Está en la página 1de 43

A.

Kanopka-Biotechnologija
Biotechnologija
vadas biotechnologij.
Biotechnologija, tai mokslas apie manipuliavim biologiniais organizmais tikslu
utikrinti ir palengvinti mogaus gyvenim. Traiciniu meicininiu technologij!,
emirbystes ir traicinis gr"iniu kult"r! auginimas nepripa#stama kaip
biotechnologija.
Biotechnologija apima tokias #vairias sritis kaip maisto pramon$, atliek!
perirbim, kalnakasyb %metal! gavyb&, meicin ir kt.
'irm kart, jeigu taip galima vainti, biotechnologija buvo panauota maisto
gaminimui ())) met! prie* m"s! er, kai alaus arymui buvo panauotos miel$s. +au
,))) met! prie* m"s! er egiptie-iai atrao kaip mieli! pagalba gauti raugint uon.
Taip pat manoma ka Kinijoje tuo metu jau buvo panauojami ir kiti .ermentacijos
procesai. /iena i* seniausi! *iuo metu auginam! kult"r! yra kukur"zai. +ie ir *ianien,
kaip ir prie* 0))) met! p.m.e. 1eksikoje, yra auginami maistui. Kaangi prainio augalo
i* kurio i*sivyst$ kukur"zai nerasta tai paroo ka turb"t tai buvo labiausiai pavyk2s
agrokult"rinis eksperimentas antikoje.
3iuolaikines biotechnologijos era prasiea 4506 metais kai Amerikos
biochemikas +ames 7atson ir angl! bio.izikas 8rancis 9rick pasi"l$ vigran$s,
komplementari! spirali!, :;< moel#. Tais pa-iais metais 7illiam =ayes atrana ka
galimas plazmiini! :;< perk$limas i* vienos lstel$s %bakterijos& # kit.
45()-asiais *veicaru mikrobiologas 7erner Arber>s bakterijoje atrao speci.inius
.ermentus, vainamus restrikcijos enonukleaz$mis %restriktaz$mis&. 3ie .ermentai kerpa
%skelia& visu inom! organizm! :;< granin2 speci.in$se vietose.
45?6 metais Amerikos genetikas @tanley 9ohen ir Amerikos biochemikas =erbert
Boyer panauojant :;< restrikcijos enonukleazes perk$l$ speci.in# gen i* vienos
bakterijos # kit bakterij. 3is #vykis pra$jo rekombinantin$s :;< technologijos er,
benrai vainama genetine ininerija. 45?? metais genai i* auk*tesni!j! organizm! buvo
perne*ti # bakterij. 3ie pasiekimai pagaliau #galino pirma mogaus hormono geno
#terpim # bakterij Escherichia coli. Aauta transgenin$ bakterija negali nauoti mogaus
hormono, ji tik gamina ji kartu su savo, #prastais, cheminiais junginiais.
1olekulin$ biotechnologija tai patraukli, moksliniu poi"riu revoliucin$ isciplina, pagr#sta
mokslinink! sugeb$jimais perne*ti speci.in2 genetin2 in.ormacij i* vien! organizm! # kitus.
:aniausiai *ios rekombinantin$s technologijos tikslas yra komercini! proukt! suk"rimas.
BAententechC kompanijoje besispecializuojan-ioje rekombinantin$s :;<
technologijoje, genetin$je ininerijoje, gen! transplantacijoje bei gen! klonavime,
s$kmingai buvo i*skirtas insulin kouojantis genas ir perne*tas # genetin# element
%klonavimo vektori!& kuris gali b"ti palaikomas bakterijoje Escherichia coli lstel$je. 3ios
bakterijos lsteles veikia kaip biologijos .abrikas gaminant vi mogaus insulino
polipeptiines granines, kurios po to i*gryninamos ir panauojamos iabetu sergan-i!
moni! gyymui.
Ankstyvaisiais 45?)-aisiais metais traicin$ biotechnologija nebuvo pla-iai inoma
isciplina. 'la-iu poi"riu biotechnologija yra susijusi su mikroorganizm! gaminam!
metabolitini! proukt! komercini! technologij! k"rimu ir j! proukt! panauojimu.
4
A. Kanopka-Biotechnologija
8ormaliau biotechnologija gali b"ti apibr$ta kaip mokslini! ininerini! princip! taikymas
tikslu i*skirti ir panauoti biologini! organizm! gaminamas meiagas.
3ianien biotechnologija taikoma #vairiose srityse, kaip pavyziui atliek!
perirbime, biotechnologija panauojama sukuriant #vairias bioegraacines meiagas.
/iena i* toki! meiag! gaminama i* pieno r"g*ties gaunamos .ermentuojant %i*metamus,
likusius po erliaus nu$mimo& kvie-i! stiebus. Dniviualios pieno r"g*ties molekul$s yra
chemi*kai sujungiamos tuo pa-iu susiarant polimerui, pasiymin-iam plastiko savyb$mis
bet yra tuo pa-iu bioegrauojama, kas labai svarbu atliek! perirbime. 3iuo metu tokio
plastiko gamyba yra brangi ta-iau tikimasi ka ateityje tokio plastiko gamyba taps
rentabili.
'ramoninis biotechnologijos procesas nauojantis mikroorganizmus komercini!
proukt! gamyboje vyksta pagal toki schemE
Faliava
|
'irminis aliavos aporojimas
|
8ermentacija ir trans.ormacija
|
Antrinis aliavos aporojimas
|
3varus prouktas
4. 'irminis aporojimasE aliavos paruo*imas taip ka j mikroorganizmai gal$t! panauoti
kaip pirmin# maisto *altin#.
G. 8ermentacija ir trans.ormacijaE tikslini! mikroorganizm!, gaminan-i! reikalingas
meiagas, auginimas ieliuose bioreaktoriuse. Tai gali b"ti antibiotikai, amino r"g*tys,
#vair"s baltymai. Trans.ormacijos e.ektyvumo iinimas tai viena i* sunkiausiai
optimizuojam! staij!.
6. Antrinis apirbimasE reikaling! meiag!, antibiotik!, amino r"g*-i!, #vairi! baltym!, i*
lsteli! terp$s ar biomas$s gryninimas.
Biotechnologijos mokslo pastangos pagrine yra nukreiptos kiekvienos i* *i! pakop!
e.ektyvumo iinim.
D*sivys-ius rekombinantin$s :;< technologijai, pagrinin$ biotechnologijos kryptis buvo
stipriai pakeista.
3iuo metu biotechnologija vystos *iomis kryptimisE
- Hvairi! lig! iagnostikos pagerinimas bei vaist! #vairioms in.ekcin$ms bei genetin$ms
ligoms suk"rimas.
- Ar"ini! kult"r! erliaus paiinimas, sukuriant augalus atsparius augal! kenk$jams,
grybams ir virusin$ms ligoms, aplinkos stresams tokiems kaip trumpalaik$s sausros ar
ilgalaikiai kar*-iai.
G
A. Kanopka-Biotechnologija
- 1ikroorganizm! gaminan-i! %proukuojan-i!& vaistus, antibiotikus, polimerus, amino
r"g*tis, .ermentus ir #vairius maisto prieus suk"rimas.
- Hvairi! mikroorganizm!, gyv"n! genetinis pakeitimas taip ka jie pasiym$t! reikiamomis
savyb$mis.
- Technologij! suk"rimas ter*al! ir atliek! pa*alinimui i* aplinkos.
;epaisant tai ka biotechnologija yra perspektyvi *aka #galinanti taupyti nat"ralius gamtos
resursus ta-iau kaangi biotechnologija kaip instrument nauoja mikroorganizmus bei
gyv"nus to$l -ia kyla nemaai #vairi! gin-!E
4.& Ar geneti*kai sukurti mikroorganizmai nebus pavojingi nat"raliai esantiems #vairiems
organizmams ir supan-iai aplinkai.
G.& Ar geneti*kai sukurt! organizm! vystimasis ir panauojimas nepakenks nat"raliai
genetinei #vairovei.
6.& Ar gali buti mogus kuriamas geneti*kai.
,.& Ar naujos iagnostines priemon$s nepaeis kiekvieno inivio privatumo.
0.& Ar gali genetiniais metoais sukurti gyv"nai gali b"ti patentuojami.
(.& Ar biotechnologijos vystimasis #galins ir kit! svarbi! technologij! vystimsi.
?.& Ar komercinis tikslo vaikymasis nereik* tai ka biotechnologijos pasiekimai bus
prieinami tik sveikiems mon$ms.
I.& Ar biotechnologijos iegimas bei vystimasis emes "kyje netrukys traiciniams em$s
"kio metoams bei j! vystimuisi.
5.& Ar molekulin$s biotechnologijos metoai taikomi meicinin$je terapijoje nei*stums
vienoai e.ektyvius traici*kai nauojamus meicinines terapijos metous.
4).& Ar #vairi! arb! biotechnologijoje patentavimo galimyb$s ie*kojimas nesutrukys
mokslinink! tarpe laisvo min-i! apsikeitimo.
Biologins sistemos naudojamos biotechnologijoje.
Biotechnologijoje nauojamas labai platus biologini! sistem! spektrasE #skaitant
mikroorganizm!, vabzi!, augal! ir inuoli! lsteli! linijas, vabzi! augal! ir inuoli!
virusus, o taip pat augialstelinius organizmus tokius kaip augalai, pel$s ir kt. Biologin$s
sistemos yra labai svarbios biotechnologijos proceso biotrans.ormacijos .az$je. :augeliu
atveju geneti*kai moi.ikuotas besiauginantis biologinis vienetas %ar tai butu
mikroorganizmas ar virusas ar augalas ar gyv"nas& .akti*kai tai yra komercinis prouktas
%Escherichia coli, mieles, #vairios augal! ar lsteli! linijos&.
Prokariotiniai ir eukariotiniai organizmai.
/isi organizmai auga atitinkamose temperat"ros ribose. Auk*tose temperat"rose prasiea
lstel$s baltym! enat"racija ir kit! svarbi! lstel$s sistem! bei komponent! irimo procesai
veantys # lstel$s uvim. Femose temperat"rose gyvybi*kai svarb"s lstel$s procesai $l
lstel$s baltym! strukt"rini! poky-i! taip pat sustoja. 'agal optimali augimo ir temperat"r
lstel$s yra klasi.ikuojamos #E termo.ilus %,0-J5) 9&, mezo.ilus %nuo 4) iki ,? 9& ir
psichro.ilus %-0 - -60 9&. 1ikroorganizmai augantys skirtingose temperat"rose nauojami
speci.ini! biotechnologijos tiksl! pasiekimui. 'avyziuiE termo.ilai aniausiai nauojami
kaip gen! proukt! stabili! auk*tose temperat"rose nauojam! pramon$je ir laboratorijose
gavimui, tuo tarpu kai psichro.ilai paprastai yra geneti*kai pakei-iami kai kuri! speci.ini!
tiksl! pasiekimui, pvz.E toksini! ter*al! *altuose vanenyse bioegraacijai.
6
A. Kanopka-Biotechnologija
Gyvieji organizmai yra skirstomi dvi pagrindines grupes: prokariotus ir eukariotus. 3#
skirstim nusako augelis *i! organizm! strukt"rini! savybi!.
'rokariotiniese lstel$se tokiose kaip bakterijos, chromosomin$ :;< lstel$je ranasi
tiesioginiame kontakte su citoplazma. Kieta lstel$s sienel$ suaryta i* peptioglikan!, taip
pat jie neturi sublastelini! citoplazmini! organeli!.
Kukariotin$se lstel$se chromosomine :;< yra apsupta membranos susiarant taip
vainamam branuoliui. Lstel$s sieneles suarytos i* chitino arba celiulioz$s, bet niekaa
i* peptioglikan! taip pat jos citoplazmoje turi sublstelines organeles tokias kaip
mitohonrijas, Aolio aparato aleles ar augalai turi chloroplastus.
'la-iausiai biotechnologijoje nauojama bakterija aptinkama mogaus arnyne tai
Escherichia coli.
Escherichia coli
Tai labiausiai tyrin$jamas bei nauojamas mikroorganizmas pasaulyje. 'er pastaruosius 0)
met! t.y. nuo taa kai *is mikroorganizmas pra$tas tyrin$ti buvo gautas ielis kiekis
in.ormacijos apie genetik, molekulin2 biologij, .iziologij ir apie benrj biologij. Tai
gram-neigiama, nepatogenin$, pailgos .ormos, maesn$ negu 4 mikrometras ilgio,
aptinkamas mogaus arnyne, bet nat"raliai, irvoje ar vanenyje, neaptinkamas
mikroorganizmas. +os sugeb$jimas augintis alijimusi %vigub$jimas ar skilimas&
laboratorin$mis slygomis nauojant paprast %nesu$ting& auginimo terp2 susiean-i i*
neieli! kieki! mineralini! rusk! %;a
M
, K
M
, 1g
GM
, 9a
GM
, ;=
,
, 9l
-
, ='N
,
G-
, ir @N
,
G-
& ir
gliukoz$s kaip anglies *altinio paar$ *i bakterij labai patraukli tyrin$jimams.
Turtingesn$je terp$je, turin-ioje neielius kiekius amino r"g*-i!, vitamin!, rusk! ir
anglies *altin# *i! lsteli! auginimosi laikas esant 6?
o
9, logaritmin$je augimo .az$je yra
apie GG minutes.
E.coli yra visapusi*kas mikroorganizmas galintis augti tiek esant eguoniui %aerobi*kai& tiek
jam nesant %anaerobi*kai&. Ta-iau paprastai siekiant gauti optimali reikiam! proukt!
i*eig E.coli yra auginama aerobin$se slygose.
Biotechnologijos tikslams be E.coli nauojama visa eil$ mikroorganizm!. /isi *ie
mikroorganizmai gali buti skirstomi # tokias speci.ines grupesE tie kurie tiekia genus
reikalingus speci.ini! .unkcij! atlikimui, ir tie kurie speci.ini! tiksl! e.ektyviam pasiekimui
yra geneti*kai kei-iami.
Miels (Saccharomyces cerevisiae).
/ienos i* labiausiai biotechnologijoje nauojam! lsteli! tai miel$s %S.cerevisiae&. Tai
beveik E.coli lstel$s eukariotin$ versija. 1ieli! kaip ir E.coli auginimui nauojama
paprasta terp$. 1ieli! sugeb$jimas perirbti cukrus susiarant alkoholiui ir 9N
G
nuo
senov$s nauojama alkoholini! g$rim! bei uonos gamybai. 3ianien kasmet pasaulyje
sunauojama augiau kaip milijonas ton! S.cerevisiae. 1ieli! svarba yra ne tiek pramon$je
bet ir mokslo srityje t.y. jos nauojamos kaip moelin$ sistema procesams vykstantiems
eukariotin$je lstel$je tyrin$ti. 'vz.E j! gen! auginimosi ciklas yra pana*us # mogaus
lstel$s ir tai leio charakterizuoti ir i*skirti mogaus genus atsakingus u v$ini! lsteli!
vystimsi.
:aniausiai, eukariotin$se lstel$se baltymai po sintez$s yra moi.ikuojami., prieant
mao molekulinio svorio komponentus kurie reikalingi tiksliam baltym! lstel$je veikimui.
,
A. Kanopka-Biotechnologija
@kirtingai nuo E.coli ar kitu prokariot! kuriose nevyksta baltym! moi.ikacijos ar jos
skirtingos nuo moi.ikacij! eukariotin$se lstel$se. 1ieles taip pat pla-iai nauojamos
#vairi! rekombinantini! baltym! sintezei %ekspresijai&.
DN ir jos svarba.
Atsakinga u organizmo apibuinim ir jo biochemines .unkcijas nusakanti genetin$
in.ormacija kouojama ezoksiribonukleinin$je r"g*tyje %:;<&.
1olekulin$ biotechnologija nauing! proukt! suk"rimui nauoja augyb$s organizm!
genus.
Atsakinga u organizmo apibuinim ir jo biochemines .unkcijas genetin$ in.ormacija
kouojama ezoksiribonukleinineje r"g*tyje %:;<&. :augelyje organizm! tai vigranis,
ilgas polimerinis junginys.
'ati :;< molekul$ yra tyrin$jama jau nuo 4I(I metu, ir iki 45,) met! buvo inomaE
- ka ji suaryta i* atskir! vienet! O nukleoti!P
- nukleotiai yra sujungti # ilg granin2P
- nukleotiai susiea i* organin$s baz$s, penkiaanglio cukraus %pentoz$s& ir .os.ato
grup$s.
:;< suaro , bazi! r"*ysE aeninas %A&, guaninas %A&, citozinas %9& ir timinas
%T&.
9ukrus O GQ ezoksiriboz$ turi hiroksilo grupe ant 6Q cukraus liku-io anglies
atomo. <iboz$ - turi N=
-
grupes ant GQ ir 6Q anglies atom!.
:;< nukleotiai sujungiami .os.oiesterine jungtimi su .os.ato grupe
susiaran-ia tarp vienos riboz$s 0Q anglies atomo ir kitos riboz$s 6Q anglies atomo N=
grupi!. 'olinukleotiin$ granin$ viename gale baigiasi 6Q N= grupe %6Q galas&, o kitame
0Q .os.ato grupe O 0Q galas.
4506 m. +. 7atson ir 8. 9rick i*krisalin2 :;< ir nauoami rentgeno spinuli!
i.rakcija nustat$ ka :;< granin$s tarpusavyje yra palaikomos vanenilini! jung-i!
susiaran-i! tarp skirting! granini! bazi!. Baz$s suaro speci.ines poras A su T ir A su
9. A-T bazi! pora palaikoma G vanenilini! jung-i!, o A-9 pora O trij!. Abi :;<
granin$s yra viena kitai komplementarios, rei*kia prie* 9 vienoje granin$je kitoje bus
A ir atvirk*-iai, o prie* A bus T ir atvirk*-iai.
Komplementari*kumo principas #galina tai, ka visaa naujai sintetinama :;<
granin$ turi ta pa-i nukleoti! sek kaip ir prain$ :;<. %Fmogaus 4-a chromosomos
viena granin$ suaryta i* G(6 1b.&.
Abi :;< granin$s viena kitos atvilgiu yra i*si$s-iusios prie*ingomis kryptimis. /iena
granin$ yra orientuota 0Q-6Q kryptimi, kita 6Q-0Q kryptimi. 3is moelis paai*kina kaip
genetin$ meiaga su ieliu tikslumu gali reproukuotis bei kaip nuo geno nukleoti!
sekos sintetinamas baltymas.
