
6,86
7,64
2,5
10 8 cel/ml
2
1,5
1
0,5
0
0
10
Horas
Agitacin
80
Sin Agitacin
12
14
16
0,08
0,15
0,50
0,70
1,14
1,35
1,57
2,03
2,22
1,90
1,47
Sin
Agitacin
0,08
0,11
0,33
0,55
0,60
1,08
1,35
1,52
1,86
1,65
1,27
Tiempo (h)
Agitacin
26C
(g/50ml)
Agitacin
37C
(g/50ml)
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
0,093
0,097
0,104
0,135
0,168
0,358
0,6
0,698
0,705
0,841
0,954
0,851
0,093
0,102
0,105
0,221
0,459
0,798
1,008
1,246
1,325
1,414
1,494
1,379
81
Sin
Sin
agitacin
agitacin
26C(g/50ml) 37C(g/50ml)
0,093
0,096
0,102
0,123
0,135
0,216
0,278
0,451
0,592
0,752
0,84
0,823
0,093
0,098
0,101
0,118
0,232
0,479
0,778
0,772
0,854
0,982
1,169
1,163
Biomasa (g/50ml)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
12
24
36
48
60
72
84
96
108
120
132
horas
Agitacin 26C
Agitacin 37C
82
Das
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Temperatura C
pH
compostaje Compostaje compostaje Compostaje
natural
acelerado
natural
acelerado
25,0
30,0
32,0
35,0
36,0
38,0
42,0
44,0
44,7
46,7
49,0
49,8
50,6
52,0
52,9
55,3
62,0
60,0
56,0
64,0
58,0
59,0
58,4
50,0
42,0
44,0
42,0
41,0
36,0
33,7
25,0
32,5
39,2
44,3
53,0
58,0
62,0
72,0
69,0
63,0
68,6
62,0
64,0
65,0
68,0
64,8
69,4
70,0
68,2
72,0
70,0
65,0
54,9
49,4
34,5
27,5
26,3
26,0
26,3
26,0
83
5,8
5,4
5,3
6,0
6,0
6,1
6,2
6,1
6,1
6,2
6,4
6,5
6,5
6,4
6,8
6,9
7,1
7,3
7,5
7,6
7,4
7,3
7,1
7,1
6,9
6,6
6,8
6,8
6,5
6,3
5,4
5,2
6,2
7,2
7,5
8,1
8,1
8,2
8,0
7,9
7,9
7,8
7,9
7,7
7,5
7,3
7,1
7,0
7,0
7,3
7,4
7,2
7,2
7,1
7,0
6,8
6,9
6,8
6,9
6,9
Temperatura C
70
60
Etapa Termoflica
50
40
30
20
10
0
1
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Das
compostaje natural
Compostaje acelerado
84
9
8
pH
7
6
5
4
3
1
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Dias
compostaje natural
Compostaje acelerado
85
%
Germ
2
3
4
5
6
7
8
0,54
0,58
0,62
0,73
0,75
0,75
0,75
Long
Raz
(mm)
3,53
8,73
14,57
19,28
24,10
28,73
33,68
Long
Tallo
(mm)
0,00
0,00
0,00
7,22
13,2
18,62
28,66
Pollinaza sin
compostar
%
Germ
0,07
0,08
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
Long
Raz
(mm)
0,10
0,50
0,95
1,45
2,03
2,67
3,30
86
Long
Tallo
(mm)
0,00
0,00
0,00
1,38
1,77
2,63
3,45
Abono Orgnico
%
Germ
0,27
0,67
0,75
0,75
0,75
0,77
0,77
Long
Raz
(mm)
1,07
5,55
12,37
18,93
23,98
29,75
38,30
Long
Tallo
(mm)
0,00
0,00
0,00
16,87
29,25
40,65
51,82
La etapa inicial del bioensayo donde se observan los tres tratamientos: agua
destilada (AD), pollinaza sin compostar (PC) y pollinaza compostada abono
orgnico (AO) cada uno con 10 semillas de tomate y 6 rplicas se muestras
en la figura 67.
