Está en la página 1de 92

Kamienini

lsteli

proteominiai

tyrimai
Dr. A. Pivorinas,
VU Eksperimentins ir klinikins

medicinos

institutas
Paskaitos

planas


Embrionins ir suaugusio mogaus kamienins
lstels. Bendra apvalga.


Embrionini

kamienini

lsteli

(EKL)
pliuripotentikum

kontroliuojantys mechanizmai.
Naujausi duomenys.


Proteominiai

metodai. Bendra apvalga.


Proteominiai

EKL ir suaugusio mogaus
kamienini

lsteli

(SKL)

tyrimai. Pavyzdiai.
Kuo kamienins lstels yra ypatingos ?
Kamienin
Kamienin

s l
s l

stel
stel

s turi tris kitoms


s turi tris kitoms
organizmo l
organizmo l

stel
stel

ms neb
ms neb

dingus po
dingus po

ymius:
ymius:


Kamienini
Kamienini


l
l

steli
steli


populiacija atsinaujina viso
populiacija atsinaujina viso
gyvenimo metu
gyvenimo metu
(
(
SKL
SKL
)
)


Kamienin
Kamienin

s l
s l

stel
stel

s yra nespecializuotos
s yra nespecializuotos

ios l
ios l

stel
stel

s
s

geba virsti (diferencijuoti)
geba virsti (diferencijuoti)

vairi
vairi

audini
audini


tip
tip


l
l

stel
stel

mis
mis
Pagal kilms altin

skiriami du
kamienini

lsteli

tipai


Embrionin
Embrionin

s kamienin
s kamienin

s l
s l

stel
stel

s
s


Suaugusio organizmo kamienin
Suaugusio organizmo kamienin

s l
s l

stel
stel

s
s
Blastocistos formavimasis
Blastocistos formavimasis
Blastocista
Blastocista
ICM
Kryptinga EKL diferenciacija
Kryptinga EKL diferenciacija
in vitro
in vitro
Etikos

problemos

!
Nuo 2001 met

JAV vyriausyb

neberemia
tyrim, kuri

metu yra kuriamos naujos EKL
linijos
EKL linijos (iki

2006. 01. 01)


SKL sudaro labai nedidel

specializuot

audini

lsteli
populiacijos dal. Pavyzdiui, kaul iulpuose kamienins
lstels aptinkamos daniu 1:10000


SKL slygoja audini

atsinaujinim

viso gyvenimo metu


SKL yra grieiau specializuotos, t.y. jos lengviau virsta
to audinio tipo lstelmis i

kurio buvo iskirtos


SKL gyvenimo trukm

laboratorijos slygomis yra ribota,
tuo tarpu sukrus specifines slygas,

EKL galima kultivuoti praktikai
neribot

laik
Suaugusio organizmo kamienins lstels (SKL)
SKL PANAUDOJIMAS TYRIM

IR GYDYMO TIKSLAMS NEKELIA
GRSMS VISUOTINAI PRIIMTOMS ETIKOS NORMOMS !
SKL altiniai


Kaul iulpai


Kraujas


Oda


Smegenys


Riebalinis audinys


arnyno epitelis


Skersaruoiai raumenys


Kepenys


Kasa


Krties liaukos


Ragena ir tinklain


Dant

pulpa
Mezenchimin
Mezenchimin

s kamienin
s kamienin

s l
s l

stel
stel

s
s
MKL
Riebalinis Riebalinis
audinys audinys
Kremzlinis audinys Kremzlinis audinys
Kaulinis audinys Kaulinis audinys
Mezenchimin
Mezenchimin

s kamienin
s kamienin

s l
s l

stel
stel

s
s

(
(
MKL
MKL
)
)
MKL
MKL
Osteogenin
Osteogenin


MKL
MKL
diferenciacija
diferenciacija
Embrionini

kamienini

lsteli

(EKL)
pliuripotentikum

kontroliuojantys
mechanizmai
In vitro, sukurus

specifines

slygas, galima
palaikyti EKL

pliuripotentikum

neribot

laik
Embrionins kamienins lstels (EKL)