7atson-9rick :;< moelis atitinka bazi! komplementari*kumo princip tuo b"u
kiekviena prie* tai egzistavusi :;< seka tarnauja kaip matrica naujai sintetinam!
komplementari! sek! gavimui.
0
A. Kanopka-Biotechnologija
N ir jos svarba.
@peci.in$ ezoksiribonukleoti! eil$ nusako in.ormacij kouojam iniviualiame
genetiniame elemente %gene&. Aenai kouoja arba baltymus arba <;< molekules.
Aenetin$s in.ormacijos ekoavimas vyksta per tarpin2 molekul2 ribonukleino r"g*t#
%<;<&, kuri gaunama nuskai-ius in.ormacij nuo :;<. <;< sintez$s procesas
vainamas transkripcija.
Lstel$s energetiniai resursai neleiia vykyti vis! strukt"rini! gen! transkripcij ir
transliacij vienu metu. To$l lstel$je pastoviai vyksta rai*ka tik t! gen! proukt! kurie
reikalingi palaikyti lstel$s pagrinines .unkcijas. Kit! gen! ekspresija lstel$je yra
grietai reguliuojama. Kai baltymas yra reikalingas lstelei taa jos signalin$ sistema
inicijuoja reikiamo geno transkripcij. Atvirk*-iai, kai baltymo lstelei nereikia O baltym
kouojantis genas yra i*jungiamas.
Kukariotin$se lstel$se transkripcij vyko bei kontroliuoja visa eil$ baltym! taip
vainam! transkripcijos .aktoriais.
<;< molekul$ tai linijin$ polinukleotiin$ granin$ kuri nuo :;< skiriasi viem
svarbiais aspektaisE
4. 9ukraus likutis yra riboz$ turintis hiroksilo grupes GQ ir 6Q 9 atom!.
G. /ietoje baz$s timino %T& baz$s turi uracilo %R& baz2.
:augumas <;< O suarytos i* vienos polinukleotiin$s granin$s. <;< molekuli!
atskiros sritys gali b"ti viena kitai komplementarios, tuo b"u susiarant vigran$ms
sritims. :vigrani! strukt"r! susiarymas gali vykti ir tarp viej! <;< molekuli!
turin-i! viena kitos atvilgiu komplemetari! sri-i!.
Lstel$je aptinkamos <;< molekul$sE in.ormacin$ <;< %i<;< arba m<;<&,
ribosomin$ <;< %r<;<&, transportin$ <;< %t<;<& ir maos si<;<.
'rokariotin$se lstel$se O vienas .ermentas %<;< polimeraz$& atsakingas u vis!
tip! <;< transkripcija.
Kukariotin$se lstel$se i<;<, r<;< ir t<;< vyko skirtingos <;< polimeraz$s.
+os, kaip ir :;< replikacijoje, susiarant naujoms .os.oiesterin$mis jungtimis, #jungia
naujus ribonukleotius # ilg$jan-i <;< molekul2 Tik viena :;< granin$ panauojama
kaip matrica <;< sintezei %transkripcijai&.
'rokariotuose n$ra nekouojan-i! sek! O inton!. Kukariotuose genai turi pertraukt
strukt"r t.y. suaryt i* kouojan-i! sek! %egzon!& ir nekouojan-i! sek! %intron!&. 'o
transkripcijos intronai i* susiariusios pre-i<;< pa*alinami, 0> i<;< ueama kepur$
%cap nukleotias&, o jos 6> galas poliaenilinamas.
1etaboli*kai aktyvioje lstel$je apie 6-0S nuo visos lstel$s <;< suaro i<;<, apie
I)S r<;<, apie ,S t<;<.
t<;< maa molekul$ turinti ?0-56 nt. :$l viini! komplementari! sri-i! t<;< molekul$
suaro L pavialo strukt"r. Kiekviena t<;< turi antikoonin2 sek, kurios pagalba ji
prisijungia prie i<;<. Lstel$je yra maiausiai viena t<;< molekul$ vienai i* G) amino
r"g*-i!. 'risijungusi amino r"g*t# t<;< vainama B#krautaC.
(
A. Kanopka-Biotechnologija
RNR genomai
Tiek bakterijos tiek eukariotin$s lstel$s genom suaro :;<. Ta-iau kai kuriuose
virusuose %taip vainamuose retrovirusais& genom suaro <;< molekul$ %gripo virusas,
=D/&. Tuo atveju kai virusas in.ekuoja lstel2 in.ormacija kouojama viruso <;<
.ermento, vainamo atvirk*tine transkriptaze, ver-iama # :;< ir toliau jau vyksta pagal
#prast schem. Tiesiogine <;< O baltymo sinteze negalima, kaangi virusas nauoja
*eimininko lstel$s visus reikalingus viruso i<;< sintezei reikalingus komponentus.
Balt!mai
45(4 m. 1arshal ;irenberg ir =enrichj 1attei atrao ka vien amino r"g*t# i<;<
granin$je kouoja 6 nukleotiai.
i<;< kouojan-ios in.ormacijos nuskaitymas ir jos pavertimas baltymu vainamas O
transliacija. Transliacijos procesas lstel$se vyksta ribosomose. <ibosomos tai
augiabaltyminis kompleksas, suarytas i* viej! subvienet!E maojo ir iiojo.
Transliacijai reikalinga i<;<, #krautos t<;<, bei ribosom! sveika. <ibosomos prie
i<;< prisijungia per speci.in2 nukleoti! sek vainama @hine-:algarno seka.
Baltymas nuskaitytas nuo i<;< yra suarytas i* amino r"g*-i! liku-i! sekos, kuri
apibr$ia jo atliekamas .unkcijas lstel$je.
Baltymai tai polimeriniai junginiai alyvaujantys prakti*kai visuose lstel$s apykaitos
procesuose. +ie katalizuoja chemines reakcijas vykstan-ias lstel$je, molekuli! transport
lstel$je, molekuli! ju$jim tarp lsteli!, kontroliuoja membran! pralaium, palaiko
lstel$s strukt"r, saugo lstel2 nuo #vairi! toksin! poveikio, atlieka apsaugin2 .unkcij, o
taip pat reguliuoja kit! gen! rai*k.
/isos amino r"g*tys turi pana*i chemin2 strukt"r. Benrai amino r"g*-i! chemin2
.ormul2 galima b"t! para*ytiE
=
M
=
6
; O 9 O 9NN
-
<
< O viena i* G) amino r"g*-i! *onini! granini!.
H polipetiin2 ganin2 amino r"g*-i! liku-iai baltymo molekul$je sujungti peptiine
jungtimi. 'irmas baltymo amino r"g*ties likutis turi laisv amino grup2 to$l vainamas
baltymo ; O galu, o paskutinis polipeptiin$s granin$s amino r"g*ties likutis turi laisv
karboksilo grup2, 9 - baltymo galas. Baltymai paprastai suaryti i* ,) O 4))) amino
r"g*-i! liku-i!. 'riklausomai nuo baltym suaran-i! amino r"g*-i! liku-i! sekos
baltymas susivynioja, # speci.ines strukt"rasE
pirmin$ - amino r"g*-i! liku-i! sekaP
antrin$ - -spiral$ arba O klos-i! strukt"raP
tretin$ - baltymo benra strukt"raP
ketvirtin$ - susijungimas # subvienetus.
?
A. Kanopka-Biotechnologija
:augelis lstel$s .unkcini! baltym! yra suaryti i* viej! ar augiau polipeptiini!
granini!. +eigu baltym suaro vi tokios pa-ios polipetiin$s granin$s toks baltymas
vainamas O homoimeriniu, jei skirtingos O heteroimeriniu, o viena baltymo
polipeptiin$ granin$ O subvienetu.
:ieli baltym! kompleksai kuri! kiekvienas suarytas i* keli! ar keleto subvienet!
lstel$je atlieka svarbias .unkcijas.
Baltymai pagal savo atliekamas biologines .unkcijas yra skirstomiE
4. 8ermentai %alkoholehirogenaz$ O .ermentas skalantis alkoholi mogaus
organizme&.
G. Transportiniai baltymai %hemoglobinas - N
G
perne*imui&.
6. 1aistiniai ir atsarg! baltymai %augelio augal! s$klose kaupiami baltymai kurie po to
nauojami kaip maisto *altinis pirmose augalo augimo staijose %kvie-i!, kukur"z!, ryi!
s$klos&&.
,. @usitraukimo ir ju$jimo organizme .unkcijas atliekantys baltymai %aktinas, miozinas
O raumen! su$tin$ alis&.
0. @trukt"riniai baltymai %kolagenas O sausgysl$se, elastinas O plauk!, nag!&.
(. Apsauginiai baltymai %imunoglobulinai arba antik"nai, .ibrinogenas ir trombinas O
alyvauja kraujo kre*$jimo procese&.
?. <eguliatoriniai baltymai %insulinas O reguliuoja gliukoz$s apykait organizme, augimo
hormonas O lstel$s augim&.
I. Kiti baltymai %pas kai kurias uv! r"*is ranami anti.riziniai baltymai&.
"ermentai
"ermentai j# veikimas.
8ermentai tai biologiniai katalizatoriai, nulemiantys lstel$se vykstan-i! chemini!
reakcij! krypt# ir greit#, patys ne#eiami # *i! reakcij! metu susiaran-i! galutini!
proukt! su$t#. +ie alyvauja visuose lstel$je vykstan-iuose meiag! apykaitos
procesuose.
Apie 4I0) metus Lui 'asteras paar$ i*va ka mieli! sugeb$jimas i* cukraus gaminti
alkohol# katalizuojamas B.erment!C. +is laike ka .ermentai %enzimai - kas rei*kia
miel$se& neatskiriama mieli! alis. 45G( m. pirma karta buvo i*skirtas .ermentas
skalantis *lapal O ureaz$.
Kai kurie .ermentai yra suaryti tik i* baltym! ir neturi joki! kit! grupi!. Ta-iau
katalitiniam augelio .erment! aktyvumui reikalingi papilomi cheminiai junginiai O
kofaktoriai. Tai gali buti neorganines meiagos %8e
GM
, 1g
GM
, Tn
GM
& arba su$tingi
organiniai junginiai ar vainami kofermentais.
:augelio .erment! katalitiniam aktyvumui reikalingi ne tik ko.aktoriai bet ir vienas ar
keli metal! jonai. Ko.ermentai arba metal! jonai vienuose .ermentuose yra laikinai
%nestipriai& susiri*2 su baltymu, tuo tarpu kai kituose .ermentuose *is susiri*imas yra
stiprus ir stabilus %pastovus&. ;ebaltymin$ .ermento alis vainama - prostetine grupe.
I
A. Kanopka-Biotechnologija
Ko.ermentai ir metalu jonai yra termostabil"s tuo tarpu .ermento baltymin$ alis,
vainama apofermentu, ji *ilant enat"ruoja. Kataliti*kai aktyvus .ermentas kartu su
ko.ermentu arba metal! jonais vainamas O holofermentu.
/eikiant .ermentams vyksta ne tik meiag! pasikeitimas, bet ir energijos perne*imas i*
vien! jungini! # kitus. Knergijos perne*$j! vaimen# atlieka AT'.
8erment! klasi.ikacija pagrista principaisE
4. 8erment! pavainimai baigiasi gal"ne az.
G. Katalizuojama reakcija yra esminis poymis pagal kur# vien .erment galima atskirti
nuo kito.
6. H klases .ermentai suskirstyti pagal katalizuojamos reakcijos tip. +is kartu su substrato
pavainimu yra pagrinas .ermento pavainimui suaryti.
8erment! klasi.ikacijai svarbus yra koai suaryti i* , ta*kais atskirt! skai-i!.
'irmasis O roo kuriai i* *e*i! klasi! priskiriamas .ermentasP
Antrasis O roo poklas#P
Tre-iasis O roo popoklas#P
Ketvirtasis O .ermento eil$s numer# popoklasyje.
"erment# klass.
4. Nksioreuktaz$s.
Katalizuoja oksiacines-reukcines reakcijas.
Benrai *ios .erment! klas$s katalizuojam reakcij galima ura*ytiE
U:-=
G
M A : M A-=
G
Atskeliantys substrato vanenil# O ehirogenaz$s. Alehioksiaz$s alyvauja
oksiuojant alehius.
G. Trans.eraz$s.
Katalizuoja grup$s atom! perne*im %-9=
6
, -'N
6
=
G
, -;=
G
ir kt.&
Benrai *ios .erment! klas$s katalizuojam reakcij galima ura*ytiE
:-V M A-W :-W M A-V
Aminotrans.eraz$s O amino r"g*-i! ir keto r"g*-i! 9N ir ;=
G
pasikeitim vietomis.
8os.otrans.eraz$s O atlieka .os.oro r"gsties liku-io perne*imo vaimen#.
6. =irolaz$s.
Katalizuoja reakcijas kuri! metu veikiant vaneniui suaromos 9-N, 9-;, 9-9 ir kitos
jungtys.
Benrai *ios .erment! klas$s katalizuojam reakcij galima ura*ytiE
UA-B M =
G
N A-N= M B-=
'eptiaz$s O peptiini! jung-i! ir baltym! hiroliz2.
Ksteraz$s O nutraukia su$tingas jungtis.
5
A. Kanopka-Biotechnologija
Aliukoziaz$s O skalo glikozius.
Rreaz$ O skalo *lapal.
,. Liaz$s.
Katalizuoja reakcijas kuri! metu meiagose suaromos 9-9, 9-N, 9-; jungtys
atsiranant %susiarant& viguboms jungtims arba grup$s atom! prisijungia prie vigubos
jungties j suarant.
Benrai *ios .erment! klas$s katalizuojam reakcij galima ura*ytiE
UU <
G
<
6
<
G
<
6
U<
4
O 9 O 9 O<
,
<4 O 9 X 9 O <
,
M V=
V =
Karboksilaz$s O atskelia 9N
G
pvz. nuo pirovyuogi! r"g*ties.
8uramathirataz$ O atskelia =
G
N nuo obuoli! r"g*ties susiarant .umaro r"g*-iai.
0. Dzomeraz$s.
8ermentai vienus meiag! izomerus paver-iantys kitais.
Aliukozo.os.atizomeraz$ O gliukozo.os.atas virsta .ruktozo.os.atu.
(. Ligaz$s.
Katalizuoja reakcijas kuri! metu susijungia vi molekul$s ir nukleozitri.os.ate %anai
AT'& vyksta piro.os.ato jungties hiroliz$.
UA-= M B-N= M AT' A-B M A:' M =
6
'N
,

Asparaginsintetaz$ O katalizuoja asparagino sintez2.
:;< O ligaz$ katalizuoja :;< granini! sujungim.
<;< O ligaz$, katalizuoja <;< granini! sujungim.
"erment# veikimo mechanizmas.
:augumos .erment! katalitinis veikimas susij2s su tuo ka .ermento veikiama meiaga
%substratas& ir pats .ermentas susijungia, # laikin su$tin# jungin#, kuris tuoj pat skyla
susiarant laisvam .ermentui ir prouktui.
8ermentai O tai nat"ral"s katalizatoriai. +ie, sumainami aktyvacijos energij, %tai
energijos kiekis %kalorijomis& kuris reikalingas tam ka visos molekules esan-ios 4 molyje
meiagos pasiekt! pereinamj b"sena atitinkan-i energetinio %aktivacinio& barjero vir*"nei&
ymiai paiina grietai apibr$t! reakcij! greit#, kurios be .ermento vyksta labai l$tai.
Wra u pagrininai chemini! reakcij! grei-io paiinimo buaiE
4. Temperat"ros paiinimas - molekuli! temperat"rinio ju$jimo pagreit$jimas vea
prie molekuli! turin-i! pakankam viin2 energij pasiekti per$jimo b"sen. %'aiinus
temperat"r 4)
o
9 reakcijos greitis pai$ja maaug vigubai&.
4)
A. Kanopka-Biotechnologija
G. Katalizatoriaus pri$jimas. Katalizatoriai paiina chemini! reakcij! greit#, ranant
Baplinkin# keliC leiaint# molekul$ms pereiti aktivacin2 rib esant ymiai maesniam j!
energetiniam lygiui.
$ichaelio%$enten konstanta ir jos reik&m
;agrin$jant .ermentines reakcijos priklausomyb2 nuo substrato koncentracijos, esant
labai maoms substrato koncentracijoms reakcijos greitis yra maas. :iinant substrato
koncentracij reakcijoje reakcijos greitis i*auga, ir pagaliau pasiekia ta*k kai iinant
substrato koncentracij reakcijos greitis nebei$ja, t.y. reakcija pasiekia plato kai bet
koks substrato koncentracijos paiinimas tik labai neymiai paiina reakcijos greit#.
Toliau kaip neiinant substrato koncentracij .ermento greitis tik art$ja prie
maksimalaus %/
maY
& bet nieka jo nepasiekia.
8ermentin$s reakcijos prainio grei-io priklausomyb$ nuo substrato koncentracijos.
45)6 metais /ictoras =enry paar$ i*va ka b"tina .ermento kataliz$s staija yra jo
susijungimas su substratu susiarant .ermento-substarto kompleksui. Toliau *i i$j
i*vyst$ Leonor 1ichaelis ir 1o 1enten. 4546 m. jie postulavo, ka pirmoje .ermentin$s
reakcijos staijoje .ermentas %K& greitai ir gr#tamai susijungia su substratu %@&
U K M @ K@
Antrojoje staijoje susiar2s .ermento-substarto kompleksas, jau ymiai l$-iau skyla
susiarant prouktui %'& ir laisvam .ermentui %K&.
U K@ K M '
Kaangi antroji staija yra ymiai l$tesn$ tai ji ir slygoja visos .ermentin$s reakcijos
greit#, to$l reakcijos veikimo greitis bus tiesiogiai priklausomas nuo .ermento-substarto
komplekso koncentracijos.
<eakcijos greitis bus maksimalus kai prakti*kai visas .ermentas bus susiri*2s su substratu.
3i slyga yra tik esant labai iel$mis substrato koncentracijoms. 'aiinus substrato
koncentracij reakcijos pusiausvyra pasistumia # e*in2.
