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INFORME BAGAZO

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UNIVERSIDAD CENTRAL DELECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA QUIMICA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGIAINDUSTRIAL TEMA: INFORME

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS LEVADURIFORMES DEGRADADORAS DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

Integrantes: Arboleda Marcelo Cóndor Belén Cueva Nathaly Góngora Estefanía Curso: 9º ALIMENTOS

INDICE

1 TEMA:............................................................................................................... 3 2 INTRODUCCIÓN................................................................................................3 3 MARCO TEORICO..............................................................................................4 3.1 Bagazo de caña de azúcar.........................................................................4 3.1.1 Propiedades físicas y químicas del bagazo .........................................4 3.1.2 Componentes principales de la materia prima....................................5 3.2 Empleo de substrato orgánico por los microorganismos............................7 3.3 Organismos degradadores de lignina y mecanismo de biodegradación . . .8 3.3.1 Levaduras degradadotas de lignina .................................................8

4 MARCO METODOLOGICO..................................................................................9 4.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS..........................................................9 Muestreo......................................................................................................9 Preparación de la muestra...........................................................................9 4.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS.........................................................9 4.2.1 Diseño del medio de cultivo ................................................................9 AISLAMIENTO DE LEVADURAS DEGRADADORAS DE LIGNINA....................10 PURIFICACION............................................................................................10 IDENTIFICACION.........................................................................................10 SELECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS LEVADURIFORMES.....................10 4.2.1.1 Curva de crecimiento y evaluación de la capacidad degradadora de lignina.................................................................................................11 PRESERVACIÓN..........................................................................................11 5 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................11 6 ANEXOS..........................................................................................................14 6.1 Composición de medios de cultivo...........................................................14

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TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS LEVADURIFORMES DEGRADADORES DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

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INTRODUCCIÓN

El bagazo de caña de azúcar es un material lignocelulósico constituido principalmente por celulosa, hemicelulosa ligadas fuertemente a la lignina. Tradicionalmente en los centrales azucareros este desecho se quema como una forma de limitar la disposición final de este desecho, desperdiciando un elemento de tan valiosa importancia para diversas industrias como la fabricación de papel, producción de alimentos balanceados para animales y elaboración de aglomerados para la construcción, industrias donde se usa actualmente el bagazo de caña, pero no en todo su potencial. Se obtiene como subproducto o residuo en los centrales azucareros después de la extracción del jugo de caña de azúcar y representa aproximadamente entre el 25 y 40 % del total de la materia procesada, dependiendo del contenido de fibra de la caña y la eficiencia en la extracción del jugo. En el Ecuador existen cultivadas 79.913 Has. de caña de azúcar, y una producción bruta de 5 618 045 TM, con un rendimiento promedio de 70,30 TM/ha. El bagazo uno de los residuos agrícolas más abundantes con una producción anual estimada de 158 000 toneladas, obtenidas de los 6 ingenios azucareros existentes en el Ecuador y de otros productores pequeños. El bagazo de caña tiene en su composición 20% de lignina, y 80% entre celulosa y hemicelulosa, por lo que varias investigaciones han propuesto el uso de diversos microorganismos, cepas fúngicas degradadoras de lignina, un ejemplo de estos hongos es Phanerochaete chrysosporium, que crece en cultivo liquido y se ha demostrado que secreta enzimas ligninoliticas extracelulares que tienen la habilidad de degradar numerosos compuestos aromáticos policiclicos; la Ceriporiopsis subvermispora es otro hongo filamentoso capaz de realizar la biodegradación de la lignina. Un ejemplo más es Panus tigrinus, microorganismo que ha sido estudiado debido a su capacidad de producir lacasas y peroxidasas que atacan a la lignina, Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor, Trametes subectypus, Cariolopsis gallica y heterobasidion annosum, son algunos de los microorganismos estudiados debidos a su capacidad ligninocelulitica. Por lo que este proyecto va orientado al aprovechamiento de los residuos de la extracción del jugo de la caña de azúcar, al degradar la lignina en celulosa y hemicelulosa mediante organismos levaduriformes degradadores de este compuesto. Los objetivos del proyecto fueron:


• • •

Aislar levaduras con capacidad de degradar lignina a partir del bagazo de caña de azúcar.. Seleccionar las mejores cepas, de acuerdo a las condiciones de pH, temperatura y otras en las que ellas van a degradar el bagazo de caña. Identificar macro y microscópicamente las levaduras seleccionadas, y adaptarlas a un medio estable. Evaluar la capacidad de degradación de lignina de las levaduras aisladas del bagazo de caña. Preservar las levaduras seleccionadas mediante críocongelación.