pasiymi pliuripotentikumu, t.y. jos gali
virsti bet kurio tipo lstelmis

Kodl to paties organizmo lstels


taip skiriasi ?
Neuronas Limfocitas

Vis

individualaus organizmo lsteli

genotipas
yra identikas


Skirting
Skirting


tip
tip


l
l

stel
stel

se yra aktyv
se yra aktyv

s skirtingi
s skirtingi
gen
gen


rinkiniai
rinkiniai


Skirting

tip

lstelse veikia skirtingos
transkripcijos faktori

kombinacijos


Skirting

tip

lstelse skirtingai
reguliuojamas transkripcijos faktori
aktyvumas


Skirtingo tipo lstelms bdinga skirtinga
chromatino

organizacija


Transkripcijos faktoriai yra baltymai


Transkripcijos faktorius turi maiausiai du domenus
(sritis): DNR jungimo domen

ir aktyvacijos domen


Transkripcijos faktoriai jungiasi prie specifini
promotoriaus proksimalini

element

srii


Prie vieno promotoriaus jungiasi vairs transkripcijos
faktoriai


Specifins transkripcijos faktori

kombinacijos nulemia,
ar bus aktyvuota konkretaus geno transkripcija


Manoma, kad 5-10

% vis

mogaus genomo gen

koduoja
transkripcijos faktorius
Transkripcijos faktoriai
Apskaiiuota, kad vienos lstels DNR ilgis yra 2
metrai
Kaip i DNR sutelpa

10 M

skersmens branduol

?


Struktrinis chromatino vienetas-nukleosoma


Nukleosomos erd

sudaro histon

baltym

oktameras


DNR spiral

apsisuka aplink nukleosomos erd
1,65 karto
Chromatinas
Nukleosomos


Atvira

chromatino konformacija yra palankesn
transkripcijos iniciavimui
Kaip geno transkripcijos iniciavimui reikalingi
baltymai pasiekia promotori?


Transkripcikai aktyviose DNR srityse
chromatino

kondensacijos laipsnis yra maesnis


Chromatino kondensacijos laipsnis lstelse yra
reguliuojamas
Chromatino kompaktikumo laipsn

reguliuoja dvi
baltym

grups:


Baltymai modifikuojantys nukleosom

struktr
(nuo ATP priklausomi chromatin

remodeliuojantys
baltymai Swi/Snif)


Baltymai modifikuojantys erdinius histonus
(histon

acetilazs, histon

deacetilazs, metilazs,
kinazs)
Potransliacins histon

modifikacijos
(histon

kodas)
Histon

acetilinimas/deacetilinimas
KLAUSIMAI:
Kokie gen

(transkripcijos faktori) rinkiniai
nulemia ir palaiko EKL pliuripotentikum

? Kokie

yra

i

transkripcijos faktori

genai-taikiniai ?
Kokie lokals specifiniai chromatino

struktros ypatumai yra svarbs EKL
pliuripotentikumo

palaikymui ?
Transkripcijos faktoriai Nanog, Oct4 ir Sox2
palaiko nediferencijuotas EKL lsteles in vitro
Sutrikdius i

transkripcijos faktori

ekspresij,
stebima nepilnavertika EKL diferenciacija
Atsakymas

pirm

klausim

i

dalies buvo
inomas :
Kompleksikai itirta, prie koki

gen-taikini

EKL
lstelse jungiasi transkripcijos faktoriai Nanog,
Oct4 ir Sox2
Tyrimams naudotas kombinuotas chromatino

imunoprecipitacijos

ir DNR mikrogardeli

metodas
(ChiP-Chip)
DNR ir baltym

suriimas
DNR/baltym

kompleks

suskaidymas

fragmentus (sonikavimas)
Imunoprecipitacija
DNR fragment

atskyrimas nuo
baltym
DNR fragment

ymjimas ir
hibridizavimas

su DNR mikrogardelmis
Viso

tirtos

18 000 gen

promotori

sekos
Oct4 asocijavo su 623 gen

promotoriais

(3

%)
Nanog-1687

(9

%)
Sox2-1271 (7

%)
Nanog, Oct4 ir Sox2 transkripcijos
faktoriai kartu jungiasi prie gen-

taikini

promotori
Nanog+Oct4+Sox2 Nanog+Oct4+Sox2
Aktyvs
Genai koduojantys transkripcijos
faktorius ir signalini