44
Z
'rainis
reakcijos
greitis
@ubstrato konc. [1\
/maY
A. Kanopka-Biotechnologija
UK M @ K@
Kaangi .ermentin$s reakcijos greitis priklausomai nuo substrato koncentracijos tik art$ja
prie maksimalaus bet prakti*kai jo nieka nepasiekia to$l 1ichaelis ir 1enten nustat$
konstant K
m
patogi i*reik*ti tiksli .ermentin$s reakcijos grei-io priklausomyb2 nuo
substrato koncentracijos.
1atematin$ i*rai*kaE
/
o
X /
maY
] [@\ ^ K
m
M [@\
Km %1ichaelio-1enteno konstanta& tai substrato koncentracija kuriai esant .ermentin$s reakcijos
greitis yra lygus pusei maksimalaus grei-io, /o- reakcijos matuojamas greitis, [@\ - substrato
koncebtracija, /maY - maksimalus .ermento veikimo greitis.
Kiekvienas .ermentas turi jam charakteringa K
m
reik*m2.
:augeliui .ermentini! reakcij! su .ermentu susiri*a ne viena, o vi skirtingos substrato
molekul$s.
AT' M Aliukoze A:' M gliukozo-(-.os.atas.
3ioje heksokinaz$s katalizuojamoje reakcijoje AT' ir gliukoz$ yra substratai.
To$l heksokinaz$ charakterizuojama viem K
m
reik*m$mis, skirtingomis kiekvienam
substratui.
Kiekvieno .ermento veikimui charakteringa optimali p= reik*m$ ir veikimo temperat"ra.
8ermentas 8ermento
veikimo p=
'epsinas 4.0
<ibonukleaz$ ?.I
Arginaz$ 5.?
:augumos .erment! aktyvum galima slopinti %inhibuoti&. 8erment! inhibitoriai
skirstomi # vi pagrinines grupesE
;egr#tami - kurie negr#tamai susiri*a su .ermento .unkcin$mis grup$mis
arba jas suaro.
Ar#tami - jie ar skirstomi # vi grupesE
Konkurentinius - kai inhibitorius $l prisijungimo .ermento
aktyviame centre konkuruoja su substratu, bet skirtingai
nuo substrato jis yra nepaver-iamas prouktu.
;ekonkurentinis - kai inhibitorius prisijungia ne .ermento
aktyviame centre bet kitoje vietoje. 8ermentas pakei-ia
savo kon.ormacij ir tuo pa-iu #vyksta gr#tama .ermento
katalitinio centro inaktyvacija.
8ermentas 8ermento veikimo
temperat"ra
Ta_ :;<
polimeraz$
?G
o
9
T, :;<
polimeraz$
6?
o
9
4G
A. Kanopka-Biotechnologija
8ermentai lstel$je alyvauja #vairiuose metabolitiniuose procesuose, kuriuose vienos
.ermentin$s reakcijos prouktas tarnauja substratu sekan-iai .ermentinei reakcijai.
1ulti.ermentines sistemos gali jungti 40 ir augiau .erment! veikian-i! atitinkamu
eili*kumu. Kiekvienoje .ermentin$je sistemoje egzistuoja .ermentas uuoantis vis!
sekan-i! reakcij! greit#. Tokie .ermentai vainami - regulacinais.
Kai kuriose lstel$s multi.ermentin$se sistemose reguliacinis .ermentas gali skirtis savo
savyb$mis t.y. jis gali buti inhibuojamas galutinio mult.ermentin$s reakcijos proukto.
Tokia reguliacija vainama atvirk*tinio ry*io inhibicija arba retroinhiicija. Tokie
.ermentai turi inhibicines sritis ne aktyviame centre ir vainami alosteriniais .ermentais
%graiki*kai allo ir stereos rei*kia `kitas` ir `vieta`&. Alosteriniai .ermentai - turi `kit
centr`
4. Kaip ir visi .ermentai alosteriniai .ermentai be katalitinio centro turi ar vien
reguliacin# metabolit suri*ant# centr.
G. Lyginant su paprastas .ermentais alosterini! .erment! molekul$s yra ymiai iesnes ir
su$tingesn$s.
6. 3i! .erment! kinetika neatitinka klasikin$s 1ichaelio-1enteno lygties.
Kai kurie .ermentai lstel$je egzistuoja keliomis molekulin$mis .ormomis, gali b"ti
sutinkami pas t pat# lsteli! tip, tuose pa-iuose auiniuose, netgi toje pa-ioje lstel$je.
Tokiu atveju visos .ermento .ormos katalizuoja vien ir t pa-i reakcij, ta-iau skiriasi
savo kinetin$mis savyb$mis, o taip pat amino r"g*-i! seka. Tokie .ermentai vainami
izofermentais %arba izozimais&.
"erment# akt!vumo vienetai.
8ermento kiekiui nustatyti matuojamas katalizuojamos reakcijos greitis. Tarptautin$s
biochemik! sjungos .erment! nomenklat"ros komisija 45?G m. O susitar$ ka reakcijos
greitis matuojamas moliais proukto susiariusio per 4 s. ir *is vienetas vainamas O
katalu %kat&.
"ermentai naudojami biotechnologijoje
Biotechnologijoje panauojami .ermentai paprastai i*skiriami i* bakterij! ar virus!, nes
jie turi paprast strukt"r, pasiymi reikiamomis katalitin$mis savyb$mis bei juos
palyginus su .ermentais gryninamais i* eukariotini! lsteli! lengva i*gryninti.
Trumpai apvelgsime biotechnologijos arbuose nauojamus .ermentusE
DNR restrikcijos endonukleazs.
Klonavimui :;< turinti reikaling sek ir klonavimo vektorius turi buti perskeltas #
reikiamus iskretinius ir atsikartojan-ius .ragmentus. 9hromosomin$s :;< i*skyrimas ir
jos praleiimas esant ieliam spauimui pro plon %*virk*to& aat ar :;< paveikimas
ultragarsu suskalo :;< # 6)) O 0))) bazi! por! .ragmentus. Ta-iau *ie .ragmentai yra
gaunami atsitiktinai ir tai rei*kia ka kiekvien kart bus gaunami skirtingi .ragmentai.
@u bakterini! .erment! skalan-i! :;< molekul2 speci.in$se vietose atraimu :;<
klonavimas tapo #manomas. 3ie .ermentai vainami restrikcijos enonukleaz$mis.
@kirtingose bakterij! r"*yse ranamos skirtingos restrikcijos enonukleaz$s, t.y.
kerpan-ios :;< skirtingose vietose, kaip pvzE
46
A. Kanopka-Biotechnologija
!pa " %!aemophilus parainfluenzae&
0Q O ATT AA9 O 6Q
6Q O 9AA TTA O 0Q
8ermento poveikyje susiaro :;< buki galai.
Eco#" %Kscherichia coli&
0Q O A AATT9 O 6Q
6Q O 9TTAA A O 0Q
8ermento poveikyje susiaro i*sikis2s 0Q :;< galai
$st " %$rovidencia stuartii&
0Q O 9TA9A A O 6Q
6Q O A A9AT9 O 0Q
8ermento poveikyje susiaro i*siki*2s 6Q :;< galai.
Bakterijose restrikcijos enonukleaz$s tai kaip eukariotini! lsteli! imunin$ sistema.
3iuo metu yra inoma apie 6()) restrikcijos enonukleazi! i*skirt! i* #vairi! *altini!.
DNR!riklausomos DNR !olimerazs.
/isos :;< polimeraz$s vyko ezoksiribonukleoti! sintez2, prijungiant juos prie
6Q-N= pramens galo.
@intez$ vyksta tik 0Q-6Q kryptimi, atvilgiu sintetinamos granin$s. Kiekvienas #jungtas
nukleotias yra komplementarus prie* j# matricin$je granin$je esan-iam nukleotiui.
:;< sintez$s inicijacijai reikalingiE pramuo, ezoksiribonukleotitri.os.atai %;T'& ir
ko.aktoriai, paprastai tai metal! jonai.
:auguma :;< polimerazi! pasiymi ne tik polimeraziniu bet ir 6Q-0Q egzonukleaziniu
aktyvumu kuris neatskiriamai susijusij2s su polimeraziniu aktyvumu.
6Q-0Q egzonukleazinis aktyvumas, reakcijoje nesant ;T', kiekvien kart pa*alina vien
nukleoti %nukleozi 0Q mono.os.ata&. 3is .ermento aktyvumas vyko :;< egraacij
nuo 6Q laisvo hiroksilo %N=& vigran$s :;< abiej! granini! gal!.
Ksant reakcijos mi*inyje ;T' egzonukleazinis aktyvumas yra inhibuojamas
polimerazinio aktyvumo %t.y. aktyvum! santykis pol^eYo JJ 4&. :;< sintez$s metu
egzonukleazinis aktyvumas vyko teisingo nukleoti! #jungimo kontrol2, pa*alinant
neteisingai #jungtus nukleotius.
Kai kurios :;< polimeraz$s turi 0Q-6Q egzonukleazin# aktyvum, pa*alinant# vien ar
kelis nukleotius %iki 4)&. 3is aktyvumas .ermentui leiia vykyti sintez2 esant
trumpiems vienos i* :;< granini! tr"kiams. Tokia reakcija inoma `nik transliacijos`
pavainimu ir yra nauojama ym$tos :;< gavimui.
4,
A. Kanopka-Biotechnologija
Labai svarbi :;< polimerazi! savyb$ tai j! procesyvumas t.y. polimeraz$s molekul$s
sugeb$jimas #jungti nukleotius be isociacijos nuo matricos. :augumas :;<
polimerazi! turi em procesyvum, t.y. jos isocijuoja nuo matricos po maiau negu 4)
nuleoti! #jungimo. %'vzE T? :;< polimeraz$ yra labai procesivi ir gali #jungti
t"kstan-ius nukleoti! prie* isocijuoama nuo matricos. 3i savyb$ labai nauinga
sintetinant ilgus :;< .ragmentus.
D* :;< polimerazi! biotechnologijoje pla-iai nauojamosE E.coli :;< polimeraz$ D, T,
:;< polimeraz$, T? :;< polimeraz$ bei termostabilios :;< polimeraz$s i*skiriamos
i* termo.il! tokios kaip Ta_ :;< polimeraz$. Ta_ :;< polimeraz$ pla-iai nauojama
paauginant :;< .ragmentus polimeraz$s ciklin$je reakcijoje %'9<, ar nauojamas
sutrumpinimas - 'A<&.
"olimerazs ciklin reakcija ("#R)
45I0 m. Kary 1ullis atrao :;< sek! paauginimo b" m$gintuv$lyje. Tai .akti*kai
buvo revoliucinis atraimas.
'9< tai e.ektyvi proce"ra gaunant ielius kiekius reikiamos :;< sekos in vitro.
Ampli.ikacija %paauginimas&, kuri siekia milijonus kart!, vyksta trimis staijomis.
'agrininiai reikalavimai '9<E
4. :u sintetiniai oligonukleotiiniai, komplementar"s norimos paauginti :;<
sritims - pramenysP
G. :;< seka i*si$s-iusi tarp pasirinktos pramen! porosP
6. Termostabilus .ermentas - :;< polimeraz$P
,. Keturi ezoksiribo tri.os.atai - %AT', 9T', TT', AT'&.
Tipinis :;< paauginimo arba ampli.ikacijos procesas susiea i* cikl!. Kiekvienas
ciklas susiea i* 6 staij!.
4. :enat"racija. Termin$ :;< m$ginio enat"racija pakeliant temperat"r reakcijos
m$gintuv$lyje iki 50
o
9P
G. <enat"racija. Temperat"ra m$gintuv$lyje paeminama iki 0) O ()
o
9. 'ramuo pagal
komplimentari*kumo princip prisijungia prie :;<P
6. @intez$. Temperat"ra pakeliama iki optimalios termostabiliai :;< polimerazei
veikimo temperat"ros %?G
o
9&. :;< sintez$ inicijuojama kiekvieno pramens 6Q-N=
gale.
'9< reakcija reikalauja labai ma! prain$s meiagos kieki!. 1amut! rast! amino
#*alo zonoje :;< buvo paauginta '9< reakcijos pagalba. <eakcija pla-iai nauojama
kriminalistikoje.
RNR!riklausomos DNR !olimerazs.
$tvirk%tin transkri!taz.
Aryninama i* virus!, vyko :;< sintez2 nuo <;<. 8ermentas nepasiymi 6>-0>
egzonukleaziniu aktyvumu, to$l *io .ermento katalizuojama :;< sintez$ n$ra tiksli,
anai gaunami pakitimai nukleoti! sekoje - mutacijos.
DNR!riklausomos RNR !olimerazes.
40
A. Kanopka-Biotechnologija
;auojamos nuo :;< gauti <;<. D* :;< polimerazi! biotechnologijoje pla-iai
nauojamosE bakterio.ag! @'(, T?, T6 <;< polimeraz$s, i*skiriamos i* bakterio.agais
ukr$st! lsteli!.
&os'atazs ir kinazs.
&os'atazs( katalizuoja 0Q-.os.ato liku-i! hiroliz2 nuo :;< ir <;< molekuli!
susiarant 0>-N= galams.
Biotechnologijos arbuose pla-iai nauojamosE bakterin$ *armin$ .os.ataz$ ir ver*iuko
plon!j! arn! .os.ataz$.
)inazs( Katalizuoja galinio a .os.ato nuo AT' perne*im ant :;< ar <;< 0Q-N= galo.
Biotechnologijoje pla-iai nauojama bakterio.ago T, polinukleotikinaz$.
Dezoksiri*onukleazs.
'la-iai biotechnologiniuose arbuose nauojamos ezoksiribonukleaz$s tai .ermentai
katalizuojantys :;< egraacij nuo 0> ar 6> :;< granin$s gal!. 8ermentai skirstomi #
tai kokios, viengran$s ar vigran$s :;< hiroliz2, bei kuria kryptimi 6>-0> ar 0>-6> jie
katalizuoja. 3is skirstymas yra slyginis kaangi yra .erment! pvz.E E.coli egzonukleaz$
/DD kuri katalizuoja :;< egraacij tiek nuo 0> tiek nuo jos 6> gal!.
:ezoksiribonukleaz$s i*skiriamos i* #vairi! mikroorganizm!.
Biotechnologijos arbuose pla-iai nauojamos b bakterio.ago.ago
ezoksiriboegzonukleaz$, E.coli egzonukleaz$ DDD, ezoksiribonukleaz$ D, @4 nukleaz$,
nukleaz$ Bal 64 bei kitos.
Ri*onukleazs.
8ermentai turintys skirtingus speci.i*kumus %skirtingomis skelimo vietomis& nauojamos
#vairiuose biotechnologiniuose arbuose, #skaitant ir pirmin$s <;< strukt"ros nustatym.
Kai kuri! ribonukleazi! sk$limo vietosE
RNaz Sklimo vieta
<ibonukleaz$ T4 Ap ^ ;
<ibonukleaz$ RG Ap ^ ;
<ibonukleaz$ 9L6 9%A^A&p ^ ;
@.aureus nukleaze ;p ^ %A^R&
DNR ligazs
:;< ligaz$s katalizuoja .os.oiesterini! jung-i! tarp gretim! 0c .os.ato ir 6Q-N= gal!
vigran$je :;< granin$je susiarym. Labai pla-iai nauojama bakterio.ago T, :;<
ligaz$.
RNR ligazs
Katalizuoja nuo AT' priklausom viengran$s :;< ar <;< 0Q-.os.oryl galo prijungim
prie viengran$s :;< ar <;< 6Q-N= galo. 'la-iai nauojama bakterio.ago T, <;<
ligaz$.
'ektoriaus svoka biotechnologijoje.
4(
A. Kanopka-Biotechnologija
Biotechnologijoje vektorius tai :;< segmentas # kur# panauojus rekombinantin$s :;<
metous, #terpiamas %#klonuojamas& reikiamas :;< .ragmentas.
'lazmi$s tai maos :;< galin-ios egzistuoti viuje lsteli! atskirai nuo lstel$s
:;<. 'lazmiin$ :;< lstel$s viuje turi replikuotis. Ka lstel$s *eimininko .ermentai
kai lstel$ alijasi gal$t! jas replikuoti tokios :;< turi tur$ti reikalingus genetinius
elementus.
'lazmiin$s :;< ranamos augelyje mikroorganizm!. Bakterijose pagrine
ranamos iein$s plazmiin$s :;<. Kai kuriose miel$se tai linijine :;<, kaip maa
papiloma chromosoma.
;at"ralios plazmiin$s :;< aniausiai neturi svarbi! savybi! keliam! klonavimo
vektoriams. Tos savybes yraE
1aas yis, reikalingas tam ka b"t! e.ektyviai perkeliama egzogenin$
%svetima& :;< # lstel2. 'erk$limo e.ektyvumas palzmiini! :;< iesni! kaip 40 kb.
stipriai ma$ja.
Rnikal"s restrikcijos enonukleazi! taikiniai tam ka jas b"t! patogu sukarpyti ir
# kirpimo vietas b"t! #terpta svetima :;<.
Tam ka atskirti lsteles # kurias klonavimo vektorius-intarpas #siterp$
plazmiin$s :;< turi tur$ti atrankos genetinius markerius.
To$l plazmi$s :;< nauojamos biotechnologiniuose arbuose sukonstruojamos
panauojus genetin2 ininerij.
"ermentacija.
8ermentacijos technologijos yra senos, j! amius siekia *imtus metu. 8ermentacijos
procesas ryt! *alyse buvo nauojamas pagrine maistini! meiag! .ermentacijoms,
toki! kaip sojos paa!. /akar! *alyse .ermentacijos procesai buvo pagrine nauojami
siloso gamyboje, gryb! kultivacijoje, s"rio bei raugint! kop"st! proukcijai, bei
augalini! bei gyvulini! atliek! kompostavimui.
'raioje .ermentacija, buvo nauojama pagrine maisto proukt!, toki! kaip s"ris,
jogurtas, grietin$, arovi! marinavimui, sojos paao alaus, vyno bei spirito gamyboje.
8ermentacija tai pagrinin$ traicin$s biotechnologijos isciplina, bei prakti*kai visos
*iuolaikin$s biotechnologijos proces! prain$ staija.
Lygiagre-iai su nauing! proukt! mogaus reikm$ms nauing! proukt! gavimu, buvo
vykoma mikroorganizm! galin-i! pa*alinti #vairius ter*alus ienti.ikacija.
