Está en la página 1de 100

Miko medi

biotechnologija

Paskait konspektai


Doc. dr. Darius Danuseviius






Mik ir ekologijos fakultetas, Lietuvos ems kio universitetas

2010




Turinys

ANGA.................................................................................................................................... 3
1. SANTRAUKA....................................................................................................................... 4
1. VADAS................................................................................................................................. 5
1.2 VADAS MIKO MEDI BIOTECHNOLOGIJAS. ................................................................... 5
1.2. KAS YRA GENAS IR KAIP JIS VEIKIA................................................................................... 7
2. MIKO MEDI GENOMIKA....................................................................................... 14
2.1 VADAS GENOMIK IR GENOM CHARAKTERISTIKA....................................................... 14
2.2 MOLEKULINI YMEN SISTEMOS................................................................................... 19
2.3 KIEKYBINIU POYMI LOKUSAI ....................................................................................... 38
2.2 GENOM SEKVENAVIMAS, GEN IDENTIFIKACIJA IR GENOLAPIAI. ................................... 43
2.3 BIOINFORMATIKA............................................................................................................ 49
3 MIKO MEDI EPIGENETIKA .................................................................................. 52
3.1 EPIGENETIKOS SAMPRATA............................................................................................... 52
3.2. CHROMATINO MODIFIKACIJA IR HISTON KODAS. .......................................................... 53
3.3 TIESIOGINIS DNR METILINIMAS. ..................................................................................... 57
3.4. MAOSIOS INTERFERENCINS RNR (MIRNR IR SIRNR). ............................................... 62
5.5. PARAMUTACIJA. ............................................................................................................. 67
4. GENETIN ININERIJA. ............................................................................................... 68
4.1 METODAI......................................................................................................................... 68
4.2 MIKO MEDI GENETINS ININERIJOS PASIEKIMAI. ...................................................... 73
4.3 GENETINS MODIFIKACIJOS TAIKYMO MIK KYJE YPATUMAI. ..................................... 82
5. GENETINS VAIROVS TYRIMAI............................................................................ 86
5.1 VADAS............................................................................................................................ 86
5.2 TYRIM METODIKA ......................................................................................................... 86
5.3 TYRIM PAVYDIAI ......................................................................................................... 88
6. MIKRODAUGINIMAS..................................................................................................... 92
6.1 VADAS. ........................................................................................................................... 92
6.2. ORGANOGENZ............................................................................................................... 92
6.3. SOMATIN GEMAL GENEZ........................................................................................... 94
6.4 SOMATIN HIBRIDIZACIJA................................................................................................ 96
6.5 AUGN AKNYDINIMAS................................................................................................. 96
8. LITERATROS SRAAS.............................................................................................. 97








2





anga

Miko medi biotechnologijos spariai vystosi ir jau plaiai taikomos praktikoje.
Tam, kad priimti tinkamus sprendimus dl biotechnologij taikymo naudojimo, reikalinga
informacija apie pagrindines miko medi biotechnologij vystymo kryptis, metodus j
komercin naud ir ekologinius padarinius. Tai ir yra pagrindinis io kurso tikslas.
iuose konspektuose glaustai apvelgta biotechnologija kaip mokslas ir btent mik
kyje perspektyvios biotechnologijos mokslo kryptys, technologijos ir j taikymas mik
kyje. inios pagrinde koncentruotos miko medi genomik, genetin ininerij, genetins
vairovs tyrimus, epigenetik ir mikrodauginim.
