keli

komponentus svarbius EKL
pliuripotentikumo

palaikymui
(Oct4, Sox2, Nanog, STAT3, ZIC3, TGF

ir
Wnt

signalini

keli

komponentai)
Neaktyvs
Transkripcijos faktoriai svarbs
EKL diferenciacijai vairiomis
kryptimis
(HOXB1, PAX6, MEIS1, MYF5 ir kt.).
Nanog, Oct4 ir Sox2 transkripcijos faktoriai
veikia pagal teigiamo grtamojo ryio princip
Transkripcijos faktori

reguliacinis tinklas
palaikantis EKL pliuripotentikum

(modelis)
Chromatin

remodeliuojantys

Polycomb

baltymai yra svarbs EKL pliuripotentikumo

palaikymui
Potransliacins histon

modifikacijos
(histon

kodas)
Polycomb

represori

kompleksas (PRC) slopina
gen-taikini

ekspresij
PRC2 komponentas EZH2
katalizuoja

histono

3 lizino-

27 (H3K27) metilinim
KLAUSIMAS:
Ar Polycomb

represori

kompleksai yra svarbs
EKL pliuripotentikumo

palaikymui ?
Kompleksikai itirta, prie koki

gen-taikini

EKL
lstelse jungiasi Polycomb

represijos kompleksai
Tyrimams naudotas kombinuotas chromatino

imunoprecipitacijos

ir DNR mikrogardeli

metodas
(ChiP-Chip)
DNR ir baltym

suriimas
DNR/baltym

kompleks

suskaidymas

fragmentus (sonikavimas)
Imunoprecipitacija
DNR fragment

atskyrimas nuo
baltym
DNR fragment

ymjimas ir
hibridizavimas

su DNR mikrogardelmis
Tirta, kaip PRC2 subvienetas

SUZ12 jungiasi prie
EKL gen-taikini
Viso tirtos 22 500 gen

sekos
SUZ12 asocijavo su 1893 gen

promotoriais

(~ 8 %)
Ar

prie

gen-taikini

prisijungs SUZ12 yra

asocijuotas

su

aktyviu

PRC2?
iuo tikslu ChiP-Chip

metodu analogikai itirtas
PRC2 subvieneto

EED ir H3K27me3 pasiskirstymas
SUZ12 jungiasi prie diferenciacij

reguliuojani

gen

(daugiausiai koduojani

transkripcijos
faktorius), kurie EKL yra slopinami
Transkripcikai

neaktyvs genai, prie kuri

promotori

jungsi Nanog+Oct4+Sox2
transkripcijos faktoriai taip pat asocijavo su PRC2
kompleksais
Transkripcijos faktori

ir Polycomb

represori

reguliacinis tinklas palaikantis EKL
pliuripotentikum

(modelis)
Proteominiai

metodai
Bendra apvalga
Baltymai atskiriami gelyje pagal j

krv

ir mas
Baltymai atskiriami gelyje pagal j

krv

ir mas
Dvikryptis gelis
Baltymo

ekspresijos

palyginimas

dvikrypiame

gelyje
Baltymo

ekspresijos

palyginimas

dvikrypiame

gelyje
Baltymo potransliacini

modifikacij vertinimas
gelyje
Baltymai i

karto suskaidomi

peptidus
Mass spektrometrija
Mass spektrometrija
Mass spektrometrija
Mass spektrometrija
Peptidai ant kieto paviriaus jonizuojami lazerio
pagalba (matrix-assisted