"ermentacijos (rocesas.
Lsteli! augimas priklauso nuo auginimo terp$je esam! maistini! meiag! su$ties, j!
transporto # lstel2 e.ektyvumo bei j! #sisavinimo, o taip pat nuo aplinkos parametr! toki!
kaip temperat"ra, auginimo terp$s p= ir aeracija %apr"pinimas eguonimi&.
/iutinis laiko tarpas reikalingas lsteli! kiekio pavigub$jimui i$jant lsteli! yiui
ir su$tingumui i$jaE bakterijoms ).G0 O 4 hP miel$ms 4 O G hP pel$siniams grybams G O
(.0 hP augal! lstel$ms G) O ?) hP gyv"n! lstel$ms 40 O ,I h.
4?
A. Kanopka-Biotechnologija
'raktikoje organizmai retai kaa turi slygas neribotam augimui, paprastai augimas b"na
priklausomas nuo limituojan-i! .aktori! t.y. nuo pagrinini! terp$s komponent! su$ties.
Kai *i! .aktori! koncentracija suma$ja sul$t$ja ir lsteli! augimas.
Biotechnologijos procesuose mikroorganizm! auginimui bioreaktoriuose nauojami trys
pagrininiai buaiE
4. @erijinis %kai auginama partijomis, t.y. uauginama viena, po to kita ir t.t.&P
G. 'usiau-nenutr"kstamas %pamaitinamasis&P
6. ;enutr"kstamas.
Bioreaktoriuje procesai gali vykti statin$mis ar agituojamomis slygomis, esant ar
nesant eguoniui, skystose ar maai r$gm$s turin-iose terp$se.
1aas mikroorganizm! kiekis %paprastai 4 O 4)S nuo to organizm! kiekio kurio
tikimasi .ermentacijos pabaigoje& vainamas - inokuliatu.
@erijin$je .ermentacijoje mikroorganizmai yra inokuliuojami # .iksuot terp$s t"r#
ir vykstant augimui, auginimo terp$je ar auginamose lstel$se kaupiasi galutinis
%reikiamas& prouktas.
1aitinamoji terp$ bioreaktoriuje %.ermentatoriuje& pastoviai kinta, tuo pa-iu
ver-ia kisti auginam! lsteli! metabolizm. 1a$jant maistini! meiag! kiekiui bei
kaupiantis kenksmingoms lsteli! i*skyroms, lsteli! augimas sustoja.
Lsteli! augimo priklausomyb$ nuo laiko .ermentatoriuje %pertraukiamame, arba
partijin$je gamyboje& galima pavaizuoti taipE
:augelis svarbi! proukt!, toki! kaip antibiotikai, susiaro stacionarin$je,
pertraukiamojo auginimo, kultivuojam! lsteli! augimo .az$je.
Tam ka prailginti pertraukiamj .ermentacij, tuo pa-iu paiinant i*eig
nauojamas taip vainamas lsteli! pamaitinimasE
4. Laipsni*kas koncentruot! terp$s komponent! %karbohiratu& pri$jimas, ta-iau
pai$ja kultivuojamos terp$s t"ris O nauojama kepimo mieli! gamyboje.
4I
Biomas$s
logaritmas
Laikas
'rain$
.az$
Logaritmin$ .az$ @tacionarin$
.az$
Lsteli!
"tis
A. Kanopka-Biotechnologija
G. Terp$s pri$jimas # auginamd kult"ra, bei tokio paties t"rio senos %panauotos& terp$s
pa*alinimas %nepertraukiama .ermentacija& O nauojama gyv"n! lsteli! kultivacijoje.
@kirtingai negu pertraukiamajame auginimo .ermentatoriuje procesas, nepertraukiama
kultivacija geriau subalansuota, auginama su neieliais maisting! meiag!, lsteli!
skai-iaus ar biomas$s kiekio svyravimais.
;epertraukiamoje .ermentacijoje sterili terpe pastoviu grei-iu yra tiekiama i
.ermentatori!, ir tokiu pat grei-iu terp$ pa*alinama i* .ermentatoraius, tuo b"u pastoviu
palaikant benra terp$s t"r#. Tokio tipo .ermentacija, skirtingai nuo pertaraukiamo tipo,
.ermentacijos leiia ilg laik .ermentatoriuje palaikyti pastov! p=, maistini! ir
metabolitini! meiag! koncentracijas. Ta-iau pertraukiamo tipo .ermentatorai vis ar
pla-iai nauojami pramonin$je.
Bioreaktoriai)*ermentatoriai.
Kiekvienas biotechnologinis procesas turi b"ti vykomas #rengime kuriame galima
sukurti aplinka labiausiai tinkama organizm! augimui.
Bioreaktoriai gali buti nuo papras-iausiai mai*om! ar nemai*om! nesterili! atvir!
konteineriu, iki kompiuteriais valom! prietais!.
:augeliui *iuolaikini! .ermentacijos proces! reikalinga i*vengti .ermentacijos proceso
ukr$timo pa*aliniais mikroorganizmais, bei i*vengti aplinkos uter*imo
mikroorganizmais. :irbant su geneti*kai pakeistais organizmais b"tina palaikyti juos
.ermentatoriuje tam ka i*vengti gamtos uter*imo.
'agal auginimo slygas .ermentacijos ar yra skirstomosE
- nesterilios .ermentacijos - kaa visi*kai neb"tinas kult"ros *varumas %nauojama
nuotek! valymo sistemose&.
- suerinamos .ermenacijos O kai keletas mikroorganizm! kartu auginami auga geriau
negu auginant juos atskirai. 3iuo atveju organizmai turi buti vieni nuo kit! priklausomi,
nes kitu atveju vienas mikroorganizmas augs intensyviau ir peraugs kita mikroorganizm
tuo b"u pra$s ominuoti terp$je.
- sterilios .ermentacijos - kai s$kmingam proukto .ormavimuisi %antibiotik!, vitamin!,
polisachari! gamyboje& b"tina slyga yra sterilumas.
Biologines reakcijos vyksta e.ektyviai tik esant optimaliems aplinkos parametrams ir
tokiu b"u ka kiekviena lstel$ b"t! vienoose slygose. 8ermentacijos reakcijos yra
multi.azin$s, #skaitant uj! .az2 %;
G
, N
G
, ir 9N
G
&, viena ar augiau skyst! .azi!
%vanenin$ terp$ ir vanenin# substrat&, ir vientis mikro.az2. Ka gauti greit mas$s ir
*ilumos peravim, visos *ios .az$s turi buti betarpi*kame kontakte.
Bioreaktoraus sistem! optimizavimas paremtas sekan-iais principaisE
- Ka i*vengti uter*imo pa*aliniais mikroorganizmais bioreaktriai turi buti hermeti*ki
bei skirti auginti reikalingam organizmuiP
- Auginimo terp$s t"ris turi buti pastovus t.y. .ermentatorius turi buti sanarus ka terp$
nenugaruot!P
- Aplinkos parametrai tokie kaip temperat"ra, p=, ir kiti, turi buti kontroliuojami, o
kult"ra gerai i*mai*oma.
45
A. Kanopka-Biotechnologija
1eiagos i* kuri! paarytas pats .ermentatorius taip pat vaiina svarb! vaimen#E
- /isos meiagos turin-ios slyt# su pakli"van-iu # bioreaktori! tirpalu ar
mikroorganizm! kult"ra, tikslu i*vengti terp$s uter*imo metalais, turi b"ti korozijai
atsparios.
- 1eiagos i* kuri! paarytas .ermentatorius turi buti netoksin$s, nes net maa toki!
meiag! koncentracija gali inhibuoti kult"ros augim.
- Bioreaktoriaus meiagos turi i*laikyti augkartin# ieli! temperat"r! ir sl$gio
pasikeitim %bioreaktoriai sterilinami ielio sl$gio garais&.
Tam ka pasiekti optimali auginamo mikroorganizmo ar galutinio proukto i*eig, ar ir
*iuo metu labai tr"ksta ini!, apie tai kokias slygas reikia suaryti .ermentatoriuje.
8ermentacijos procesas paprastai vykomas trimis staijomis %arba yiais&.
'rain$je staijoje pagrinine nauojant 'etri l$k*teles vykoma mikroorganizm!
atranka bei neieli! %4)) ml O 4 l& t"ri! .ermentacijos.
;usta-ius optimalias slygas .ermentacija vykoma jau iesniuose t"riuose
nauojant neielius % 0 O G)) l& .ermentatorius.
Nptimizavus slygas .ermentacija vykoma .ermentatoriuose kuriuose terp$s t"ris
siekia 0 O G) m
6
.
/isose .ermentacijos staijose biotechnolog! tikslas yra optimalios galutinio proukto
.ormavimuisi reikaling! aplinkos slyg! palaikymas.
"ermentacijos (roceso ter(s.
/is! biotechnologini! proces! pagrinas yra vanuo. Tai ominuojantis mikroorganizm!
auginimo terpi! komponentas. 8ermentacijos procesui pasiekus optimum, vanens
atskyrimas nuo uaugint! mikroorganizm! vienas i* pagrinini! ir aug snau!
reikalaujantis %brangus& procesas.
/anens kokyb$ O svarbus .aktorius turintis #tak mikroorganizm! augimui, o tuo pa-iu
ir galutinio %reikiamo& proukto .ormavimuisi. Anks-iau traici*kai pagrinin$s
.ermentacijos proceso nauotojos, alaus aryklos, steig$si tokiose vietov$se kur auk*tos
kokybes vanuo buvo gaunamas i* nat"rali! *altini! tuo pa-iu nereikalaujant papilom!
i*lai!.
1ikroorganizm! augimo terp$ turi tenkinti pagrinin# maistini! meiag! poreik#
t.y. tur$ti prieinam anglies *altin#, azoto *altin#, neorganinius elementus ir kai kuriems
organizm! tipams speci.inius augimo .aktorius.
Terp$s sterilizacija turi buti vykoma taip, ka kuo maiausiai paeisti terp$s
komponentus %jie gali buti alinai termi*kai neatspar"s auk*toms temperat"roms&.
Femo %mao& maistingumo terp$je organizmai augs labai nee.ektyviai.
;uo mitybin$s terp$s su$ties ir auginimo slyg! labai priklauso mikroorganizm!
meiag! apykaitos procesai ir baltym! kiekis. H terp2 pri$jus metabolizmo proukt!,
galima nutraukti %represuoti& vien! baltym! biosintez2 ir inukuoti kit! baltym!
biosintez2. Kei-iant mikroorganizm! kultivavimo slygas, galima pasiekti ka
susiaran-ioje biomas$je b"t! aug tikslinio proukto.
G)
A. Kanopka-Biotechnologija
+iet# substrat# *ermentacijos.
:augelyje biotechnologini! proces! reikalingas mikroorganizm! auginimas prakti*kai
nesant, ar esant labai maiems laisvo vanens kiekiams. :aniausiai augimas nauojant
kietus substratus vykomas panauojant jav! gr"us, kukur"z! s$klas, meiagas i*
lignoceliulioz$s tokias kaip *iauai, pjuvenos, o taip pat ir pla-i augalini! bei gyvulini!
meiag! s.er. 3ios meiagos pagrine yra netirpios ar labai maai tirpios vanenyje,
ta-iau pigios, lengvai gaunamos, polimerin$s meiagos, kurios panauojamos kaip
koncentruota mikroorganizm! auginimo terp$.
:augeliui kiet! substrat! .ermentacij!, tikslu sumainti komponent! y# bei
paiinti suri*tu maistini! meiag! kiek# reikalingas pirminis substrato aporojimas
%*iauai susmulkinami, arov$s susmulkinamos&.
Kiet! substrat! .ermentacijos panauojant tokias aliavas kaip *iauai, meio bei
kit! pramon$s *ak! atliekas, gaminamas etanolis, metanas bei pa*arin$s biomases.
,induoli# ir augal# lsteli# kult-ros.
'agrine biotechnologin$ms reikm$ms auginamos bakterij!, mieli!, gryb! kult"ros, ir tik
neseniai pra$ta auginti augal! bei inuoli! kult"ros ieliais kiekiais.
3iuo metu yra kultivuojamos kaul! lstel$s, kremzl$s, kepen!, plau-i!, kr"tin$s, oos,
inkst!, nerv! %neuronu&, ukr"-io liaukos lstel$s ir aug #vairi! tip! veini! lsteli!.
Ayv"n! lsteli! kultivacija pramoniniu b"u nauojama gaminant vakcinas %poliomelito,
kiaulytes, tymai, pasiutlige ir kt.&, inter.eronus, hormonus, insulin ir #vairius antik"nius.
'agrinin$s problemos su kuriomis susiuriama kultivuojant inuoli! lsteles tai j!
ielis jautrumas vanens *varumui, terp$s kokybei bei .ermentacij! uter*imas greitai
augan-iais mikroorganizmais.
;aujai i*skirtos i* inuoli! sistem! kult"ros vainamos pirminmis kult%romis. 3ioje
staijoje lstel$s paprastai yra heterogeniskos. 'o keleto kutivacij! naujoje terp$je *ios
lstel$s arba "na arba trans.ormuoasi susi.ormuojant vientisa l&steli' linija.
Ayv"n! lstel$s gali augti arba suspensijoje, arba prisitvirtinusios prie kieto pavir*iaus.
Tokios lstel$s kaip =eLa %lsteli! tipas i*vestas i* mogaus piktybiniu lsteli!& gali augti
viejose b"senose arba kaip lim.oblastoiines lstel$s kult"ros suspensijoje, arba tuo
tarpu kaip pirmin$s arba normalios iploiin$s lstel$s augs tik prisitvirtinusios prie kieto
pavir*iaus. 1anoma ka ateities biotechnologijoje pagrine bus nauojamos
prisivirtinan-ios lstel$s.
1onosluoksnini! gyvulini! lsteli! kultivacija susijusi su pavir*iumi prie kurio gali
lstel$s prisitvirtinti, ir *io metoo i*vystymas susij2s su auginimo pavir*iaus ploto
iinimu.
Po *ermentacijos sekant!s (rocesai.
Lsteli! auginimas bioreaktoriuse uoa tik grub! proukt. @ekan-ios staijos reikalauja
reikiamo proukto i* lsteli! i*skyrimo ir jo i*gryninimo.
'o .ermentacijos sekantys procesai suaro pagrininius augelio biotechnologini!
proces! ka*tus.
1etoai nauojami po .ermentacijos apimaE centri.ugavim, .iltracij, ultra.iltracij,
ekstrakcij panauojant tirpiklius, elektro.orez2 bei chromatogra.ines staijas.
G4
A. Kanopka-Biotechnologija
Aalutinis prouktas, komerciniam jo platinimui, turi buti stabilus. :augumai proukt!
stabilumas pasiekiamas juos i*iovinant. ;auojant iovinimo metous yra gaunamos
organin$s r"g*tys, amino r"g*tys, antibiotikai, polisachariai, .ermentai, ir augelis kit!
proukt!. Ta-iau kai kurie prouktai, $l savo nestabilumo ar aktyvumo praraimo,
negali buti iovinami, to$l jie b"na tirpalo paviale.
vadas balt!m# gr!ninim.
Baltymai tai jautrios molekul$s to$l joms b"inga termolabilumas, tenencija
enat"ruoti terp$se, kuriu p= reik*m$s yra ekstremalios, ar kuriose yra sunki!j! metal!
bei kit! nepalanki! .aktori!. :anai gryninami baltymai pasiaro nestabil"s, to$l jiems
reikia empyri*kai parinkti tinkamus stabilizatorius. Kol kas n$ra benr!j! kriterij!
leiian-i! tam tikriems baltymams parinkti tinkamus stabilizatorius.
Aryninant baltym, i* augelio baltym! mi*inio i*skiriamas vienas, turintis reikiam
katalitin# aktyvum. Kuo augiau pa*alinama neaktyvi! baltym!, tuo iesnis arosi
santykis tarp katalitinio aktyvumo vienet! ir baltymo kiekio. 3is yis vainamas
specifiniu fermento aktyvumu ir yra vienas i* baltym! gryninimo mat!.
Baltym! gryninimas kinta %varijuoja& nuo paprasto vienos pakopos i*soinimo proce"r!
iki augiapakopi! proces!. :anai tam ka pasiekti reikiam proukto *varum
reikalinga augiau negu viena baltymo gryninimo pakopa %staija&.
Biologines .aliavos suard!mas.
:iel$ alis baltym! ir .erment!, ankstyvojoje baltym! tyrin$jim! staijoje, buvo i*skiriami
i* nelstelinio tirpalo. Tai buvo aroma to$l ka i* tarplstelinio tirpalo yra pakankamai
nesunku i*siskirti *iuos baltymus, o taip pat baltymai esantys tarplsteliniame tirpale $l
isul.iini! tilteli! yra pakankamai stabil"s ir neielio yio %lizocimas, ribonukleaz$,
chimotripsinas&. Ta-iau augumas baltym! ranasi pa-ioje lstel$je. :anai *ie baltymai yra
nestabil"s, nes paprastai lsteli! viin$ aplinka pasiymi reukuojan-iomis savyb$mis, to$l
baltym! strukt"ra neturi isul.iini! tilteli!.
Lstel$se baltymai anai suaro kompleksines polibaltymines sistemas, veikian-ias ne
vien o augel# viena po kitos vykstan-i! meiag! apykaitos reakcij!. ;orint i* tokios
strukt"ri*kai organizuotos sistemos i*gryninti vien ar kelet baltym!, reikia t strukt"r
suaryti taip, ka nutrukt! jungtys tarp baltym! ir kit! membranini! strukt"rini!
komponent!, bet nesuirt! baltym! strukt"ra, nes prie*ingu atveju gali i*nykti baltym!
katalitinis aktyvumas. Lsteli! suarymo procesas vainamas lsteli! dezintegracija.
Ayv"n! auiniai savo atsparumu suarymui pla-iai varijuojaE greta lengviausiai suarom!
eritrocit! reikalingas ir auini! turin-i! kolageno %toki! kaip kraujo inai ir kiti auiniai
suarantys lygiuosius raumenis& suarymas. Lyginant su gyvulin$mis, augalin$s lstel$s, $l
j! celiuliozinio apvalkalo, yra sunkiau suaromos. Bakterij! tarpe greta palyginti trapi!
lsteli! kurios yra suaromos vir*kinimo trakto .erment! ar tik osmotinio *oko egzistuoja ir
labiau suarymui atsparios, turin-ios stor lsteli! sienel2, bakterijos, kuri! suarymui jau
reikalingas mechaninis poveikis. Ta-iau *is poveikis neturi buti per aug ielis, nes esant
per ieliam poveikiui galima labili! baltym! inaktivacija.