3




1. Santrauka.

Biotechnologija tai biologini proces panaudojimas technologijoms kurti (FAO
2004). Miko medi biotechnologija vystoma tokiomis pagrindinmis kryptimis: genetins
vairovs tyrimai, genomika, epigenetika, genetin ininerija ir mikrodauginimas.
Miko medi genetins vairovs tyrimai naudojant molekulinius ymenis
koncentruojami genetins vairovs nustatym ir genetini itekli isaugojim, ri
evoliucij ir medi reprodukcijos ir poravimosi sistem tyrimus. Genetin vairov
vertinama tiesiogiai DNR lygmenyje pagal DNR ymen sistemas. Miko medi genomika
stipriai besipleianti sritis: pagal specifinius gen ymenis iekoma skirtum, ne tik tyliosios
DNR, bet ir gen sekose, tiriamos gen funkcijos; modernizuojant DNR tyrim rang, DNR
ymen sistem tikslumas didja, o tyrim katai maja, kas leidia atlikti tvysts analiz
bei panaudoti DNR ymenis selekcijoje (nors isamiai tiriamos tik kelios modelins rys).
Viso genomo DNR sekos inomos vienos i spygliuoi Pinus genties ries ir dviej
lapuoi atstov Populus ir Eucalyptus. Todl funkcins genomikos tyrimai (mikrogardels ir
gen ekspresija) sulauks daugiausiai dmesio keliose modelinse ryse, sudarant pilnus
fizinius ir genetinius genolapius bei DNR mikrogardeli bibliotekas. Palyginamoji genomika
sustiprins savo tyrimus lyginant ias sekas tarp ri ir populiacij. Tai sudarys teorin
pagrind genetinei modifikacijai. Genetin modifikacija. Viej staig finansuojami tyrimai
maja, mokslinink poiriai- skeptikai. Iimtis Kinija, kur finansuojama plati mokslini
tyrim programa ir leistas komercinis genetikai modifikuotos vienos i Populus ri
naudojimas (atsparumas kenkjams). Modifikuojami poymiai: atsparumas herbicidams,
kenkjams ir ligoms, medienos kokyb (pagrinde ligninio kiekis), ydjimo kontrol
(sterilumas, alergen sumainimas miest eldiniuose; ydjimo indukcija), toksini
mediag skaidymas (atsparumas tarai). GMO perspektyvos mik kyje nra didels,
vienintel sritis turinti perspektyv yra trumpos rotacijos plantacijos ir klonin
mikininkystje. Praktinje mikininkystje genetin ininerij galt pakeisti epigenetin
gen kontrol, kur poymiai modifikuojami ne DNR lygmenyje, o vienoje i gen raikos
grandi utildant ar aktyvuojant tam tikrus genus. Mikrodauginimas. Prognozs pozityvios,
kadangi klonin mikinyst ir trumpos apyvartos plantacijos apimtys turt didti.
Mikrodauginimas ir augn dauginimo technologijos vystomos toms rims, kurias sunku

4
dauginti augnais (pvz. paprastoji puis). Mikrodauginimas negyja dilels taikomosios
apimties dl per kat efektyvumo komerciniam taikymui. Spygliuoiams pagrindinis
dmesys skiriamas somatinei gemal genezei, lapuoiams- organogenzei..
1. vadas.
1.2 vadas miko medi biotechnologijas.
Miko medi biotechnologija vystoma tokiomis pagrindinmis kryptimis: genomika,
epigenetika, genetin ininerija, genetins vairovs tyrimai ir mikrodauginimas. Genomika
usiima DNR sek, gen ir j funkcijos identifikacija ir telkia molekulins biologijos ir vis
genetikos srii inias reikalingas gen identifikacijai, pagrindin dmes skiriant molekulinei
genetikai, rekombinuot DNR molekuli sukrimo technologijoms ir bioinformatikai
(biologins informacijos valdymo mokslas). Epigenenetika tiria pavedimus poymi pokyius
nesusijusius su DNR grandins nukleotid sek pokyiais. iuo atveju tiriama kaip aplinka
pati reguliuoja gen raik (ekspresij) ir ar bei kaip i reguliacija yra paveldima. Genetin
ininerija (genetin modifikacija) tai dirbtin gen modifikacija lstelje ir nelytinio gen
perklimo metod naudojimas tikslinei natrali produkt ir proces modifikacijai. Gamtoje
genai modifikuojami ir terpiami naujus organizmus pastoviai vykstant j mutacijoms ir
perneimui bakterij pagalba. Selekcija ir nauj pranai genotip kombinacij sudarymas
(rekombinacija) taip pat siekiama kaupti vertingus genus atrenkamuose individuose.
Genetins modifikacijos atveju tikslinis genas yra izoliuojamas ir dirbtiniu bdu ar bakterij
pagalba vedamas kit organizm. Miko medi ries genetins vairovs tyrimai (ries
viduje) skirti genetins vairovs dydio ir dsningum miko medi populiacijose
nustatymui molekuliniame lygmenyje, panaudojant molekulinius ir genetinius ymenis.
Miko medi mikrodauginimas (vegetatyvinis (nelytinis) dauginimas in vitro (dirbtinje
aplinkoje)) pagrinde vystomas trimis kryptimis: augn aknydinimas, organogenez ir
somatin gemal genez (embriogenenz). Daugeliu atveju yra pravartu turti tam tikru
poymiu isiskiriani genotip kopijas bei sisavinti ekonomikai efektyvias j masinio
dauginimo technologijas. Aukiau apvelgtos pagrindins biotechnologij kryptys mik
kyje jungiasi nuosekli tyrim ir technologij sistem: DNR sek funkcijos analiz, gen
identifikacija, gen vairovs tyrimai gamtinse populiacijose, gen modifikacija ir terpimas,
genotip klonavimas bei epigenetikos ir mikorizs tyrim rezultat panaudojimas
technologij krime (1.1.1 pav.).
Informatyvi biotechnologij mik kyje tyrim ir taikymo apvalga yra pateikta 2004
m.FAO ataskaitoje Biotechnologija mik kyje. Ataskaitoje ymiausi miko