laser

desorption-

ionisation,

MALDI)
Peptidai jonizuojami tirpale, ipurkiant juos per
elektrint

adat

(electrospray

ionization)
Peptid

mas

nustatoma pagal jon

skriejimo
laik

(ion

time

of

flight, TOF)
Gauti duomenys lyginami su esaniais duomen

bazse
MS/MS
Proteominiai

EKL ir SKL tyrimai
Pavyzdiai
EKL pliuripotentikum

palaikani

baltym

sveikos tyrimai
KLAUSIMAS:
Su kokiais baltymais transkripcijos faktorius
Nanog

asocijuoja pels EKL ?
Eksperimento planas
Generuoti Nanog

konstruktai, turintys FLAG
ym

ir trump

amino rgi

sek

(23), kuri

in
vivo yra biotilinama
Generuoti EKL klonai

stabiliai ekspresuojantys

biotino

ligaz

BirA

(E. coli)
Atlikta

Nanog

konstrukt

transfekcija


EKL
ekspresuojanias

BirA
EKL branduoli

ekstraktai inkubuoti

su
streptavidino-agarozs

granulm

(arba

prie

tai
vykdyta imunoprecipitacija

su anti-FLAG

antikniu)
Frakcionuota

10 % SDS poliakrilamidiniame

gelyje
Sekvenuota

LC-MS/MS
Realiausi kandidatai
Sveika su Nanog

patvirtinta
koimunoprecipitacijos

eksperimentais
Eksperimentai su si RNR
Su Nanog

asocijuojantys baltymai itirti pagal
t

pai

metodik
Baltym

sveikos emlapis
PDGF ir EGF signalini

keli

proteominiai

tyrimai suaugusio mogaus mezenchiminse

kamieninse lstelse (MKL)
KLAUSIMAS:
Kaip augimo faktoriai EGF ir PDGF veikia
osteogenin

MKL diferenciacij

?
EGF indukuoja osteogenin

MKL
diferenciacij, o PDGF-ne
Palyginta kokie baltymai yra tirozinfosforilinti

MKL veiktose EGF ir PDGF
Eksperimento planas
Lstels in vitro inkubuotos

su amino rgtimis,
turiniomis izotop

(Arg). Stable

isotope

labeling

by amino acids

in

cell

culture

(SILAC)
Trys MKL populiacijos augintos terpse su
skirtingu Arg. Arg
0
-normalus argininas;

Arg
6
-

izotopas; Arg
10
-kitoks izotopo

variantas

(10
dalton

sunkesnis)
MKL Arg
0
kontrolins
MKL Arg
6

veiktos

EGF
MKL Arg
10

veiktos

PDGF
Lstels

lizuotos. Lizatai

sumaiyti lygiu santykiu
Imunoprecipitacija

su anti-fosfo

Tyr

antikniu
Baltym

identifikavimas su LC-MS
Po SDS-PAGE baltymai suskaidyti
proteolitikai
~

90 %

tirozinfosforilint

baltym

buvo identiki PDGF
ir EGF veiktose MKL
PI-3 kinazs signalinio kelio
komponentai buvo
tirozinfosforilinti

tik PDGF
veiktose lstelse
PI-3 kinazs signalinio kelio inhibicija

sustiprino
PDGF veikt

MKL osteogenin

diferenciacij
Proteominiai

mezenchimini

kamienini

lsteli

heterogenikumo

tyrimai
KLAUSIMAS:
Kaip skirtingos kultivavimo slygos (rutinikai

naudojamos, taiau skirtingos sudties terps)

veikia MKL proteom
Eksperimento planas:
I

to paties donoro kaul iulp

pagal t

pat

protokol

iskirtos MKL (tas pats punktatas)
Lstels augintos terpse, rutinikai

naudojamose
MKL kultivavimui (Poietics

human

mesenchymal

stem

cell

medium, Cambrex;

ir terpje, kurios
sudtis aprayta Blood

2001; 98: 2615-2625)
Tirtas

MKL proteomas

(MALDI-TOF)
Abiej

kontrolini

grupi

MKL in vitro proliferavo

ir diferenciavo

vienodai
Skyrsi skirting

grupi

MKL morfologija
Skyrsi 241 baltymo

ekspresija