Primrose SB, Twyman RM y Old RW. (2001). Principles of Gene
Manipulation, 6th ed. Blackwell Science. Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1 1.ENZIMAS DE RESTRICCIN 2. VECTORES DE CLONACIN 3. BIBLIOTECAS GENMICAS 4. BIBLIOTECAS DE ADNc 2 ENZIMAS DE RESTRICCIN Reconocen secuencias concretas Simetra (palndromes) 3 Ejemplos de palndromes Dabale arroz a la zorra el abad La ruta natural A man, a plan, a canal: Panama 4 Enzimas de restriccin Reconocen secuencias concretas Simetra (palndromes) Nmero de nucletidos en la secuencia 4 4 N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 N 6 N 1 N 2 N 3 N 4 N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 N 6 N 7 N 8 4 6 4 8 256 4096 65536 5 6 Extremos cohesivos GAATTC CTTAAG G- 3 CTTAA- 5 5 - AATTC 3 - G EcoRI 7 Extremos cohesivos CTGCAG GACGTC CTGCA- 3 G- 5 5 - G 3 - ACGTC PstI 8 Extremos romos CCCGGG GGGCCC CCC- 3 GGG- 5 5 - GGG 3 - CCC SmaI 9 Extremos compatibles (I) GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI GAATTC CTTAAG EcoRI 10 Extremos compatibles (II) GTCGAG CAGCTC GTCGAC CAGCTG SalI CTCGAG GAGCTC XhoI 11 Extremos romos (siempre compatibles) CCCATC GGGTAG CCCGGG GGGCCC SmaI GATATC CTATAG EcoRV 12 Extremos no compatibles rellenados, transformados en romos (siempre compatibles) GAATTC CTTAAG EcoRI CTCGAG GAGCTC XhoI G- 3 CTTAA- 5 AA T- 3 T 5 - TCGAG 3 - C T C G 3 - A GAATT CTTAA TCGAG AGCTC Degradado de cadena sencilla + dNTPs 13 Rellenado parcial Extremos no compatibles transformados en compatibles AAGCTT TTCGAA HindIII TCTAGA AGATCT XbaI A- 3 TTCGA- 5 AG- 3 5 - CTAGA 3 - C C 3 - T AAG TTCGA CTAGA TCC + dATP, + dGTP + dCTP, + dTTP 14 VECTORES DE CLONACIN Plsmidos Bacterifagos Csmidos Vectores de alta capacidad 15 pBR322 16 S a c N o t B a m E c o X h o X b a II H I R I II X b a X h o E c o B a m N o t S a c II R I H I II Sfi I T7 SfiI SP6 ( 0 ' 0 ) brazo izquierdo (20 kpb) brazo derecho (9 kpb) ( 4 3 ' 0 ) regin central dispensable (14 kpb) -GEM-12 17 ble colE1 ori f1(+) ori ScaI SspI PvuII XmnI SspI SspI PvuII ApaI SacI PstI* XbaI* NcoI SmaI StuI Ec oRV PvuII HindIII SalI Xho Kpn I I RI I I RI Ec o Not Not Ec o BamHI Izt apaCos 8.3 kpb p p cbC Cm Tc yc1 cos cos NheI XbaI 18 Cromosoma eucaritico Vector de clonaje (plsmido) Digestin ADN Ligasa Digestin 19 Vector de clonacin digerido con EcoRI y PvuII ADN Ligasa Extremos cohesivos Extremos romos Sitio de corte ADN cromosmico Sitio de corte Secuencias de reconocimiento 20 ADN Extrao pBR322 PstI ADN Ligasa ADN Hospedador Transformacin de clulas de E. coli 21 Seleccin ADN Hospedador Transformacin de clulas de E. coli Todas las colonias que tienen plsmidos Colonias con plsmidos recombinantes Agar + tet Agar + tet (control) Agar + tet + amp 22 23 Agrobacterium invade aprovechando los cortes Transferencia a placas con agar Placas con agar, hormonas y kanamicina Las plantas, resistentes a kanamicina, contienen el gen extrao Regeneracin de las plantas 24 Planta transformada con el gen para la GFP (protena verde fluorescente) 25 26 27 28 29 30 31 32 BIBLIOTECAS GENMICAS 33 34 N = ln (1-p) ln (1-t) tamao del inserto tamao del genoma t = p = probabilidad de encontrar el fragmento deseado 35 BIBLIOTECAS DE ADNc 36 ARNm AAAAAAAAAAAA-3' 5'- TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' conector-cebador Transcriptasa reversa 5-metil dCTP dATP, dGTP, dTTP ARN ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' AAAAAAAAAAAA-3' 5'- 3'- CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 XhoI ARNasa H ADN polimerasa I dNTPs ADN ADNc 5-met AAAAAAAAAAAACTCGAG-3' 5'- 3'- CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' XhoI Adaptadores EcoR1 ADN ligasa de T4 ADN ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCTC...CTTAA-5' AAAAAAAAAAAACTCGAG...G-3' 5'-AATTC... 3'-G... CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 XhoI EcoRI EcoRI ADN ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCT-5' AAAAAAAAAAAAC-3' 5'-AATTC... 3'-G... CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 XhoI EcoRI Digestin Xho1 37