5
biotechnologijos specialistai apvelg ir reziumavo biotechnologij vystymo tendencijas
kryptys mik kyje. FAO ataskait galima rasti internete:
http://www.fao.org/docrep/008/ae574e/ae574e00.htm.

1.1.1. pav. Pagrindins miko medi biotechnologij vystymo kryptys (geltoni apskritimai)
ir joms naudingiausios genetikos sritys (staiakampiai). Nors gen identifikacija ir
modifikacija atliekami molekuliniame lygmenyje, kitos genetikos sritys yra labai svarbios
gen molekulini funkcij tyrimuose. Toki laukini augal ri, kaip miko medi
biotechnologij vystymui, reikalinga bendra genetini tyrim integracija viening sistem.

1.2.2. Su miko medi biotechnologija susijusi tyrim procentinis pasiskaitymas pagal
medi ris (FAO 2004).





Miko medi
biotechnologija
Molekulin genetika
(gen veikimas
molekuliniame
lygmenyje): DNR
struktra, sekos,
genetinis kodas, gen
veikimas, DNR mutacijos
Populiacij genetika (gen
pasiskirstymo populiacijose
dsningumai). Gen daniai,
genetin vairov ir
polimorfizmas, evoli ucins
jgos, adaptacija Kiekybin genetika (gen
paveldjimo dsningumai).,
genetins variacijos tipai,
paveldimumas, selekcija.
Lstels genetika :
Kariotipas,
chromosoma,
Mejoz, mitoz,
rekombinacija,
Mendelio genetika (gen
paveldjimas). Aleli segregacija,
genu sukibimo grups, gametos,
gen tarpusavio sveika.
Epigenetika: paveldimi
gen funkcijos pokyiai
nesusij su DNR kodo
pokyiu.
Miko medi
biotechnologija
Miko medi
biotechnologija
Molekulin genetika
(gen veikimas
molekuliniame
lygmenyje): DNR
struktra, sekos,
genetinis kodas, gen
veikimas, DNR mutacijos
Populiacij genetika (gen
pasiskirstymo populiacijose
dsningumai). Gen daniai,
genetin vairov ir
polimorfizmas, evoli ucins
jgos, adaptacija Kiekybin genetika (gen
paveldjimo dsningumai).,
genetins variacijos tipai,
paveldimumas, selekcija.
Lstels genetika :
Kariotipas,
chromosoma,
Mejoz, mitoz,
rekombinacija,
Mendelio genetika (gen
paveldjimas). Aleli segregacija,
genu sukibimo grups, gametos,
gen tarpusavio sveika.
Epigenetika: paveldimi
gen funkcijos pokyiai
nesusij su DNR kodo
pokyiu.

6


1.2. Kas yra genas ir kaip jis veikia.

Mediai sudaryti i lsteli. Lstelse randasi genai, kontroliuojantys medi
poymius. Lstels sandara (1.1.3 pav.). Branduolys - lstels smegenys, talpinanios
chromatin, kuris lsteli dalijimosi metu kompaktuojamas chromosomas. Chromatin
sudaro tai ilgi silo pavidalo baltym ir DNR junginiai, kuriose isidst genai. Ribosoma-
baltym fabrikas, gaunantis tiesioginius gen sakymus kokius baltymus (gen
transliacija). Ribosomos koncentruojasi ant endoplazminio tinklo. Chloroplastas-
fotosintezs rankis= viesos energija perdirbama kur energijos gamybai (turi savo
iedins formos DNR molekul). Mitochondrija- energijos gamintojas taip pat turi iedins
formos DNR. Vakuol- maisto mediag ir vandens saugykla. Goldio aparatas- baltym
pakavimas ir paskirstymas po lstel.