Lsteli! suarymo b"ai skirstomi # 6 grupesE
GG
A. Kanopka-Biotechnologija
- .izin$-mechanin$ lsteli! ezintegracijaP
- chemin$ lsteli! ezintegracijaP
- .ermentin$ lsteli! ezintegracija.
'agal lsteli! suarymo pob"# lsteli! suarymas skirstomasE
+. ,velnus suardymas(
Nsmotinis lstel$s membranos suarymasP
8ermentinis suarymasP
9heminis tirpinimas ir autoliz$P
=omgenizacijaP
@usmulkinimas.
-. Suardymas veikiant vidutinei jegai(
1echaninis stambi! lsteli! suarymasP
@uarymas abrazyvu.
.. Sti!rus suardymas(
Kkstruzinis metoasP
RltragarsasP
Balistiniai metoai.
;e visi baltymai egzistuoja tirpiuose pavialuose, to$l toki! baltym! gryninimo s$km$
priklauso nuo to kaip galima su gera i*eiga atskirti tokius baltymus nuo likusios netirpios
meiagos.
Nelstelinio ekstrakto gavimas.
@uarius lsteli! biomas2 gaunama suspensija suaryta i* i*tirpusi! baltym!, nukleino
r"g*-i!, polisachari! bei suspenuotu lsteli! nuolau!, lsteli! viaus strukt"rini!
komponent! bei j! nuolau!. Taigi norint i* tokio mi*inio i*skirti vien i* augelio
i*tirpusi! baltym!, pirmiausiai reikia pa*alinti suspenuotas aleles ir i* lsteli! gauti
ekstrakt, turint# tik i*tirpusi! meiag!.
#entri'ugavimas - tai vienas i* aniausiai nauojam! meto! netirpioms alel$ms
atskirti nuo tirpalo. @uspenuot! aleli! tankis yra *iek tiek iesnis u tirpalo tank#.
Lsteli! homogenato suspenuotos alel$s yra labai maos, j! tankis labai neaug skiriasi
nuo tirpiklio tankio, to$l seimentacija $l emes traukos j$gos vyksta labai l$tai. 3io
proceso pagreitinimas pasiekiamas centri.ugose. Ka b"t! galima suvienointi visose
centri.ugose i*soinimo slygas to$l yra #vestas taip vainamas santykinis
centri.ugavimo laukas %<98& kuris roo kiek kartu augiau u emes traukos j$g vyksta
i*soinimas.
<98 i*rei*kiamas .ormuleE
<'1 X <98 ^ 4.4Gr ] 4)))
<98 X %<'1^4)))&
G
] 4,4G r
<98- santykinis centri.ugavimo laukas %relative centri.ugation .iel %<98&
<'1 - rotoriaus apsisukimai per minut2
r - atstumas nuo a*ies %mm&
G6
A. Kanopka-Biotechnologija
Turimose centri.ugose, atsivelgiant # rotoriaus i# %atstum nuo centri.ugos a*ies& ir
apsisukim! skai-i!, pasiekiama i*centrin$ j$ga gali buti 4))) O 0)) ))) kart! iesn$ u
em$s traukos j$g.
Lstel$ms ar j! homogenatams .rakcionuoti paprastai tinka centri.ugos, kuri! rotoriai
sukasi 40 ))) O ,) ))) aps.^min grei-iu.
&iltravimas Otai vienas i* papras-iausi! nei*tirpusi! aleli! atskyrimo nuo tirpalo b"!.
+uo anai nuo skys-io atskiriamos kristalin$s bei stambiagranulin$s aleles. 3is b"as
re-iau taikomas biologin$s kilm$s suspensijoms. :ezintegruot! lsteli! suspensijos yra
labai ispersi*kos ir suaro geli! pob"io strukt"ras. 8iltruojamos jos susispauia ir
ukem*a .iltrus. Lsteli! homogenatus .iltruoti galima tik parinkus pagalbines stambiai
akytas pagalbines meiagas. 'agalbin$s meiagos suaro vientisus, ispersi*kus
sluoksnius, kuriuose sulaikomos labai susmulkintos suspensijos aleles. %Kaip pagalbines
.iltruojan-ios meiagos, vartojami susmulkintas asbestas, stambiai por$tas perlitas
gaunamas i* egint! uolien!&.
Balt!m# gr!ninimas j# i&sodinimu.
Faliava paprastai kuo grei-iau panauojama tuo geriau, nes laikant kai kuriais atvejais
aliavoje prasiea nat"ral"s egraacijos procesai.
Ankstyvojoje baltym! chemijoje vieninteliu nauojamu baltym! atskyrimo metou buvo
baltym! i*soinimas kei-iant tirpiklio savybes. Toliau nuos$os nuo tirpalo buvo
atskiriamos .iltracija ir tirpinamos prainiame tirpale. 3is baltym! atskyrimo vien! nuo kit!
metoas yra nauojamas ar ir abar.
Baltym! nuos$os tai stamb"s baltym! molekuli! agregatai, ir nuo tirpalo juos galima
atskirti centri.ugavimu esant slyginai neielei i*centrinei j$gai.
:iioji alis .erment! tai tirp"s baltymai kurie ranasi lsteliniame tirpale. Tai gerai, esant
.iziologin$ms slygoms %).40-).G 1 joninei j$gai& ir neutraliam p=. Kai kurie baltymai
i*krenta # nuos$as esant joninei j$gai tarp nulio ir .iziologin$s reik*m$s, tai vysta to$l ka
tarpmolekulin$ atost"mio j$gos yra nepakankamos.
p! artjant link izoelektrinio ta(ko) molekuli' kr%viai ma*ja iki nulio
elektrostatines atost%mio jgos taip pat suma*ja ir molekules pritraukiamos vena prie kitos
t.y. jos agreguoja. +is procesas vadinamas izoelektriniu i(sodinimu.
Baltym! i*soinimui labai svarbus .aktorius - ruskos prigimtis %t.y. jos tirpumas&.
K.ektyviausiai veikia ruskos kuri! anijonai turi ieli kr"v# %sul.atas, .os.atas, citratas&.
Katijonai *iuo atveju vaiina maesn# vaimen#. 'agal baltym! i*soinimo e.ektyvum
anijonai sueami # taip vainama =o.meisterio eil2, kuri atroo taipE @9;
-
, +
-
, 9lN
,
-
, ;N
6
-
,
Br
-
, 9l
-
, 9=
6
9NN
-
, @N
,
-
, 'N
6
-
. ;ors .os.ato jonai ir e.ektyviausiai i*soina baltymus, ta-iau
esant neutraliam p= .os.atas suarytas i* jon! ='N
,
G-
ir =
G
'N
,
-
kurie yra maiau e.ektyvus
lyginant su 'N
,
-
.
Katijonus pagal e.ektyvum baltym! i*soinimui galima sueami # toki eil2E ;=
,
M
J K
M
J
;a
M
.
@varb! vaimen# # tirpal pri$jus ruskos vaiina tirpalo tankis, nes kuo iesnis tirpalo
tankis tuo reika iesnes j$gos atskiriant nuos$as nuo vaneninio tirpalo %t.y. reikia
iesnio centri.ugavimo grei-io&.
G,
A. Kanopka-Biotechnologija
'agrine tik viena ruska atitinka keliamus reikalavimus ir prakti*kai neturi ieli! tr"kum!
- tai amonio sul.atas [%;=
,
&
G
@N
,
\. +os tirpumas temperat"riniame intervale ) - 6)
o
9 labai
maai kei-iasi. @otaus tirpalo tankis 4.G60 g^cm
6
, o baltymini! agregat! tankis 4.G5 g^cm
6
.
%Ksant p= ?.,, 6 1 kalio .os.ato tirpalo tankis yra 4.66 g^cm
6
ir to$l jo prakti*kai
ne#manoma atskirti centri.ugavimu&.
Amonio sul.atas *variame paviale lengvai prieinama, pakankamai pigi netgi panauojant ja
ieliais kiekiais, ruska.
Amonio sul.atas pasiymi par"g*tinan-iomis savyb$mis, tam ka bu.erinio tirpalo p=
i*soinimo metu nesikeist!, jis turi tur$ti atitinkam bu.erin# paj$gum.
Taip pat rusk! koncentracija i*soinanti baltym priklauso ne tik nuo baltymo savybi!, bet
ir nuo kit! baltym! esan-i! tirpale savybi!, o taip pat ir nuo baltym! koncentracijos tirpale.
+eigu baltymo koncentracija maesn$ kaip 4 mg^ml norint baltym i*sointi reikia
koncentruoti panauojant kitus metous %pvz.E ultra.iltracij&.
Balt!m# i&sodinimas organiniais tir(ikliais.
H baltym! vanenin# ekstrakt prieant tokius tirpiklius kaip etanolis, acetonas sukeliami
#vair"s e.ektai ko pasekm$je baltymai yra i*soinami i* tirpalo t.y. jie agreguoja. Tai #vyksta
$l vanens aktyvumo suma$jimo.
'aprastai baltymams i*sointi i* tirpalo nauojami su vaneniu gerai besimai*antys
organiniai tirpikliai - etilo alkoholis, acetonas, re-iau - metilo ir izopropilo alkoholiai,
polietilenglikolis. Kaangi auk*tesn$je temperat"roje %auk*tesn$je negu M,
o
9& baltymai
vanens ir organini! tirpikli! mi*iniuose link2 enat"ruoti, tai .rakcionuoti organiniais
tirpikliais reikia emesn$je kaip )
o
9 temperat"roje.
8rakcionavimo organiniais tirpikliais e.ektyvumas priklauso nuo augelio slyg!E
- i*tirpusi! rusk! koncentracijosP
- baltym! koncentracijosP
- baltym! su$tiesP
- tirpalo p=.
:ruskos, iinamos augelio baltym! tirpum, maina baltym! i*soinimo organiniais
tirpikliais e.ektyvum.
/hromatogra*iniai balt!m# *rakcionavimo metodai.
9hromatogra.ija tai .izikinis atskyrimo metoas kuriame atskiriami komponentai
paskirstyti tarp viej! .azi!, viena i* kuri! yra stacionari %stacionari .az$&, kita juanti
nustatyta kryptimi %juri arba mobili .az$&.
9hromatogra.ija O labai e.ektyvus meiag! mi*ini! .rakcionavimo metoas O atsirao ir
susi.ormavo pra$jusiame amiuje. +o praininkas rus! mokslininkas 1ichail 9vetov,
45)6 m. paskelb2s uomenis apie augalini! pigment! mi*inio, praleisto per 9a
6
%'N
,
&
G
upilyt kolon$l2, suskirstym # atskiras spalvotas zonas. ;uo to kilo metoo
pavainimas O chromatogra.ija %ra*ymas spalvomis&. 'la-iai *is metoas paplito *io
*imtme-io ,)-aisiais metais ir paar$ aug permain! chemijoje, biologijoje, meicinoje
bei #vairiose technikos *akose.
G0
A. Kanopka-Biotechnologija
'ro.ilis kuriuo meiagos nuo plok*tel$s ar i* sorbentu %erva& upilyto vamzelio yra
i*plaunamos %eliuojamos& vainamas eliucijos profiliu.
/hromatogra*ija !ra skirstoma0
/. "riklausomai nuo 'rakcionavimo !rinci!o(
- 9hromatogra.ija geliuose ^ geli! ekskluzin$ chromatogra.ija ^
yi! ekskluzin$ chromatogra.ija ^ gel-.iltracijaP
- 'asiskirstomoji chromatogra.ijaP
- Asorbcin$ chromatogra.ijaP
- +on! main! chromatogra.ijaP
- A.inin$ chromatogra.ijaP
- =iro.obin$ chromatogra.ijaP
- Araientin$ chromatogra.ija.
//. "riklausomai nuo eliucijos *0do(
- 8rontalin$ analiz$P
- D*stumiamoji chromatogra.ijaP
- 9hromatogra.in$ eliucija.
///. "riklausomai nuo stacionarios 'azs(
- 9hromatogra.ija kolon$l$seP
- 9hromatogra.ija storuose sluoksniuose %gel-.iltracija&P
- 9hromatogra.ija plonuose sluoksniuose %plonasluoksn$ chromatogra.ija&P
- 'opieriaus chromatogra.ijaP
- 9hromatogra.ija ant pl$veli!P
/1. "riklausomai nuo judan2ios 'azs(
- @kys-i! chromatogra.ijaP
- :ujin$ chromatogra.ija.
/. "riklausomai nuo 'rakcionavimo !rinci!o(
#hromatogra'ija geliuose 3 geli4 ekskliuzin chromatogra'ija 3 dyd5i4 ekskliuzin
chromatogra'ija 3 gel'iltracija.
Tai meiag! skirstymas pagal j! molekulin# y#. 9hromatogra.in$ meiaga turi savyje
maas poras, # kurias gali patekti maos molekul$s, o iel$s negali patekti %skirtingos
meiagos turi skirtingus por! yius, taigi apibr$imas `maas` ar `ielis` por! yis
priklauso nuo to kokias meiagas norima atskirti&. Kai molekuli! mi*inys jua per
kolon, maos molekul$s i.unuoja # poras, kur tirpiklis yra stacionarioje .az$je, taigi
maos molekules kakur# tai laik praleiia nejuant. :iel$s molekul$s negali patekti #
poras, tuo pa-iu jos visa laik b"na juan-ioje .az$je. To$l iel$s molekul$s jua
kolona grei-iau, palyginus su maomis t.y. iiosios molekul$s nepatenkan-ios #
granuli! vi!& jua, o maosios atsilieka, nes nuolat pasiskirsto tarp granuli! viaus ir
i*or$s.
"asiskirstomoji chromatogra'ija.
3ioje chromatogra.ijoje nejuri ir juri %mobili& .az$s suarytos i* viej! nesimai*an-i!
ar sunkiai besimai*an-i! tirpal! %skys-iu&. Tokioje sistemoje i*tirpinus kakoki tai
G(
A. Kanopka-Biotechnologija
meiag jos koncentracija abiejuose tirpikliuose bus vienoa tuo atveju jeigu meiaga
bus tirpi abiejuose tirpikliuose. Kitu atveju meiagos molekul$s pereis i* vienos skystos
.az$s # kit, tol kol nusistov$s pusiausvyrin$ b"sena, kai auk*tesn$ meiagos
koncentracija bus tame tirpiklyje kuriame meiaga pasiymi iesniu tirpumu. Kai tokie
tirpalai suaro juri ir nejuam chromatogra.ijos .azes tai meiag! pasiskirstymas
tarp .azi! vyksta pagal meiagos tirpum juose. Kuo meiaga giminingesn$ %t.y. jos
tirpumas iesnis& nejuriai .azei tuo ji l$-iau jua i*ilgai kolon$les ar plok*tel$s.
:aniausiai viena i* .azi! yra organinis tirpiklis, tuo tarpu kit .az2 suaro vaneninis
tirpalas. 3iuo atveju meiag! .rakcionavimas vyks priklausomai nuo j! hiro.obi*kumo.
Dstori*kai taip jau susiklost$ ka ,normali', .azi! i*si$stymu vainamas .azi!
i*si$stymas kaa nejuri yra vanenin$ .az$. :$l savo r$kinam!j! savybi! vanenin$
.az$ lengvai yra .iksuojama ant hiro.ilini! matric! %celiulioz$s, poliakrilamiini! arba
ekstranini! geli!, silikageli! ir kt.&. +uri .az2, *iuo atveju, suaro organiniai tirpikliai.
Kai .az$s yra atvirk*-ios, t.y. kai prie kietos matricos yra .iksuojama organinio tirpiklio
pl$vel$, o juri .az2 suaro vaneninis tirpalas pasiskirstymo chromatogra.ija vainama
atvirk(tini' fazi' chromatografija %<'9 - reverse phase chromatography&.
$dsor*cin chromatogra'ija.
Asorbcin$je chromatogra.ijoje nejuri .az2 suaro kietas sorbentas. @orbcijos ir
esorbcijos proces! pusiausvyra, kuri yra gana toli nuo sorbento prisotinimo ribos,
nusistato nepriklausomai kiekvienam mi*inio komponentui. Atitinkamai, kuo iesniu
giminingumu sorbentui pasiymi mi*inio komponentai tuo l$-iau jie migruos per
kolon$l2 ar plok*tel2. Kai sorbcija vyksta granuli! pavir*iuje, tai turima tikra %*vari&
asorbcin$ chromatogra.ija. Kai sorbentas turi poring strukt"r ir iel$ alis
sorbuojamo pavir*iaus yra granuli! viuje, tai meiagos molekuli! sulaikymui
%skirstymui& turi #takos ir j! i.uzijos procesas, nejuriame skystyje esan-iame por!
viuje, pana*iai # t kuris sutinkamas geli! ekskluzin$je chromatogra.ijoje %gel-
.iltracijoje&.
6on4 main4 chromatogra'ija.
+on! mainai tarp netirpaus, jonogenini! grupi! turin-io polimero ir tirpalo buvo nustatyti
maiems jonams ir panauoti ruskoms i* vanens pa*alinti %vaneniui mink*tinti&.
Hvair"s jonai nevienoai stipriai susijungs su polimero jonogenin$mis grup$mis, to$l jie
atsiskirs nuo polimero ne vienu metu. :$l skirtingo a.ini*kumo keletas vienoai
jonizuot! meiag! %pvzE skirtingos amino r"g*tys, nukleotiai, monosachariai,
neorganiniai katijonai arba anijonai& per kolon$l2 pripilyta jonit!, jua nevienou
grei-iu.
Baltymai - tai su$tingi polimerai, turintys aug jonogenini! grupi!. /ienos i* j! gali buti
#krautos teigiamai, kitos - neigiamai. 3i! kr"vi! suma yra benras %suminis& baltymo
molekules kr"vis.
:esorbuoti %atplauti nuo sorbento& prie sorbento prijungta baltymo molekul2 galima
kei-iant jonin2 j$g, p=, temperat"r.