Figura 67. Etapa inicial del bioensayo de respuesta biolgica.
Agua destilada
87
Abono Orgnico
88
AD
AD
PC
PC
AO
AO
AD
PC
AO
89
Germinacin
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1
Dias
AD
P-C
90
AO
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
1
Das
AD
P-C
AO
45,0
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
1
Das
AD
P-C
AO
91
92
93
94
Agua destilada
Pollinaza cruda
0,000149
Agua destilada
Pollinaza cruda 0,000149
Abono orgnico 0,996223
Abono orgnico
0,996223
0,000149
0,000149
Agua destilada
Pollinaza cruda
0,512919
Agua destilada
Pollinaza cruda
0,512919
Abono orgnico
0,381241
Abono orgnico
0,381241
0,057262
0,057262
95
Longitud de la raz
Tratamiento
Agua destilada
0,011118
Agua destilada
Pollinaza cruda
0,011118
0,997184
0,012958
0,012958
Como se observa en los resultados del test de Tukey y en las graficas de las
Anovas se puede deducir que el tratamiento que marca la diferencia es el de
la pollinaza sin compostar.
Una razn para justificar estos resultados es que posiblemente la aplicacin
de la pollinaza sin compostar pudo provocar como efecto ms destacado un
bloqueo biolgico del Nitrgeno asimilable, lo que ocasion un descenso del
contenido del nutriente en la planta y en definitiva un menor porcentaje de
germinacin y un menor crecimiento.
La inmovilizacin del N mineral se debe a que la pollinaza sin compostar
posee una relacin C/N elevada debido principalmente a que va a tener un
alto contenido de sustancias hidrocarbonadas. Adems la incorporacin de
pollinaza insuficientemente madura origina la descomposicin posterior de
sustancias que pueden producir serios daos tanto a las semillas como a la
plntula de tomate.
Se ha descrito tambin que la aplicacin de pollinaza sin previo tratamiento
produce un descenso en el contenido de oxigeno y del potencial de Oxidoreduccin favoreciendo la creacin de zonas de anaerobiosis y fuertemente
reductoras (Negro y Solano, 1996), esto unido a un fuerte aumento de la
temperatura puede llegar a inhibir la germinacin y producir una disminucin
en el desarrollo de las plantas especialmente cuando se encuentran en
estadios mas jvenes.
Otra razn para explicar el bajo crecimiento de la raz y el tallo de la plntula
de tomate en el tratamiento con pollinaza cruda es que sta puede adems
reducir la respiracin de las races, hacer ms lenta la absorcin de
elementos minerales y disminuir la sntesis de giberelinas y citoquininas y su
transporte a las partes areas.
96
97
4. CONCLUSIONES
98
99
5. RECOMENDACIONES
100
BIBLIOGRAFA
101
102
Abono
orgnicos
fermentados
103
104
ANEXOS
105
ANEXO 1
( Na2HPO4)
(KH2PO4 )
(MgSO4*7H2O )
(NaHCO3)
((NH4)2SO4)
( FeCl3*H2O)
(CaCl2*7H2O)
6.75 gr
0.35 gr
0.05 gr
0.25 gr
1.25 gr
7.2 mg
9.2 mg
7.5 gr
500 ml
10.0 gr
0.5 gr
0.2 gr
0.1 gr
3.0 gr
100 ml
900 ml
8.6 gr
0.3 gr
0.33 gr
0.01% p/v
1000 ml
106
107
ANEXO 2
%T
100
87,6
67,1
55,2
32,2
22
15,2
9
6,8
5,1
4,6
3,9
2,8
1,3
[ ]* 108
m.o/ml
0,1
0,75
1,5
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
108
ANEXO 3
Cepa Dominio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Bacteria
Phylum
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Proteobacteria
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Firmicutes
Clase
Orden
Familia
Gnero
Especie