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3
3.1

MARCO TEORICO
Bagazo de caña de azúcar

La caña de azúcar crece en climas tropicales y subtropicales. El bagazo es el residuo fibroso que queda de la caña después de ser exprimida y de pasar por el proceso de extracción. Por lo general el bagazo se utiliza en los ingenios azucareros como combustible, sin embargo para la industria papelera representa una de las materias primas más importantes. El bagazo, subproducto de la industria azucarera, conserva una posición única entre las fibras no leñosas consiste en que el costo de su recolección, la extracción de jugo y su limpieza, son cargo del ingenio azucarero. La temporada de procesamiento de la caña dura usualmente de cuatro a seis meses, pero se extiende hasta nueve meses en Hawai, Perú, México. Puede reunirse y almacenarse una cantidad adecuada de bagazo durante la temporada, con el fin de lograr una operación continua en la fábrica de pulpa en tanto llega la caña.

3.1.1

Propiedades físicas y químicas del bagazo

El bagazo completo esta integrado por tres componentes principales: El recubrimiento, en el que se incluye la epidermis, la corteza y el periciclo. Los mazos de fibra vascular, entre los que figuran las células conductoras de pared delgada asociadas con fibras de pared relativamente con estrecho lumen. El tejido básico (parénquima) o medula, con mazos de fibra distribuidos irregularmente.

La composición química de las diferentes fracciones de bagazo, incluyendo el bagazo entero, la fibra separada y la medula se indican en la Tabla 1. Tabla 1. Propiedades químicas de las fracciones del bagazo (2) Entero 0.25 4.1 2.5 20.2 26.7 76.6 38.1 1.67 Fibra 0.12 1.8 0.9 20.8 27.9 77.8 42.4 0.7 Medula 2.5 2.8 1.9 20.2 28.4 77.7 34.8 2.29

Solubilidad en éter (%) Solubilidad en alcohol-benceno (%) Solubilidad en agua caliente (%) Lignina (%) Pentosas (%) Hemicelulosa (%) Alfa celulosa (%) Ceniza (%)

3.1.2

Componentes principales de la materia prima

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Un material de interés en las paredes celulares de la planta de la madera, es el material ligninocelulósico, el cual esta formado por celulosas y hemicelulosas enlazadas mediante lignina, un polímero aromático altamente oxigenado, con un esqueleto de fenilpropano que se repite. Sobre esta matriz se deposita una mezcla de compuestos de bajo peso molecular llamados extractivos. a) Celulosa Es el componente más simple encontrado en el material ligninocelulósico de las plantas, es el más abundante en la biosfera. Esta compuesto por un polímero de residuos de D-glucosa unidos por enlaces β −1,4 , (Figura-1). Cada resto presenta una rotación de 180º respecto a los restos contiguos, estabilizada por puentes de hidrogeno intramoleculares. Debido a su estructura, las cadenas de celulosa se unen por puentes de hidrogeno intermoleculares formando agregados (microfibrillas). La celulosa y el almidón pueden ser hidrolizados para formar glucosa, pero sus estructuras son muy diferentes. La celulosa es una molécula que da estructura y soporte a la planta. Las cadenas de glucosa están arregladas de una manera que permite que se empaquen juntas formando un cristal que es impermeable al agua. Consecuentemente el polímero celulosa es insoluble y resistente a la hidrólisis.

Fig.1 Estructura química de la celulosa b) Hemicelulosa Las hemicelulosas forman cadenas cortas y son polímeros heterogéneos que contienen tanto hexosas (azúcares de 6 carbonos como glucosa, manosa y galactosa) como pentosas (azúcares de 5 carbonos como xilosa y arabinosa). Dependiendo de la especies de la planta, estos azucares se asocian con ácidos urónicos formando estructuras poliméricas diversas, qué pueden est6ar relacionados cercanamente tanto con celulosa como lignina. Los tres polímeros principales son los xilanos, los mananos y los arabinogalactanos. c) Lignina La lignina es un polímero complejo, tridimensional, globular, irregular, insoluble y de alto peso molecular (>10,000), formado por unidades de fenilpropano cuyos enlaces son relativamente fáciles de hidrolizar por vía química o enzimática. Ésta molécula tiene diferentes tipos de uniones entre unidades aromáticas de fenilpropano (Figura 2).