1.1.3. pav. Augalo lstels sandara, kur yra tik trys genetin informacij turinios organels:
branduolys, mitochondrija ir chloroplastas. Pagrindin ir svarbiausia genetin informacijos
dalis yra branduolyje esaniame chromatine.



Chromosoma, chromatinas ir DNR. Chromatinas tai lstels branduolyje esanti makro
molekul, turinti genetin informacij (tame tarpe ir genus). Chromatinas sudarytas i ilg
linijini (silo pavidalo) DNR (DeoksiriboNukleininRgtis) molekuli (genetins
mediagos nejo), kurios yra apvyniotos ir kontroliuojamos speciali baltym vadinam

7
histonais (1.1.4 pav.). DNR grandin sudaryta i specifiniu kodu isidiusi nukleotid,
kuri sekose ukoduota genetin informacija. Histonas ir su juo susijusi DNR grandins dalis
sudaro nukleosom (1.1.5 pav.). Nukleosom sudaro (1) baltym erdis, sudaryta i 8 histon
molekuli (8 histon molekuls nukleosomos erdyje sudaro oktamer: histon ymjimas:
H2A, H2B, H3, H4), (2) DNR grandins 2 vijomis apsuka nukleosom ir (3) DNR
nukleosomos vijas fiksuojanio H1 histono. Histonai turi specialias aminorgi grandines
vadiniams histon uodegomis. iuos uodegos dalyvauja gen raikos kontrolje

DNR
nukleotidas
Chromatinas
DNR
Histonai
Chromosomos
nuotrauka
Chromosoma -kondensuota
chromatino bsena (lsteli
dalijimosi metu)
Centromera
Telomera
Telomera
Chromatid
Aktyvi bsena:
chromatinas
i chromosoma padvigubjusi lsteli dalijimosi stadijos vadinamos
mejoze metu (viena chromatid pereis vien, kita kit lstel)
DNR
nukleotidas
Chromatinas
DNR
Histonai
Chromosomos
nuotrauka
Chromosoma -kondensuota
chromatino bsena (lsteli
dalijimosi metu)
Centromera
Telomera
Telomera
Chromatid
Aktyvi bsena:
chromatinas
i chromosoma padvigubjusi lsteli dalijimosi stadijos vadinamos
mejoze metu (viena chromatid pereis vien, kita kit lstel)

1.1.4 pav. Chromatino ir chromosom sandara.










1.1.5 pav. Nukleosomos sandara.

Chromatinas gali bti keli bsen (a) aktyvios (vadinamas chromatinu), kai genai
gali bti aktyvs ir (b) neaktyvios, lsteli dalinimosi metu (kondensuojama chromosom
histon pagalba). Chromosomos sandara: centromera jungia chromosomos atakas vadinamas
chromatidmis (1.1.4 pav.). Chromosoma bdama iame stovyje ir labai koncentruota

8
(sutraukta) speciali baltym- histon pagalba taip , kad 2 m ilgio chromatino molekul
sutraukiama apytikriai 1/1000 milimetro dal.

Kariotipas tai organizmo chromosom visuma, apibdinama chromosom kiekiu,
dydiu ir morfologija. Pvz. puies genties mediai turi 12 chromosom por (viso 24
chromosomas). Viena porin chromosoma yra gaunama i tvo, kita- i motinos. Kiekviena
porin chromosoma turi savit morfologij ir chromatino koncentracijos dsningumus.




1.1.6 pav. Kairje pavaizduotas dvigubo chromosom rinkini susidarymo principas kai
apvaisinimo metu tvin ir motinin gametos susilieja taip suformuodamos zigot (nauj
genotip su dvigubu chromosom skaiiumi). Deinje- Pinus taeda kariotipas: dvigubas
chromosom rinkinys. Paveikslas i Islam-Faridi ir kt. 1997. Loblolly Pine Karyotype Using
FISH and DAPI Positive Banding. Silvae Genetica 27: 144-150.

























9


1.1.7 pav. Chromatino kompaktavimo chromosom lygmenys.