/isi jonitai skirstomi # anijonitus ir katijonitus pagal tai, koki jon anijonit ar katijonit -
jie gali sorbuoti i* tirpalo.
$'inin chromatogra'ija.
G?
A. Kanopka-Biotechnologija
A.inin$je chromatogra.ijoje speci.in$ molekul$ yra prikabinta prie chromatogra.in$s
meiagos %sorbento& o .rakcionuojamos meiagos yra i*skirstomos pagal j! sugeb$jim
prisiri*ti prie speci.in$s molekul$s. +eigu prijungta molekul$ yra iel$, o molekul$s
kurios turi buti atskirtos yra maos, tai *is procesas paprastai vainamas afinine
chromatografija. +eigu prijungta molekul$ yra maa, o molekul$s kurios turi buti
atskirtos yra iel$s, tai metoas paprastai vainamas kovalentine chromatografija)
ta-iau tai taip pat anai taip pat vainama a.inine chromatogra.ija.
3iuo atveju biospeci.in$ atranka vyksta sorbcijos %prisijungimo prie sorbento&
staijoje, nes gryninamas baltymas pasiymi speci.iniu giminingumu sorbentui $l ko
#vyksta gryninamo baltymo susijungimas su liganu. ;orint eliuoti speci.i*kai sorbuot
baltym, tenka vartoti labai gerai su sorbentu saveikaujan-ius e.ektorius.
7idro'o*in chromatogra'ija.
3ioje chromatogra.ijoje, kaip stacionari .az$, paprastai nauojamos hiro.obin$s
meiagos, tokios kaip nepaveiktas %neaporotas& silicis. Atskiriam! meiag!
molekul$s, priklausomai nuo j! hiro.obi*kumo, stipriau ar silpniau sveikauja su
stacionare .aze, tuo b"u atsiskiria viena nuo kitos.
Baltym! mi*ini! .rakcionavimas hiro.obiniais sorbentais pana*us # a.inin$s
chromatogra.ijos proces, jis susiea i* vienas po kito einan-i! sorbcijos, nesorbuot!
baltym! i*plovimo ir eliucijos proces!.
8radientin chromatogra'ija.
3iuo atveju visos m$ginio molekul$s yra susiri*amos su netirpia meiaga, toliau jas
i*plaunant %eliuojant& jonin$s j$gos iinimu tirpale, arba kei-iant eliucinio tirpalo p=.
//. "riklausomai nuo eliucijos *udo(
&rontalin analiz.
Taip vainamas chromatogra.ijos proceso variantas, kaa komponent! mi*inys pastoviai
yra tiekiamas # chromatogra.in2 kolon$l2. 3iuo atveju i*$jime %eliucijoje& pasiroo vienas
po kito sekan-i! keletas eliucijos `.ront!`. 'o pirmojo komponento eliucijos, kuris
pasiymi maiausiu giminingumu nejuriai %pastoviai& .azei, toliau seka antrojo pagal
jurum %giminingum& komponento eliucija ir .t.t.
3iuo metu .rontalin$ analize terminas nauojama labai retai, tik i*imtinais atvejais.
/%stumiamoji chromatogra'ija.
3iuo atveju, praioje, # kolon$l2 arba ant chromatogra.in$s plok*tel$s starto linijos
une*amas atitinkamas kiekis meiagos, o eliucija vykoma meiagos, pasiymin-ios
ymiai iesniu giminingumu nejuriai .azei, negu bet kuris .rakcionuojamo mi*inio
komponentas. Hvyksta komponent! susiri*usi! su nejuria .aze i*st"mimas ir pirmiausiai
yra i*stumiami junginiai pasiymintys maiausiu giminingumu sorbentui, po to jau
i*stumiami iesniu giminingumu sorbentui pasiymintys junginiai.
Analitiniam .rakcionavimui *is metoas yra prakti*kai nenauojamas %netinkamas&,
ta-iau preparatyviam meiag! atskyrimui *is metoas iki *iol nauojamas.
#hromatogra'in eliucija.
GI
A. Kanopka-Biotechnologija
3iame metoe eliucinis tirpalas pasiymi maesniu giminingumu sorbentui negu bet kuris
.rakcionuojamo mi*inio komponentas une*tas # kolon$l2 ar ant plok*tel$s. Tokie
komponentai pastoviai i* juan-ios .az$s yra `i*plaunami` ir $l nepertraukiamo
meiagos pasiskirstymo tarp nejurios .az$s ir eliuento, jua i*ilgai kolon$l$s.
Kiekvienas j! migruoja nepriklausomai nuo kit! atitinkamai jo giminingumui pastoviai ir
jurai .az$ms. 1igracija vyksta tuo l$-iau kuo iesnis yra meiagos giminingumas
nejuriai %pastoviai& .azei.
///. "riklausomai nuo stacionarines 'azes chromatogra'ija yra skirstoma(
#hromatogra'ija kolonlse.
Tai pla-iausiai nauojama chromatogra.ija. ;etirpios .az$s alel$s yra patalpinamos #
vamzel# ir per ji yra praleiiamas tirpalas. ;auojant kolon$li! chromatogra.ija galima
i*gryninti ielius kiekius meiagos. /iena i* chromatogra.ijos atmain! yra didelio
efektyvumo skystine chromatografija -!$./0 high performance li1uid chromatography)
dar kartais vadinama auk(to slgio skys2i' chromatografija 3. 3iuo atveju skystis l$tai
yra pumpuojamas per slyginai ma kolon esant ieliam sl$giui %6) - ,)) atm.&. Tokiu
atveju labai pai$ja meiag!, pasiymin-i! pana*iomis savyb$mis, atskyrimo
e.ektyvumas.
#hromatogra'ija storuose sluoksniuose.
Kai chromatogra.ijos procesas vyksta nuoulniai gulin-iame, lygiame ir slyginai
storame %keletas mm.& atvirame nuo pavir*iaus granuli! sluoksnyje, tarp kuriame jurios
.az$s tirpalas teka veikiamas tik traukos j$gos, tai galima vainti chromatogra.ija storame
sluoksnyje. 'rakti*kai *is metoas rao pritaikym tik ekskluzin$je chromatogra.ijoje
%gel-.iltracijoje&.
#hromatogra'ija !lonuose sluoksniuose ("lonasluoksn chromatogra'ija (9:# thin
layer chromatogra!hy)).
'lonas %).4 - ).0 mm.& granuli! sluoksnis pritvirtintas prie stiklo plok*tel$s pavir*iaus,
leiia vykyti chromatogra.ij ploname sluoksnyje. @kystos .az$s ju$jimas vyksta $l
kapiliarini! j$g!.
3iuo atveju stacionari .az$ yra plonas aporoto silicio sluoksnis, kuriuo paengta stiklo
plok*tel$.
9hromatogra.ija plok*tel$se gali vykti horizontaliai arba vertikaliai, pastaruoju atveju
jurios .azes ju$jimas gali vykti plok*tele auk*tyn arba emyn - tai nevaiina
principin$s rol$s, nes skys-io ju$jimas pagrine slygojamas kapiliarin$mis j$gomis.
"o!ieriaus chromatogra'ija.
3ioje chromatogra.ijoje kaip netirpi .az$, yra nauojamas .iltrinio popieriaus lapas. Kai
kaa popierius gali tur$ti #vestas papilomas #vairias jonogenines grupes.
#hromatogra'ija ant !lveli4.
/ietoje popieriaus nauojamos pl$vel$s i* moi.ikuotos celiulioz$s, poliamiines
pl$vel$s, ir kt.
G5
A. Kanopka-Biotechnologija
/1. "riklausomai nuo judancios 'azes(
Skys2i4 chromatogra'ija.
3iuo atveju mobili .az$ tai skystis, o stacionari .az$ kieta meiaga arba kitas tirpalas,
nesimai*antis arba tik alinai besimai*antis su pirmuoju tirpalu. :ar yra i*skiriamos
skystin$s chromatogra.ijos variacijosE
4& @kys-i!-kietos .azes chromatogra.ijaP
G& @kys-i!-skys-i! chromatogra.ija, kai stacionari skystin$ .az$
pritvirtinta prie kieto ne*$jo.
Dujin chromatogra'ija (8#).
:ujin$ chromatogra.ija ar skirstomaE
4&. :uj!-kietos .az$s chromatogra.ijaP
G&. :uj! O skys-i! chromatogra.ija.
;auojama laki! %ar j! lakumui paiinti, chemi*kai moi.ikuot!& molekuli! atskyrimui.
:uj! chromatogra.ijoje kar*t! uj! srov$ praleiiama per plon, termostatuojam,
vamzel#. Lakios alel$s pasiskirsto tarp ujin$s ir skystos %susiaran-ios ant vamzelio
sieneli!& arba kietos, esan-ios vamzelyje, .azi!. Laikas reikalingas uj! pra$jimui per
vamzel# priklauso nuo *io pasiskirstymo.
:aleli! i*einan-i! i* vamzelio aptikimui, uj! chromatogra.ai paprastai, turi jonizacijos
etektorius. :ujoms pereinant per liepsn, susiar2 tikslini! molekuli! jonai aptinkami
kaip elektrinis signalas. Tai jautrus ir pla-iai nauojamas metoas, bet netinkamas tam
ka po jo molekul$s but! surinktos ir toliau panauotos.
Baltym! gryninime mobili .az$ pagrine yra vanuo ar vaneniniai tirpalaiE to$l ka
pagrine beveik visos molekul$s ominan-ios biotechnologij yra augiau ar maiau
tirpios vanenyje, o tokios molekul$s kaip baltymai kituose tirpikliuose yra nestabil"s.
Biotechnologijos (asiekim# (ritaik!mas (raktikoje.
4iopolimerai.
Tai iel$s augiavienetin$s makromolekul$s gaunamos i* gyv!j! organizm!. Kai kurie
i* *i! polimer! pasiymi .izin$mis ir chemin$mis savyb$mis nauingomis maisto
perirbimo, .armacin$je bei apirbimo pramon$s *akose. Biopolimerai gali b"ti gauti i*
mikroorganizm!, augal! ir gyv"n!.
Aalimyb$ geneti*kai keisti organizmus skatino nauj! biopolimer! paie*ka, tikslu pakeisti
abar egzistuojan-ius sintetinius polimerus ekvivalentiniais biopolimerais, pagerinant j!
.izines ir strukt"rines charakteristikas, o taip pat suranant kelius i*eigos paiinimo bei
pramoninio proceso kain! sumainim.
5ikroiologinis pavojing' atliek' perdirimas.
6)
A. Kanopka-Biotechnologija
Dlg laik buvo tikima ka em$s ir vanens sistemos pilnai neutralizuoja pramon$s bei
em$s "kio i*skiriamas kenksmingas meiagas. 3ianien egzistuoja vi pagrinin$s
problemosE
Kaip pa*alinti atliekas kurios pastoviai kaupiasi.
Kaip pa*alinti toksi*kus junginius kurie per pastaruosius kelet e*imtme-i! stipriai
kaupiasi *iuk*lynuose, irvoemyje, bei vanenyje.
45() m. su mikroorganizm! egrauojan-i! sintetines meiagas %herbiciai, pesticiai,
tirpiklius ir kitus organinius junginius& atraimu suprasta ka *ie mikroorganizmai gali
b"ti nauingi egrauojant *iuos pavojingus cheminius junginius iki nepavojing!
jungini!.
;epaisant tai ka nat"ral"s mikroorganizmai gali egrauoti vis eil2 sintetini!
kenksming! jungini! ta-iau galimas tik ribotas mikroorganizm! panauojimas, to$l kaE
4. /ienas mikroorganizmas negali egrauoti vis! chemini! jungini!P
G. :iel$s organini! jungini! koncentracijos gali slopinti egrauojan-i!
mikroorganizm! veikimP
6. :augumas uter*t! viet! uter*tos #vairi! chemini! jungini! mi*iniu, ir
mikroorganizmai negali egrauoti vis! komponent!, be to organizmas egrauojantis
vien jungin# gali b"ti nuslopintas kit! jungini!P
,. Taip pat junginiai irvoemyje ar nuos$ose gali b"ti neprieinami ar menkai prieinami
bioegrauojantiems mikroorganizmamsP
0. 1ikrobiologin$ organini! jungini! egraacija yra l$ta.
To$l stengiamasi pakeisti esamus mikroorganizmus taip ka jie kuo e.ektyviau ir
grei-iau neutralizuot! *iuos organinius sintetinius junginius.
Biologinis kuro gavimas.
Etanolio gamya i( iomass
Alkoholio proukcija .ermentuojant cukr! ir krakmol, tai nuo seno nusistov$j2s b"as,
kuris anai laikomas ka tai pirmasis mogaus nauotas mikrobiologinis procesas.
9
(
=
4G
N
(
G9=
6
9=
G
N= M G9N
G
'ramonin$ alkoholio gamyba, .ermentacija, labai priklauso nuo sukaupt! ini! apie alaus
gamyb. 3iuo metu, pramonin$ alkoholio gamyba augumoje atveju tai yra grynai
sintetinis %t.y. nemikrobiologinis& procesas, kai etanolis gaunamas hiratuojant etilen.
Kaangi etanolio kaip kuro naua ai*ki, kaangi jo egimo metu nei*siskiria toksini!
proukt! toki! kaip angles monoksias, o taip pat lyginant su #prastu kuru maiau
ter*iama aplinka.
Ktanol# gaminti cheminiu b"u yra vis ar yra pigiau negu nauojant .ermentacij.
Ta-iau besivystant biotechnologijai manoma ka alkoholis ateityje gali tapti viena i*
pagrinini! kuro r"*i!.
;eseniai buvo susiom$ta moi.ikuoto raps! aliejaus panauojimu kaip yzelinio kuro
pakaitaluE iodyzeliu. 3is prouktas gaunamas reakcijos tarp aliejaus ir metanolio
alyvaujant katalizatoriams %tokiems kaip natrio hiroksias&, 0)
o
9 temperat"roje,
gaunamas esteris ir glicerolis.
64
A. Kanopka-Biotechnologija
<apsu aliejus M 1etanolis :iesteris M Alicerolis
%4 tona& %).4 tonos& %4 tona& %).4 tonos&
Alicerolis atskiriamas, o bioyzelis gryninamas ir nauojamas kaip kuras.
D*grynintas bioyzelis turi prakti*kai tokias pa-ias .izines ir chemines savybes kokias turi
yzelinis ir krosninis kuras. 'agrininiai bioyzelio privalumai lyginant su yzeliniu kuru
yraE
- energetiniai resursai yra panauojami ymiai e.ektyviau, ir j! e.ektyvumas, gerinant
raps! kult"ras, ar i$sP
- bioizelinis kuras yra netoksi*kas, augiau kaip 5I S bioegrauojamas, to$l aplinka
ter*iama 6 - 0 kartus maiauP
- tai atsinaujinanti kuro r"*is %na.ta - neatsinaujinanti kuro r"*is&.
5etano gamya i( iomases.
1etanas tai ujos nauojamos mechaninei, elektros bei *ilumos energijai gauti.
:abartiniu metu, vietiniams bei pramoniniams tikslams, metanas pla-iai nauojamas kaip
kuro *altinis. Taip pat i* metano gali b"ti gaunamas metanolis, kuris gali b"ti nauojamas
viaus egimo varikliuose.
1ikrobiologinis metano gamybos metoas yra pakankamai su$tingas, kuriam reikalingi
anaerobini! mikroorganizm! mi*iniai.
D* principo, anaerobin$ kompleksini! organini! jungini! mi*ini! .ermentacija vyksta
trimis biochemin$mis .az$mis, i* kuri! kiekviena reikalauja speci.ini! mikrobiologini!
parametr!. 'rain$je staijoje reikalingas kompleksini! molekuli! %celiulioz$s, riebal!
bei baltym!& suaran-i! aliavin2 terp2 i*tirpinimas. Aauti i*tirp2 maos molekulin$s
mas$s junginiai kitoje staijoje yra paver-iami organin$mis r"g*timis. Aalutin$je
mikrobiologin$je staijoje *ios r"g*tys %pagrine acto& speci.i*kai, metanogenini!
bakterij!, suskalomos susiarant metanui ir 9N
G
.
K.ektyviausia ir su$tingiausia nat"rali metan proukuojanti sistema tai iysis
atrajojan-i! galvij! skranis.
Ta-iau *iuo metu yra aug problem!, kurias prie* norint metano gamybos technologij
panauoti prakti*kai reikia i*spr2sti. 3iuo metu organini! atliek! surinkimas, tik
metanogenez$s procesui, yra brangus, o tokiu b"u i*gaunamos metano proukcijos
i*eigos yra maos, to$l vis *# proces reikia ar optimizuoti.
1etanas taip pat yra gaunamas .ermentuojant gyvuli! m$*l susiarant ujiniams
prouktams, vainamiems iodujomis. Bioujos tai egus uj! mi*inys suarytas i* 0) -
I)S metano, 40 - ,0S 9N
G
, 0S vanens bei labai neieli! kieki! kitoki! uj! mi*inio.
:iiausias biouj! gamintojas pasaulyje *iuo metu yra Kinija %? mln. biouj! vienet!,
tai ekvivalenti*ka GG mln. t. anglies&.
6andenilis.
1anoma ka ateityje kaip kur, bus galima panauoti vanenil#. /anenilis gali b"ti
gaminamas .otosintezuojan-i! bakterij! pagalba, vykant vanens bio.otoliz2 arba
.ermentacijoje. Taip pat #manoma gauti vanenil# i* gliukoz$s, panauojus atitinkamas
bakterijas, ta-iau *iuo atveju vanenilio proukcija labai jau menka.
6G
A. Kanopka-Biotechnologija
"erment# gam!bos technologija.
8erment!gamybos technologija apima j!, i*skyrim, gryninim, panauojim tirpioje
.ormoje, ar juos imobilizuojant ant netirpi! pavir*i! bei panauojant juos visoje eil$je
sistem!. 8erment! technologija, yra tampriai susijusi su gen! ininerija.
1ikroorganizm!, kaip .erment! *altinio, panauojimas vyst$si $l keli! prieas-i!E
4&. 'aprastai prouktas turi auk*t speci.in# aktyvum^sausos meiagos svoriuiP
G&. ;$ra aliav! sezoni*kumoP
6&. 1ikroorganizmuose aptinkamas platus .erment! turin-i! praktin2 vert2
spektras.