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Betaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Bacilli
Bacilli
Bacilli
Bacilli
Bacilli
Bacilli
Bacilli
Enterobacteriales
Enterobacteriales
Enterobacteriales
Enterobacteriales
Enterobacteriales
Enterobacteriales
Enterobacteriales
Burkholderiales
Pseudomonadales
Pseudomonadales
Pseudomonadales
Pseudomonadales
Bacillales
Bacillales
Bacillales
Bacillales
Actinomycetales
Actinomycetales
Actinomycetales
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Alcaligenaceae
Moraxellaceae
Pseudomonadaceae
Pseudomonadaceae
Pseudomonadaceae
Bacillaceae
Bacillaceae
Bacillaceae
Bacillaceae
Streptomycetaceae
Actinomycetaceae
Nocardiaceae
Serratia
Cedecea
Kluyvera
Enterobacter
Enterobacter
Klebsiella
Proteus
Alcaligenes
Acinetobacter
Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Streptomyces
Actynomices
Nocardia
marcescens
davisae
cryocrescens
aglomerans
aergenes
oxytoca
vulgaris
denitrificans
calcoaceticus
utida
fluorescens
cepacia
subtilis
macerans
licheniformis
megaterium
griseus
pyogenes
corallina
109
ANEXO 4
Cepa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
- -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
- -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
10
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
11
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
12
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
13
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
14
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
15
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
16
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
17
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
18
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
19
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
20
- -
- + + + + + + + +
21
- -
- + + + + + + + +
22
- -
- + + + + + + + +
23
- -
- + + + + + + + +
24
- -
- + + + + + + + +
25
- -
- + + + + + + + +
26
- -
- + + + + + + + +
27
- -
- + + + + + + + +
110
Anexo 5
37 C
Sin
sin
sin
sin
Tiempo
(horas) Agitacin Agitacin aireacin aireacin Agitacin agitacin aireacin aireacin
cl/ml
cl/ml
cl/ml
cl/ml
cl/ml
cl/ml
cl/ml
cl/ml
(108)
(108)
(108)
(108)
(108)
(108)
(108)
(108)
0
0,75
1,5
2,25
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
15
17
19
22
24
26
29
0,08
0,08
0,08
0,09
0,10
0,12
0,19
0,32
0,48
0,62
0,73
0,82
0,93
0,96
0,99
1,06
1,08
1,13
1,18
1,24
1,22
1,09
0,08
0,08
0,08
0,08
0,09
0,10
0,12
0,20
0,24
0,29
0,32
0,34
0,38
0,38
0,41
0,46
0,48
0,52
0,56
0,57
0,55
0,43
0,08
0,10
0,24
0,35
0,45
0,52
0,58
0,70
0,72
0,78
0,83
0,85
0,98
1,02
1,08
1,14
1,20
1,23
1,28
1,32
1,27
1,15
0,08
0,07
0,10
0,15
0,18
0,21
0,24
0,28
0,32
0,38
0,42
0,43
0,45
0,45
0,52
0,54
0,59
0,57
0,62
0,64
0,60
0,46
0,08
0,08
0,09
0,10
0,10
0,21
0,30
0,37
0,44
0,50
0,53
0,57
0,58
0,60
0,60
0,60
0,60
0,61
0,62
0,63
0,61
0,50
0,08
0,08
0,08
0,08
0,08
0,12
0,24
0,31
0,38
0,43
0,46
0,51
0,54
0,57
0,55
0,57
0,57
0,65
0,61
0,60
0,60
0,44
0,08
0,12
0,25
0,28
0,36
0,39
0,45
0,49
0,58
0,61
0,63
0,66
0,67
0,70
0,66
0,71
0,71
0,70
0,74
0,74
0,72
0,56
0,08
0,12
0,18
0,25
0,36
0,41
0,42
0,49
0,52
0,58
0,58
0,61
0,63
0,64
0,65
0,69
0,68
0,69
0,67
0,71
0,67
0,49
31
1,06
0,37
1,09
0,37
0,43
0,38
0,46
0,44
111