5

Fig.2 Estructura de la lignina En las plantas, la lignina se encuentra químicamente unida a la hemicelulosa y rodeado a las fibras compuestas por celulosa. Es responsable de la rigidez de las plantas y des sus mecanismos de resistencia al estrés y a ataques microbianos. Es especialmente abundante (20-30% del peso de la pared) en células conductoras (vasos xilemáticos) y estructuras (fibras) con engrosamiento secundario. En cuanto a su biosíntesis, se sabe que los precursores de la lignina se forman por conducto de la ruta correspondiente al acido shiquimico. Éste acido, formado por unión del acido fosfoenolpirúvico y eritrosa-4-fosfato, se convierte en el principal escalón de la biosíntesis de los aminoácidos Ltirosina y L-fenilalanina, que están formados por aminación reductiva. Las enzimas desaminantes convierten a continuación los dos aminoácidos en sus respectivas contrapartes del acido shinamico. La hidroxilación en etapas por hidroxilasa, y en su momento la metilación por o-metiltransferasas, transforma los ácidos shinámicos en los tres ácidos para hidroxi-shinámicos conocidos como precursores de la lignina. Por el productor de pulpa y de papel, la lignina es un componente de la madera que ocasiona de los problemas que surgen durante la producción de la pulpa. De no ser por la lignina no resultaría necesario aplicar reactivos fuertes alcalinos o ácidos para la deslignificación química de la madera a fin de obtener pulpa y productos de papel. La deslignificación es la meta más importante en la producción de papel. d) Extractivos Los extractivos son aquellas sustancias que se encuentran presentes en las diferentes fibras vegetales, pero que no son carbohidratos, tales como ácidos grasos, terpenos, fenoles y resinas. Muchos de estos compuestos son solubles en agua o disolventes orgánicos polares como el metanol, etanol o acetona, por lo que se eliminan rápidamente en los procesos extracción de celulosa.

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3.2

Empleo de substrato orgánico por los microorganismos

Todas las formas de vida, desde los microorganismos hasta los seres humanos toman del ambiente las sustancias que requieren para sintetizar su material celular, generar energía y efectuar un funcionamiento adecuado. Estas sustancias se denominan nutrientes o substratos y el consumo o degradación de los mismos, depende de los siguientes factores: Composición elemental, la estructura de las unidades básicas de repetición, los enlaces entre unidades de repetición, los nutrientes presentes en el ambiente, la comunidad microbiana presente y las condiciones abióticas como pH, potencial de oxido-reducción, O 2 , condiciones osmóticas. Los principales substratos complejos que utilizan los microorganismos se resumen en la Tabla-3 Tabla 3. Características de los substratos orgánicos complejos que influyen en la descomposición y la degradabilidad. Elementos presentes en gran cantidad Substrato Subunidad básica Enlaces C H O N P Degradación

Con

Sin

O2
Almidón Celulosa Hemicelulosa Glucosa Glucosa Monosacáridos C5 y C6

O2
+ + +

α(1 − 4)α(1 −6) +

+ + +

+ + +

-

-

+ + +

β(1 −4) β(1 −4) β(1 −3) β(1 −4)
Enlaces C-C, CO

+ +

Lignina Quitina Proteínas Hidrocarburos +Lípidos

Fenilpropano Nacetilglucosamina Aminoácidos Alifático, cíclico, aromático Glicerol, ácidos grasos

+ + + +

+ + + + +

+ + + +

+ + +

+

+ + + + +

+ + +/-+ +

β(1 −4)
Enlaces peptídicos

Esteres

+

La lignina es un caso especial en el que la biodegradabilidad depende la disponibilidad de oxigeno. A menudo no existe una degradación sustancial porque la mayoría de los hongos filamentosos que degradan lignina, pueden actuar solo en presencia de oxigeno.