"erment# (ritaik!mas
3iuo metu .erment! kiekis gaminamas pramoniniu b"u greitai i$ja.
<ekombinantin$s :;< technologijos leio perne*ti nauing! .erment! genus i* vieno
organizmo # kit. Kai nauingas pramoniniam poreikiui .ermentas ienti.ikuojamas, jo
genas paprastai perklonuojamas # patogesn# %geriau augant#, galint# proukuoti augiau
.ermento ir t.t.& mikroorganizm toliau jau vykant *io mikroorganizmo pramonin2
kultivacij. ;auojant *# b" gaunami auk*tos kokyb$s ir *varumo .ermentai.
/mo*ilizuoti 'ermentai.
8erment! panauojimas tirpioje .ormoje gali b"ti traktuojamas kaip .ermento *vaistymas,
to$l ka po reakcijos .ermentas negali b"ti i*gautas i* #vykusios reakcijos ir panauotas
sekan-ioje reakcijoje. ;auja svarbi .erment! technologijos sritis susijusi su .erment!
imobilizavimu ant netirpi! polimer!, toki! kaip membranos ir alel$s veikian-ios kaip
.ermentinio aktyvumo palaikytojai ar ne*$jai. 'ritvirtinti prie kiet! pavir*i! %ar
imobilizuoti juose& .ermentai gali b"ti panauoti katalitiniame procese ir v$l i*gauti i*
reakcijos mi*inio ir panauojami v$l ir v$l, tai stipriai paiina proceso ekonomi*kumP
3ios slygos lyg ir sugr#imas # nat"rali .erment! b"sen gyvame organizme. Kai kurie
.ermentai, nelstelin$je sistemoje temperat"ros poveikyje yra nestabil"s, ta-iau juos
pritvirtinus prie inertinio polimerinio pavir*iaus tampa stabiliais.
Bakterij! lstel$s gali b"ti imobilizuotos poliakrilamiini! aleli! %rutuliuku, lsteli!&
viuje, ir panauotos pla-iam katalitini! .unkcij! atlikimui.
:abartiniu metu imobilizuoti .ermentai pramoniniu b"u panauojami L-amino r"g*-i!,
organini! r"g*-i! ir .ruktoz$s sirupo gamyboje.
;auja imobilizuot! .erment! panauojimo kryptis yra .ermentiniai elektroai. Tai naujo
tipo etektoriai ar biosensoriai sukurti nauoti tokius substratus kaip urea %*lapalas&,
amino r"g*tys, gliukoz$, alkoholis bei pieno r"g*tis. Klektroas suarytas i*
elektrochemini! sensori! i*$styt! betarpi*kai arti plonos pralaiios membranos,
galin-ios speci.i*kai reaguoti su substratais. 1embranoje #taisyti .ermentai, priklausomai
nuo #vykstan-ios .ermentin$s reakcijos, gaminasi N
G
, vanenilio jonai, amonio jonai,
9N
G
, ar kitos maos molekules, kuri! kiekis priklauso nuo substrato koncentracijos.
Biologinis komponentas biosensoriuje, aniausiai yra .ermentin$ ar augia.ermentin$
sistema, ta-iau gali b"ti ir antik"nis, organel$, mikrobin$ lstel$, ar auinio gabal$lis.
66
A. Kanopka-Biotechnologija
'ienos lstels balt!mai.
'agrinin$ problema su kuria susiurs pasaulis tai spartus moni! kiekio i$jimas, ypa-
besivystan-iose *alyse. :abar em$je gyvena 0.? mlr. moni!. Kasmet *is skai-ius
pai$ja apytikriai 5? mln. ir kaip manoma G)0) metais, jeigu *is augimas nebus
kontroliuojamas, em$je gyvens vir* 4) mlr. moni!. Fem$s "kis, toks koks jis yra *iuo
metu, nebus paj$gus apr"pinti tok# kiek# moni! maistu - t.y. nepatenkins maistini!
baltym! poreikio.
Ta-iau visose em$s "kio *akose prouktyvumas i$ja. Biotechnologijos atraimai ar
labiau spartina *i tenencij.
1ikroorganizm! biomas$ gali pasiym$ti gana auk*tomis maistin$mis savyb$mis. 3i
maistin2 reik*m2 apsprenia baltymai suarantys ymi al# lsteli! sausos meiagos.
+au e*imtme-iais aktyviai iskutuojama ir tyrin$jamos galimyb$s paiinant
mikroorganizm! panauojim benrame pasaulio baltym! gamybos balanse. Toks
baltym! panauojimas galimas tiek netiesiogine prasme %#veant baltyminius prieus #
gyvuli! pa*arus, tuo pa-iu sumainant toki! proukt! kaip sojos ir uv! miltai
sunauojim&, tiek tiesiogine prasme %gaunant maisto prouktus mon$ms&.
Ka atskirti toki! proukt! tip nuo auk*tesni! augials-i! gyv"n! ar augalini!
baltym!, mikrobiniams baltymams nauojamas specialus pavainimas vienos l&stels
altymas %arba @9' single cell proteinP /LB&. Tokia gamyba yra paremta
mikroorganizm! auginimu ieliais kiekiais, kurie po to perirbami # maisto prouktus.
/ienos lstel$s baltym! gamyboje paprastai panauojamas .ermentacijos, skystose
terp$se, procesas.
"armaciniai ir bio*armaciniai (re(aratai.
'agrininai .armaciniai preparatai *iuo metu tai sintetiniai junginiai gaunami chemin$s
sintez$s b"u arba chemi*kai moi.ikuojant molekules gautas i* biologini! *altini!.
Bio.armaciniai preparatai tai rekombinantiniai baltymai, vakcinos ir monokloniniai
antik"niai %terapiniams tikslams&.
$nti*iotikai.
45GI m. AleYaner 8leming paarytas atraimas ka, grybas vainamas $enicillium
notatum gamina jungin# kuris gali inaktyvuoti plat! spektr bakterij!, tuo pa-iu
neveikiant %*eimininko& organizmo lsteli!.
;auojant antibiotikus tapo #manoma i*gyyti tokias ligas kaip cholera, pneumonij,
tuberkulioz2 ir kt.
D* *iuo metu ,))) atrast! antibiotik! tik apie 0) rao praktin# pritaikym. Antibiotikai
veikiantys plat! spektr bakterij! vainami plataus spektro, %chloram.enikolis ir
tetraciklinas&. Tuo tarpu streptomicinas ir penicilinas yra siauro spektro antibiotikai,
veikiantys tik kelias bakterij! r"*is.
3iuo metu nerim kelia .aktas ka augelis bakterij! palaipsniui evoliucionuoamos
tampa atsparios antibiotikams ir #gytas atsparumas peruoamas kitoms bakterij! r"*ims
%'vz.E atspari penicilinui baterij! sukelian-i! venerin2 lig - gonor$j jau rasta 45-oje
6,
A. Kanopka-Biotechnologija
*ali!&. Atsparum antibiotikams bakterijose lemia bakterijose lokalizuota plazmiin$
:;<, kuri taip pat gali b"ti peruoama tarp organizm!.
1akcinos.
@eniai jau inomas vakcin! sugeb$jimas stimuliuoti antik"n! susiarym organizme.
/akcinos tai negyv! arba susilpnint! mikroorganizm! preparatai, galintys stimuliuoti
mogaus ar gyv"n! imunin2 sistem nesukeliant in.ekcijos. Tuo b"u organizmui
suteikiama apsauga.
H*virk*-iant ar i*geriant vakcin inukuojama %sukeliama& antik"n! prie* ligos suk$l$j
gamyba, to$l sekan-i! in.ekcij! metu in.ekcinis agentas yra inaktyvuojamas, jo
auginimasis sustabomas ir liga nepasirei*kia.
/akcinacija monija s$kmingai #veik$ tokias ligas kaip tuberkulioz$ %nors atskiri jos
protr"kiai pasirei*kia ir *iomis ienomis&, raupai, cholera, tymai, poliomielitas. Ta-iau ir
*ianien vakcin! prie* augel# moni! lig! ar n$ra.
Monokloniniai antik0niai.
Kai svetima meiaga %mikroorganizmas& patenka # gyv"no organizm, sukeliama visa
eil$ reakcij! kuri!, laimingoje pabaigoje, svetimk"nis inaktyvuojamas %nukenksminamas&
ir pa*alinamas i* organizmo. Ayv"nuose atmintis apie molekulin# atsak svetimk"niams,
gali i*likti ilgam laikui, ir tai suteikia alin# imunitet prie* *# mikroorganizm! r"*#.
$a(alin molekul) sukelianti neutralizuojant gyv%no organizmo atsak& 7 antik%ni'
sintez8) vadinama antigenu.
Antigenai pagrine tai baltymai, ar baltyminiai kompleksai su kitais junginiais. Antik"nai
yra sintetinami speciali! lsteli!. Hvairios gyv"n! r"*ys, tame tarpe ir mones, gali
gaminti ne#tik$tin skai-i! #vairi! antik"n!. Finuoliai gamina antik"nus prie* visk, kas
organizmo pripa#stama kaip svetimk"nis. Dmuninei gyv"no sistemai atpainus
svetimk"n#, prasiea atitinkam! antik"n! sintez$. Kraujas turi augyb2 antik"ni! kurie
buvo sintetinti prie* pa*alines molekules praeityje. Antik"niai i*skirti i* tokio kraujo
vainami polikloniniais, to$l ka jie gauti i* ne vienos, o i* augelio lsteli! tip!.
D*skyrus antik"nius sintetinamus vieno %grietai apibr$to lsteli! tipo& lsteli! tipo jie
vainami monoklonininiais.
1onokloniniai antik"niai panauojami iagnostin$se sistemose, histologijoje, klinikin$je
chemijoje, mikrobiologijoje ir kt. srityse. :iagnoz$ nauojant monokloninius antik"nius
nustatoma augeliui lig!, #skaitant moni! venerines ligas, hepatit B, kai kurias
bakterines ligas, taip pat jie nauojami n$*tumo testuose.
/nsulinas.
'raioje buvo nauojamas insulinas i*skirtas i* kiauli! bei raguo-i!. /artojant tok#
insulin pasireik*avo pa*aliniai e.ektai. 3iuo metu inoma, ka pa*alinius e.ektus, kurie
pasireik*avo ilgai vartojant i* toki! aliav! i*skirt insulin, sukelavo priemai*in$s
meiagos kuri! tur$jo i*skirti i* gyv"n! insulino preparatai.
<ekombinantinis mogaus insulinas %i*grynintas i* bakterij! turin-i! #klonuot %#terpt&
mogaus insulino gen& neturi *i! priemai*!.
/nter'eronai.
60
A. Kanopka-Biotechnologija
450? m. angl! mokslininkai, gyv"nuose, aptiko meiag veikian-i prie* virusus, t.y.
paaran-i lsteles atsparias virusams. :augumas stuburini! gyv"n! gamina *i
meiag, kuri inoma kaip inter.eronai.
Fmogaus inter.eronai tai glikoproteinai. +ie vaiina svarbi rol2 kontroliuojant #vairi!
tip! virus! in.ekcijas, #skaitant ir per*alima, taip pat #takoja veini! lsteli! vystimsi.
Hvairiose gyv"n! r"*yse inter.eronai yra speci.i*kiE pel$s inter.eronas veiks tik pel$s
lsteles ir neveiks mogaus lsteli! ir atvirk*-iai. @kirtingi auiniai gamina skirtingus
inter.eronus.
Dnter.eronai taip pat nauojami prie*v$in$je terapijoje, nes jie veikia slopinant v$ini!
lsteli! augim, bei stimuliuojant nat"ral! k"no imunitet prie* v$ines lsteles.
1en# tera(ija.
Aen! terapija pagrine susijusi su nauj! biotechnologijos technik! atsiraimu.
Terapijoje atsirana galimyb$ i*jungti e.ektyvius %paeistus& genus pakei-iant juos
sveiko geno kopijomis.
Tai ligos gyymas perne*ant ir ekspresuojant genetin2 meiag paciento lstel$se, tikslu
atstatyti normalia lsteli! .unkcij.
@kiriamaE gemalini' %kiau*ialstes ar tos lsteles kurios gamina sperm& l&steli' gen'
terapij& ir somatini' %kitos k"no lsteles, raumen!, kaul!, nerv! ir t.t.& l&steli' gen'
terapija.
Aemalini! lsteli! gen! terapijoje aromi pakeitimai tiesiogiai veika inivio
genetin2 meiag ir gali tur$ti #takos palikuonims.
Arietai kontroliuojama ka gen! terapijos e.ektai nepasireik*t! palikuonims. 3iuo metu
pagrininis gen! terapijos $mesys skiriamas vieno geno e.ekt! %mutacij!&
atitaisymams %cistin$ .ibroz$, heamo.ilijos atvejais&. :augelis genetini! lig! yra
negyomos, taigi gen! terapijos i*vystymas gali suteikti mon$ms sergantiems *iomis
ligomis vilt# pasveikti.
2ransgeniniai g!v-nai.
Dki *i! ien! selekcinis veisli! i*veimas buvo vienintelis b"as pagerinant vietines
gyv"n! savybes. @$kmingas gen! perne*imas # inuoli! lsteles perne*ant lstel$s
branuol# # lstel2 su pa*alintu branuoliu, leio sukurti geneti*kai ienti*kus gyv"nus.
3i! arb! pasekm$je atsirao galimyb$ perne*ti genus ar visa gen! grup2 #terpiant juos #
auk*tesni!j! organizm! chromosomin2 :;<.
Transgenin$ technologija i*vystyta ir i*tobulinta kaip moelines sistemas panauojant
peles.
;uo 45I)-uju *imtai #vairi! gen! #terpta # #vairias peli! r"*is. <ezultatai i* toki! banym!
pagilino inias apie gen! rai*kos reguliacij, augli! %v$io& vystimsi, imunologij, ir
kitus pagrininius biologinius procesus.
Transgenin$s pel$s nauojamos tikrinant pramoniniu b"u gaminamus vaistinius
preparatus, nauojamus moni! lig! gyymui, o taip pat konstruojant transgenines
gyv"n! r"*is %veisles& kurios nauojamos kaip moelin$s sistemos tyrin$jant #vairias
mogaus ligas. 3i! gyv"n!, kaip moelini! sistem!, panauojimas mogaus ligoms
tyrin$ti #galina greit lig! iagnozavimo sistem! vystimsi. Ta-iau, pel$ - tai ne mogus,
netgi #vertinant tai ka yra inuolis, in.ormacija gauta i* toki! tyrin$jim! nevisaa
galima pritaikyti praktikoje t.y. panauoti moni! reikm$ms.
6(
A. Kanopka-Biotechnologija
'anauojant peles buvo gauta vertingos in.ormacijos apie Alzheimer %Alzhaimerio& lig
%sukelia smegen! veiklos sutrikim, sutrinka atmintis, abstraktus mastymas ir t.t.&, artrit,
raumen! istro.ija, augli! vystimsi, ligas susijusias su nerv! lsteli! irimu,
enokrinologinius sutrikimus, koronarines ligas ir augel# kit!.
6?
A. Kanopka-Biotechnologija
34B54256N646 D4B46
3aboratorinis darbas Nr. 7
Balt!m# ir nukleino r-g&8i# koncentracijos nustat!mas tir(aluose.
:arbuose susijusiuose su baltymais anai reikia atlikti arbus apsprenian-ius tolesn2
arb! sek, o tam aniausiai reikia inoti baltym! gaut! ankstesn$se staijose
koncentracij.
+. S!ektro'otometrinis *altymo koncentracijos nustatymo metodas.
Baltymo koncentracijos nustatymas matuojant absorbcija GI) nm %A
GI)
& paremtas
aromatini! %tripto.ano, tirozino ir maesne alimi .enilalanino& amino r"g*-i! liku-i!
sugeb$jimu absorbuoti *vies R/ spektro alyje. 3is metoas yra greitas, paprastas,
ta-iau turi nemaai trukum!E
1etoas n$ra pakankamai jautrus %),)0 O 0 mg baltymo&, to$l matuojant *iuo
metou reikalingi iesni meiagos kiekiai.
Baltymas savo su$tyje turi tur$ti aromatini! amino r"g*-i! liku-i!.
:$l nevienoo aromatini! r"g*-i! liku-i! baltymuose kiekio, metoas n$ra
pakankamai tikslus.
:augelis bu.erini! meiag! ir kit! reagent! gali trukyti tiksliems A
GI)
matavimams.
Absorbcijos reik*m$s J G neturi b"ti nauojamos, o vietoj to m$ginys turi b"ti
praskieiamas iki reik*mi! e G.
Baltym! koncentracijos nustatymo spektras persiengia su nukleino r"g*-i!
koncentracijos nustatymo spektru, to$l matuojant baltym! koncentracijas tirpaluose
turin-iuose nukleino r"g*-i! priemai*! galimos gana ieles paklaios.
Darbo eiga0
4. Kalibracin$s kreiv$s gavimasE
'aimamaE ), 0), 4)), 40), G)), 6)), ,)), 0)) fg baltymo.
@u =
G
N praskieiama iki 4 ml %galutinio t"rio&, ir matuojama absorbcija esant
bangos ilgiui GI) nm %A
GI)
&.
D* gaut! uomen! nusibraioma kalibracin$ kreiv$E A
GI)
priklausomyb$ nuo
baltymo kiekio.
G. Lygiai taip pat nustatoma baltymo koncentracija neinomame m$ginyje, ir pagal
kalibracin2 kreiv2 nustatoma baltymo koncentracija pateiktame m$ginyje.
-. )alorimetrinis *altym4 koncentracijos nustatymo metodas.
/ienas i* toki! meto! yra taip vainamas Bra.oro metoas. Tai spalvin$ reakcija,
paremta baltym! sugeb$jimu susiri*ti su Kumasi m$lio au %9oomassie brilliant blue
<G0)&. 1etoas lyginant su spektro.otometriniu metou yra ymiai jautresnis %),))0 O
),)0 mg baltymo&.
Ta-iau ir *is metoas turi tr"kum!E
:augelis meiag! %glicerinas, etergentai, G-merkaptoetanolis, acto r"g*tis,
amonio sul.atas %;=
,
&
G
@N
,,
Tris, bei kai kurie *arminiai bu.eriai truko tiksliam
6I
A. Kanopka-Biotechnologija
koncentracijos nustatymui. 3i! problem! galima i*vengti nauojant tinkamas kontrolines
reakcijas.
