El ADN Insertar control suministrado con el pGEM -T Easy

Sistemas pGEM -T y es un fragmento de 542bp de pGEM luc Vector DNA (Cat. # E1541 ) . Esta secuencia se ha mutado
para contener mltiples codones de Stop en todos los seis
marcos de lectura , lo que asegura un bajo fondo de colonias
azules para la reaccin de control . Los resultados obtenidos
con el ADN Insertar control pueden no ser representativos de
los obtenidos con su producto de PCR .
5.A. Secuencia y Multi-Site Clonacin del -T Vector pGEM
El -T vector pGEM se deriva de la pGEM -5Zf (+) vectorial
(GenBank N de acceso X65308). El pGEM -T vector fue
creado para linealizar el vector pGEM -5Zf (+) con EcoRV en
la base 51 y la adicin de una T a ambos extremos 3 '. El sitio
EcoRV no se recupera tras la ligadura del vector y el inserto.

Figura 1. El promotor y la secuencia de clonacin mltiple del

-T vector pGEM.
La cadena superior corresponde a los ARN sintetizados por la
ARN polimerasa T7. La cadena inferior corresponde a los ARN
sintetizados por ARN polimerasa SP6.

5.C. Secuencia y Multi-Site Clonacin del pGEM -T Easy

Vector
La secuencia de pGEM -T ha sido linealizado en la base 60
con EcoRV y un T aadido a ambos extremos 3 '. El sitio EcoRV
no se recupera tras la ligadura del vector y el inserto.
6.A. PCR pureza del producto
Una parte alcuota de la reaccin de PCR debe ser analizado
en un gel de agarosa antes de su uso en la reaccin de
ligacin. El producto de la PCR puede ser purific en gel o se
purifica directamente a partir de la amplificacin por PCR
utilizando el SV Gel Asistente y PCR Clean-Up System (N
de catlogo A9281). La exposicin a la luz ultravioleta de onda
corta debe reducirse al mnimo para evitar la formacin de
dmeros de pirimidina. Incluso si se observan distintas bandas
del tamao esperado, dmeros de cebadores deben eliminarse
mediante purificacin en gel o mediante el Asistente para SV
Gel y PCR System Clean-Up. Uso del producto de PCR bruto
puede producir la ligadura con xito en algunos casos, sin
embargo, el nmero de colonias blancas que contienen el
inserto correspondiente se puede reducir debido a la
incorporacin preferencial de dmeros de cebadores u otros
productos de reaccin extraos. Por lo tanto, puede ser
necesario para cribar numerosas colonias con el fin de
identificar los clones que contienen el producto de PCR de
inters.
6.B. Propiedades de las diversas polimerasas termoestables
No todas las polimerasas termoestables generan fragmentos
con fragmentos 3' de cola A.