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3.3

Organismos degradadores de lignina y mecanismo de biodegradación

Como se menciono anteriormente, la pared celular de los tejidos vegetales esta constituida por lignina, una substancia difícil de degradar y que los hongos descomponen debido a que poseen enzimas que rompen dicha molécula y dependiendo de cómo los hongos lo ataquen, se clasifican en hongos de pudrición blanca y hongos de pudrición parda (o de color café), Los hongos de pudrición blanca han sido ampliamente investigados como posibles organismos utilizados en la biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y en la degradación del polímero lignina . Estos hongos no pueden utilizar directamente lignina como su fuente de carbono y energía, por ello dependen de azúcares mas digeribles como los monómeros precursores de fenilpropano. La función primaria de la ligninólisis es exponer estos monómeros al ataque del hongo con ayuda diferentes tipos de enzimas. En la mayoría de los hongos se ha visto que la ligninólisis ocurre durante el metabolismo secundario, es decir bajo limitación de nutrientes, lo que permite que el hongo solo sintetice y secrete agentes ligninoliticos que comiencen a fragmentar el polímero. Por otra parte se sabe que dos de las mas conocidas peroxidasas (enzimas que atacan a la lignina) son secretadas por diversos hongos entre ellos Pleurotus eryngii. Una de ellas es la enzima es la enzima de manganeso peroxidasa y la otra es la enzima lignina peroxidada. Este hongo ha sido muy estudiado debido a su capacidad de degradar lignina selectivamente cuando crece en substratos naturales y por lo tanto es un organismo considerado como modelo para estudios de biodegradación de lignina y con aplicaciones biotecnológicas. En términos generales la degradación de lignina es catalizada por un complejo enzimático extracelular que poseen algunos hongos. Los mayores componentes de este sistema incluye a la enzima peroxidada (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y al enzima generadora de peroxido glioxal oxidasa (GLOX). Bajo condiciones de limitación de nutrientes en el medio de cultivo, diversos hongos son capaces de secretarlas.

3.3.1 Levaduras degradadotas de lignina
Como se menciono anteriormente, la descomposición de lignina la realizan principalmente basidiomicetos de pudrición blanca. Dichos hongos no tienen substrato específico y pueden oxidar a una gran variedad de componentes incluyendo contaminantes ambientales. Sin embargo existen otros microorganismos aislados del suelo que pueden tener una actividad similar. La habilidad de algunas especies de levaduras para biodegradar lignina ha recibido poca atención, en comparación con los hongos basidiomicetos. Recientemente, se ha descrito que algunas especies de levaduras como Candida ingeniosa, Rhodotorula graminis y Rhodotorula mucilaginosa son organismos que degradan productos derivados de lignina.

CARACTERISTICAS

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Descripción Fenotípica Hábitat Grupo trófico Fuente de Carbono y energía Grupo aceptor de electrones Fórmula maestra del bioproceso

Características típicas de levadura Bagazo de caña de azúcar. Quimiorganotrófico Lignina (Heterótrofo) Lignina (Organótrofo)
Levadura Lignina   →Célulosa 

+ Hemicelulo sa

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4.1

MARCO METODOLOGICO
METODOS GENERALES DE ANALISIS

Muestreo Las muestras se tomaran del residuo de la elaboración de jugo de caña de azúcar, del sector de Tambillo, esta será representativa y recogida a diferentes tiempos, durante un día de producción. Preparación de la muestra Se molera perfectamente la muestra y se pesara 10 g de la misma, posteriormente se colocaran en un matraz con 90 ml de agua destilada estéril, se agitará y se hará diluciones que van desde 102 hasta 10-7.

4.2 4.2.1

METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS Diseño del medio de cultivo Medio minimal + Agar Compuesto K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4. 7H2O Solución de elementos traza Lignina* Compuesto Agar K2HPO4 Gentamicinaª KH2PO4 Agua destilada (NH4)2SO4 pH=5 MgSO4. 7H2O Solución de elementos traza Lignina* Agua destilada pH=5 Cantidad 1,73 g 0,68 g 0,83 g 0,10 g 1 ml 0,2 % Cantidad 15 g g 1,73 1 ml g 0,68 1000g 0,83 ml 0,10 g 1 ml 0,2 % 1000 ml

Medio minimal líquido

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*Se utiliza como fuente de carbono presentes en el bagazo de caña de azúcar. ªPara inhibir bacterias.

AISLAMIENTO DE LEVADURAS DEGRADADORAS DE LIGNINA Las muestras obtenidas se sembrarán por el método de extensión (asa de digrasky) en el medio minimal, tres cajas petri por dilución, y se dejarán a temperatura ambiente durante cinco días en aerobiosis. El pH del medio minimal mas agar debe ser de 5 debido a que las levaduras que se van a aislar crecen mejor a ese pH y los otros microorganismos que no son de nuestro interés no. De las cepas levaduriformes que se reproducirán en el medio al cabo de cinco días, las enriquecemos nuevamente en un medio de cultivo líquido (medio base), las llevamos al shaker durante 24 horas a 37º C y 150 rpm. PURIFICACION Para evitar el crecimiento de bacterias y hongos filamentosos se sembrarán las diluciones enriquecidas en medios Saburoud (anexo 1) y otras en medio papa dextrosa (anexo1) adicionadas con tetraciclina para inhibir el crecimiento de los organismos mencionados anteriormente. IDENTIFICACION Análisis de la morfología micro y macroscópica A cada una de las cepas aisladas se les realizará tinción Gram para observarlas al microscopio. Y se observará como crecen en el medio de cultivo.

SELECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS LEVADURIFORMES Parámetros de selección: Parámetros de selección pH 4,5 a 6,5 Temperatura 24 y 48ºC. Se utilizará un pH de 5 y una temperatura de 37ºC, para las levaduras de nuestro interés Concentración de nutrientes La lignina es el principal compuesto para el crecimiento de este tipo de levaduras, el bagazo de caña de azúcar tiene alrededor del 20%.

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Para la selección de las cepas con mayor poder degradador elaboraremos medios con las siguientes concentraciones de lignina 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8% respectivamente. Por lo tanto la selección se efectuará en el medio de cultivo con estas concentraciones. Los microorganismos seleccionados serán puestos nuevamente en un medio minimal líquido y sólido, con la diferencia de que esta vez el medio base contendrá como fuente de carbono el bagazo de caña de azúcar que van a ser degradados. Después de sembrar los microorganismos seleccionados estos deberán permanecer por lo menos cuatro o cinco días a temperatura ambiente para su crecimiento 4.2.1.1 Curva de crecimiento y evaluación de la capacidad degradadora de lignina Para verificar tanto el crecimiento de los organismos aislados como su capacidad de degradar lignina se emplea en medio minimal adicionado con lignina al 0,2% en forma de medio liquido en matraces de 250 ml, se sembraran las diferentes levaduras bajo las siguientes condiciones de crecimiento: pH = 5 , temperatura ambiente y agitación a 150 rpm. Curva de crecimiento Para evaluar el crecimiento de las cepas se tomaran diariamente 1ml de medio de cultivo de cada uno de los matraces donde se sembraron las levaduras, se colocaran en tubos de ensayo que contengan 9 ml de agua estéril, se mezclaran y a partir de estos, se realizaran diluciones hasta 107. Posteriormente cada dilución se sembrara en caja petri con medio solido YEPD (anexo 1). Cada caja se incubara a 37°C y una vez obtenido el crecimiento se contaran las levaduras. Degradación de lignina Para analizar la degradación se observaran diariamente los matraces con el fin de verificar el cambio de coloración del medio de cultivo. PRESERVACIÓN Para la preservación de las cepas puras que son de utilidad biotecnológica se usara la técnica de criocongelación (crioviales con glicerol al 20%).

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BIBLIOGRAFÍA 1. www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/09htextolevaduras.pdf 2. home.aigonline.com/AIGEnvironmental/ind_profile/read_p0rofile/1,1990,MTYtL0FJR0Vudm
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3. http://www.umbbd.ahc.umn.edu:8015/umbbd/servlet/pageservlet?
ptype=pypathway_abbr=van-5k

4. http://www.fao.org/docrep/n5525S/n5525s01.htm. 5. http://www.fao.org/docrep/n5525S/lignin.htm. 6. http://www.bioxamara.tuportal.com.

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7. http://www.industry/.lignin.com. 8. http://www.nrel.gov/biotech_symposium/docs/abst1b-48.doc 9. http://www.bioplanet.net/magazine/bio_julago_2001_julago_industria.htm. 10. http://www.unsa.edu.ar/matbib/micagrip3.pdf

ANEXOS

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6.1 Composición de medios de cultivo

ANEXOS

Solución de elementos traza Compuesto CaCl2.H2O MnSO4.H2O FeSO4.7H2O EDTA.7H2O Agua destilada Compuesto Papa Glucosa anhidra Peptona de carne Agar Agua destilada pH = 5 Cantidad 1g 0.3 g 0.5 g 0.2 g 100 ml Cantidad 250 g 1% 1% 15 g 1000 ml

Medio glucosado Sabouraud Compuesto Medio de agar papadextrosa (PDA) Medio líquido YEPD Glucosa Peptona Compuesto Agar Extracto de levadura Agua destilada pH = 5 Peptona Glucosa Agua destilada pH = 5 Cantidad 20 g 10 g Cantidad 20 g 5g 1000 ml 5g 10 g 500 ml

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