Darbo eiga0
4. Kalibracin$s kreiv$s gavimasE
a& 'aimamaE ), G, ,, (, I, 4), 4G, 4,, 4(, 4I, G) fg baltymo.
b& @u ),40 1 ;a9l tirpalu praskieiama iki galutinio 4)) gl t"rio.
c& 'rieama 4 ml Bra.oro reagento %Kumasi m$lis etanolyje, M .os.oro
r"g*tis&.
& 'alaukiama G min. kambario temperat"roje.
e& 1atuojama A
050
.
D* gaut! uomen! nusibraioma kalibracin$ kreiv$E A
050
priklausomyb$ nuo baltymo
kiekio.
G. Lygiai taip pat nustatoma baltymo koncentracija neinomame m$ginyje, ir pagal
kalibracin2 kreiv2 nustatoma baltymo koncentracija pateiktame m$ginyje.
.. S!ektro'otometrinis DNR ar RNR koncentracijos nustatymas.
:;< ar <;< koncentracijos nustatymui matuojama absorbcija G() ir GI) nm bangos
ilgiuose. 1atavimas esant bangos ilgiui G() nm leiia apskai-iuoti nukleino r"g*ties
koncentracij m$ginyje. 4 optinis vienetas apytiksliai yra lygus 0) gg^ml vigran$s
:;<, ,) gg^ml viengran$s :;< ar <;<, G) gg^ml oligonukleoti!. @antykis tarp
matavimo yi! esant bangos G() ir GI) nm %A
G()
^A
GI)
& leiia spr2sti apie nukleino
r"g*ties turimos m$ginyje *varum.
;ustatoma pateikto m$ginio absorbcija esant bangos ilgiui G() ir GI) nm.
'askai-iuojama :;< koncentracija pateiktame m$ginyje.
3aboratorinis darbas Nr. 9
DN skald!mas restrikcijos endonukleazmis.
DNR skaldymas restrikcijos endonukleazmis.
:;< .ragment! klonavimui reikalingas klonavimo vektorius, ir reikiamas :;<
.ragmentas turi buti perskeltas # iskretinius ir atsikartojan-ius .ragmentus. D*skirtos
chromosomin$s :;< praleiimas ieliu spauimu pro plona %*virk*to& aat ar :;<
paveikimas ultragarsu suskalo :;< # ).6 O 0 kb. por! .ragmentus. Ta-iau *ie .ragmentai
yra suaryti atsitiktinai tai rei*kia ka kiekvien kart bus gaunami skirtingi .ragmentai.
@u bakterini! .erment! skalan-i! :;< molekul2 speci.in$se vietose atraimu :;<
klonavimas tapo #manomas. 3ie .ermentai vainami DD tipo restrikcijos enonukleaz$mis.
Dki 45?) m. vieno geno i*skyrimas atro$ ne#manomas alykas, to$l ka kiekvienas
baltymas lstel$s :;< i*rai*koje yra tik kaip neiel$ :;< sekos alis.
'roblemos sprenimas i*sispren$ su .erment! vainam! restrikcijos enonukleaz$mis
atraimu. 3ie .ermentai skelia vigran2 :;< sek grietai apibr$tose vietose.
@kirtingose bakterij! r"*yse ranamos skirtingos restrikcijos nukleaz$s, t.y. kerpan-ios
:;< skirtingose vietose.
65
A. Kanopka-Biotechnologija
Elektro'orez agaroziniuose geliuose.
Agaroz$ meiaga i*skiriama i* j"ros umbli!. Tai linijinis polisacharias. :;<
elektro.orez$ agaroz$s gelyje - stanartinis metoas nauojamas :;< .ragment!
valymui ir ienti.ikacijai. ;auojant *# meto galima greitai ir e.ektyviai atskirti
norimus :;< .ragmentus i* mi*inio, kurie neatsiskiria nauojant kitus metous.
;auojant .luorescuojant# ir interkaliuojant# a O etiium bromi, :;< galima aptikti
%steb$ti& tiesiog gelyje. @tebint gel# ultravioletin$je spektro alyje galima aptikti net 4 ng.
:;<.
:;< migracijos agaroz$s geliuose greitis elektro.orez$je nusakomas 0 pagrininiais
parametraisE
4. :;< molekuli! yiu. :vigran$s :;< molekul$s gelyje jua grei-iu, atvirk*-iai
proporcingu j! molekulin$s mas$s e*imtainiam logaritmui.
G. Agaroz$s koncentracija. :uoto ilgio :;< .ragmentai skirtingos koncentracijos
agaroz$s gelyje jua skirtingais grei-iais.
6. :;< kon.ormacija. :;< turinti vieno molekulin# svor# bet skirting kon.ormacij,
agaroz$s gelyje jua skirtingu grei-iu. %linijin$, iein$ ir superspiral$&.
,. Klektros lauko #tampa. Ksant maai #tampai, linijin$s :;< .ragment! ju$jimas
agaroz$s gelyje yra proporcingas #tampai. Klektrinio lauko #tampai i$jant,
ielio molekulinio svorio :;< .ragment! ju$jimas i.erenci*kai kinta.
0. Bazi! su$tis ir temperat"ra. @kirtingai nuo elektro.orez$s poliakrilamiiniuose
geliuose :;< mobilumas agaroz$s geliuose maai priklauso nuo j
suaran-i! bazi! su$ties. Agaroziniuose geliuose :;< .ragment! jurumas ,
O 6)
o
9 ribose prakti*kai nekinta.
Darbo eiga0
:arbe nauojama lamba .ago :;<. Tai linijin$ ,I0)G b.p. ilgio :;< molekul$.
'asiskai-iavus reakcijos komponent! reikiamus # reakcij #$ti t"rius ir juos su$jus #
m$gintuv$l# vykoma inkubacija G valanas 6?
o
9.
'asibaigus inkubacijai, paimamas m$ginys 0gl # kur# #eama G gl ao ir vykoma
elektro.orez$ agaroz$s gelyje, TAK %tris-acetatiniame& bu.eryje, esant 4)) / #tampai. 'o
elektro.orez$s gelis aomas etiium bromio tirpale ir analizuojamas ultravioletin$je
spektro alyje. H atskir takel# #eama .ermentais neveikta :;<.
3aboratorinis darbas Nr. :
Polimerazs grandinin reakcija.
'9< %polimeraz$s ciklin$ reakcija - '9<, arba ar vainama polimeraz$s graninin$
reakcija - 'A<,& tai e.ektyvi proce"ra gaunant ielius kiekius speci.ines :;< sekos in
vitro. '9< metou :;< kiekis paauginamas milijonus kart!.
'agrininiai reikalavimai '9<E
4. G sintetiniai oligonukleotiai %pramenys&, komplementar"s norimos
paauginti :;< sritims.
G. :;< seka i*si$s-iusi tarp pasirinkt! pramen! poros.
6. Termostabilus .ermentas :;< polimeraz$.
,)
A. Kanopka-Biotechnologija
,. , ;T' %ezoksiribonukleoti tri.os.atai [AT'P 9T'P TT'P AT'\&.
Tipinis ampli.ikacijos procesas apima eil2 :;< ampli.ikacijos cikl!.
Kiekvienas ciklas susiea i* 6 staij!E
4. :enat"racija. Termin$ :;< m$ginio enat"racija pakeliant reakcijos temperat"r iki
50
o
9.
G. <enat"racija. Temperat"ra m$gintuv$lyje paeminama iki 0) O ()
o
9. 'ramuo,
pagal komplimentari*kumo princip, prisijungia prie :;<.
6. @intez$. Temperat"ra pakeliama iki optimalios termostabiliai :;< polimerazei
veikimo temperat"ros %?G
o
9&. :;< sintez$ inicijuojama kiekvieno pramens
6Q-N= gale.
'9< reakcija reikalauja labai ma! prain$s meiagos kieki!.
Darbo eiga0
:arbui nauojama i*skirta i* b .ago :;< %,I.0)G b.p.& ir u pramenysE
H m$gintuv$l# #eamaE
'asiskai-iavus '9< reakcijos komponent! reikiamus # reakcij #$ti t"rius ir juos su$jus
# m$gintuv$l#, tam ka tirpalas negaruot!, ant m$ginio vir*aus usluoksniuojama
mineralin$ alyva. Heama # '9< aparat ir vykomi G0 ciklai, sekan-iomis slygomisE
4. 50
o
9 O G min.
G. 50
o
9 O 4 min.
6. V
o
9 O G min.
,. ?G
o
9 O G min.
GP 6P ,P staijos pakartojamos G0 kartus.
%V
o
9 - reakcijoje nauojam! pramen! hibriizacijos temperat"ta&
'o '9< reakcijos vykoma :;< elektro.orez$ 4.G S %h^v& agaroz$s gelyje, TAK %tris-
acetatiniame& bu.eryje, esant 4))/ #tampai.
H ? gl i* benro '9< reakcijos mi*inio paimto m$ginio #eama 4 gl ao ir une*amas #
agarozinio gelio *ulin$l#. Klektro.orez$ vykoma esant 40) / #tampai, apie ,0 min.
'o elektro.orez$s gelis aomas etiium bromio tirpale ir analizuojamas ultravioletin$je
spektro alyje.
3aboratorinis darbas Nr. ;
Plazmidins DN ter(imas E.coli lstel<.
)om!etentins l;stels %lstel$s turin-ios paiinto pralaiumo sienel2&. E.coli lstel$s
auginamos iki reikiamo optinio tankio. Lstel$s paveikiamos 9a9l
G
tirpalu. 9a9l
G
poveikyje lsteli! i*orin$ membrana%sienel$& tampa labai poringa ir lengvai praleiia
iesnes molekules i* i*or$s. :;< patekimo # lstel2 e.ektyvumui paiinti kartu
nauojamas taip vainamas Blsteli! temperat"rinis *okasC kai lstel$s trumpam
patalpinamos # auk*tesn$s temperat"ros aplink po to jas grinant # joms #prast aplink.
Darbo eiga0
4. 'aruo*tos kompetentin$s lstel$s at*ilomos %m$gintuv$l# su lstel$mis laikant
leo vonioje&.
,4
A. Kanopka-Biotechnologija
G. 'rie 0) gl kompetentini! lsteli! prieama 0 gl :;< tirpalo.
6. 1$gintuv$lis su :;< - lsteli! mi*iniu 6) min. inkubuojamas leuose.
,. 1$gintuv$lis perne*amas # ,G
o
9 vanens voni ir inkubuojamas G min.
0. 'o to m$gintuv$lis grinamas # leo voni.
(. H m$gintuv$l# #eama 4 ml terp$s ir lstel$s inkubuojamos vanens vonioje 6?
o
9
vien valan.
?. 1$gintuv$lis centri.uguojamas, iioji alis terp$s nupilama.
I. Lstel$s suspenuojamos likusiame terp$s t"ryje %i G)) gl&.
5. @uspenuotos lstel$s une*amos ant 'etri l$k*tel$s su terpe turin-ia antibiotik! ir
gerai paskirstomos.
4). L$k*tel$s apver-iamos, patalpinamos # 6?
o
9 termostat ir laikomos 4( valan!.
D*augusios ant 'etri l$k*tl$s E.coli kolonijos analizuojamos '9< reakcijos pagalba.
3aboratorinis darbas Nr. ;
Balt!m# elektro*orez denat-ruojan8iomis sl!gomis.
Klektro.orez$ nauojama baltym! kompleks! atskyrimui, tikslu #vertinti j! su$t# bei
baltymo homogeni*kum. +i taip pat gali b"ti panauojama kaip viena i* baltym! valymo
staij!.
'oliakrilamiiniame gelyje, elektros lauke, baltymai priklausomai nuo gelio por! yio,
migruoja per gelio matricos poras. 'or! yis, kintant akrilamio koncentracijai, kinta
%i$jant poliakrilamio koncentracijai O ma$ja&. Aelio por! yis bei baltymo kr"vis
apsprenia baltymo migracijos greit#.
'oliakrilamiinis gelis susiaro i* akrilamio monomer!, susiuvus jo granines
;>,;>-metilenbisakrilamiu. 'olimerizacijos reakcija inicijuojama amonio persul.atu ir
reakcijos greitintoju TK1K: %;,;,;>,;>-tetrametiletileneiaminas&, katalizuojan-iu
laisv!j! raikal! i* amonio persul.ato susiarym. Kaangi eguonis inhibuoja
polimerizacijos proces, gelio tirpalo eaeracija pagreitina polimerizacijos proces.
'la-iausiai yra nauojama elektro.orez$ netolyginiuose geliuose. Kaangi elektro.orez$s
netolyginiuose geliuose metu vyksta ne tik baltym! i*skirstymas %.rakcionavimas&, bet ir
koncentravimas, to$l tiriami m$giniai gali b"ti labiau praskiesti.
;etolyginiuose geliuose m$ginys, vis! pirma, praeina per koncentruojant# gel#, turint#
ieles poras. Koncentruojan-io gelio bu.eris turi chlorio jonus %vainamus
pirmaujan-iais jonais&, kuri! elektro.oretinis jurumas yra iesnis u baltym! jurum.
Klektro.orez$s bu.eris turi glicino jonus %vainamus ne*amaisiais jonais&, kuri!
elektro.oretinis jurumas yra maesnis u baltym! jurum. Tai uoa, ka grei-iau
migruojantys jonai po sav2s palieka emesnio laiumo zon, susiaran-i tarp greitai
migruojan-i! chlorio jon! ir l$-iau migruojan-i! baltym!. <ezultate, susiar2s iesnis
#tampos graientas leiia baltymams ju$ti grei-iau ir susikoncentruoti *ioje zonoje.
'o koncentruojan-io gelio baltymai patenka # .rakcionuojant# gel#- tai gelis, kuriame
baltymai praea i*siskirstyti pagal savo ne*am kr"v#. 8rakcionuojantis gelis lyginant su
koncentruojan-iu geliu turi maesnius por! yius, iesn2 rusk! koncentracij ir
auk*tesn# p=. 8rakcionuojan-iame gelyje glicino jonai migruoja paskui baltym ir
,G
A. Kanopka-Biotechnologija
baltymai i*skirstomi pagal savo molekulin# y# %enat"ruojan-iuose geliuose&, arba
pagal savo molekuli! pavial, y# ir kr"v# neenat"ruojan-iuose geliuose.
Baltymai enat"ruojami juos kaitinant, esant tirpale mao molekulinio svorio tiolui %G-
merkaptoetanolui [G-1K\, ar itiotreitolui [:TT\& ir natrio oecil sul.atui %@:@&.
Klektro.orez$ @:@-poliakrilamiiniuose geliuose- tai anijonin$ sistema, to$l ka @:@
ne*a neigiam kr"v#. :augumas baltym! ri*asi su @:@, o susiri*2s su baltymu @:@ kiekis
yra tiesiogiai priklausomas nuo baltymo yio, tuo b"u enat"ruotuose baltymuose
kr"vis pasiskirsto prakti*kai tolygiai. To$l @:@-baltymo kompleksas
poliakrilamiiniuose geliuose migruoja pagal y#, o ne pagal kr"v#.
;einomo baltymo molekulinis svoris nustatomas lyginant jo migracij
poliakrilamiiname gelyje su inom! baltym! %stanart!& migracija. Tiksliau baltymo
molekulin$ mas$ gali b"ti skai-iuojama pagal tiesin2 kalibracin2 kreiv2, kurioje Y a*yje
atieamas santykis atstum!E ao .ronto migravimo su baltymo migravimu %<
.
&, o y
a*yje molekulin$s mas$s logaritmas.
+eigu u baltymai turi ienti*k molekulin2 mas2, jie vienos imensijos gelyje
neatsiskirs. 3iam tikslui nauojami viej! imensij! geliai, kur pirmoje imensijoje
vykomas elektro.okusavimas, t.y. .rakcionavimas pagal baltymo kr"v#, o kitoje
imensijoje- elektro.orez$ enat"ruojan-iomis slygomis.
Darbo eiga0
'oliakrilamiinio gelio su$tisE
9oncentruojantis gelis: 6.5 S akrilamias, ).4 S bisakrilamias, ).4G0 1 Tris-9l p=
(.I, ).4 S @:@, ).)0 S amonio persul.ato, ).4 S TK1K:.
:rakcionuojantis gelis: 5.5 S akrilamias, ).G S bisakrilamias, ).6?0 1 Tris-9l p=
I.I, ).4 S @:@, ).)6 S amonio persul.ato, ).)? S TK1K:.
'aruo*tas .rakcionuojan-io gelio tirpalas supilamas tarp viej! stikl!, ant vir*aus
usluoksniuojamas neieliu kiekiu izopropilo alkoholio. 'alaukiama kol #vyks
polimerizacijos reakcija. Dzopropilo alkoholis nupilamas, ant susipolimerinusio
.rakcionuojan-io gelio upilamas koncentruojan-io gelio tirpalas. 3ulin$li!
susi.ormavimui #statomos taip vainamos *ukos, ir palaukiama kol #vyks polimerizacija.
3ukos i*traukiamos, gelis esantis tarp stikl! #eamas # aparat ir # susiariusius
*ulin$lius #ne*ami baltym! m$giniai.
'avyziai prie* une*ant juos # *ulin$lius enat"ruojami. 1$giniai lygiais t"riais
sumai*omi su pavyzi! tirpalu %GY@:@^sample bu..er&E ).4G0 1 Tris-9l p= (.I,
).0S @:@, G) S glicerolas, GS G-merkaptoetanolas, 4S brom.enoliom$lis, ir
enat"ruojami juos virinant 0 min. vanens vonioje.
Klektro.orez$s bu.erisE ).4G0 1 Tris, ).5( 1 glicinas, ).0S @:@.
Klektro.orez$ vykoma esant 4)) / #tampai.
:aant Kumasi briliantiniu m$liu galima aptikti nuo 0) ng baltymo, o aant siabru nuo
4 ng baltymo.
Klektro.orezei pasibaigus, gelis yra .iksuojamas ir aomas tirpaluE 0) S metanolis %v^v&,
).)0 S Kumasi briliantinis m$lis <-G0), 4)S acto r"g*tis %v^v&, ,) S vanuo.
:ao perteklius atplaunamas tirpaluE 0 S metanolis, ? S acto r"g*tis, II S vanuo.
,6