Skirtingos rys turi skirtingus kariotipus, pvz. Larix decidua nuo Larix sibirica skiriasi
dvejomis pakitusiomis chromosomomis. Giminingos rys gali skiriasi ploidikumu (t.y.
porini chromosom skaiiumi), pvz. karpotasis beras yra diploidas (turi po dvi porines
chromosomas, ym. 2n=28) ir plaukuotasis beras gali turti po keturias porines
chromosomas ir yra tetraploidas 4n=56. Ploidikumu gali skirtis net ekotipai.
DNR tai lstels branduolyje esanti dviej ilg vienas apie kit spirals bdu
apvyniot vij grandin, talpinanti genetin informacij (tame tarpe ir genus). DNR vij
sudaro tam tikra tvarka paeiliui isidst nukleotidai (1.1.8 pav.). Nukleotid sudaro cukraus-
fosafat junginys ir viena i keturi bazi adeninas (A), timinas (T), guaninas (G) citozinas
(C). Cukraus-fosfat junginys ir vienodas visiems nukleotidams ir taip sudaro DNR grandins
pagrind (backbone). Tokiu bdu skiriasi tik bazs. Nukleotidai isidst 2-jose vijose vienas
prie kit ir sujungti vandenilinmis jungtimis. DNR kodas apibdinamas tam tikru
nukleotid bazi kodu, o dvigrandins DNR ilgis matuojamas bazi poromis (pora yra viena
prie kit susijungusios bazs). Bazs jungiasi pagal special derin A su T (ar atvirkiai- T
su A) ir G su C (ir atvirkiai).
.
nukleotidas
DNR grandins
DNR= DeoksiroboNuklein
Rgtis
B
a
z

s
D
N
R

g
r
a
n
d
in

s

Ribozs g.
Fosfat g.
nukleotidas
DNR grandins
DNR= DeoksiroboNuklein
Rgtis
B
a
z

s
D
N
R

g
r
a
n
d
in

s

Ribozs g.
Fosfat g.



















10
1.1.8 pav. DNR sandaro specialiu kodu isidsiusios keturi tip nukleotid sekos.




1.1.9 pav. Genai isidst iilgai DNR molekuls. Nors paveiksle parodyti genai yra alia,
tikrovje juos gali skirti gana ilgos nekoduojamos kartotins DNR atkarpos.

Genas tai pagrindinis paveldjimo vienetas, kontroliuojantis organizmo veikl ir
slygojantis paveldim poymi iraik ir perduodamas i kartos kart. Molekuline prasme,
genas atitinka tam tikr DNR molekuls nukleotid sek, kurioje yra nukleotid forma
ukoduota informacija tam tikr baltym sintezei. ie baltymai vadinimai fermentais (sin.
enzimais), kuri paskirtis kanalizuoti susijusias chemines reakcijas ir taip formuoti poymius.
Genai isidst iilgai DNR grandinins (kiekvienas atitinka savit DNR nukleotid sek,
kurios ilgis gali siekti trisdeimt tkstani nukleotid por) (1.1.9 pav.). Gen ilgis gali
vyrauti nuo keli tkstani iki keliasdeimt tkstani nukleotid (pvz. vidutinis mogaus
geno dydis 30 000 nukleotid).



11
1.1.10 pav. Geno molekulin sandara. Apaioje pavaizduotas principas kaip trij nukleotid
raktas (vadinamas kodonu) koduoja atitinkam aminorgt, kuri rinkinys sudaro baltym.
Jei nukleotid kodas yra skirtingas, bus sintetinami skirtingos aminorgi sudties baltymai
ir taip skirsis poymio iraika.

1.2.11 pav. Geno ir jo koduojanios dalies funkcin sandara. Prie gen yra isidsiusios
trumpos jo raik reguliuojanios sekos. Geno pradia yra promotoriaus, turintis universali
TATA sek, prie kuris jungiasi transkripcijos faktoriai, dalyvaujantys geno kodo perrayme i
DNR naujai sintetinam RNR molekul (t.y. transkripcijoje). Koduojanti dalis sudaryta i
egzon koduojani baltymus sek, pagal kurias sintetinami baltymai ribosomose ir intron
danai kartotini sek kurios ikerpamos RNR brendimo metu (todl yra nubrauktos iame
paveiksle) ir geno pabaigos dalis.

Gen sudaro 3 pagrindins funkcins dalys: promotoriaus, koduojanti dalis ir geno
pabaigos seka (1.1.10 pav.). Promotoriaus (i angl. odio promote, liet. skatinti) nusako kada
ir kur ir kaip stipriai genas yra ireiktas ir taip reguliuoja geno veikl (raik). Koduojanti
dalis nusako koks fermentas bus sintetinimas ir yra sudaryta i egzon (tikrojo kodo) ir
intron (kartotini sek, kurios nedalyvauja baltym sintezje) (1.2.11 pav.). Geno pabaigos
seka slygoja gen sudarani nukleotid kodo nuskaitymo (transkripcijos) pabaig. Be trij
pagrindini funkcini dali geno sandarai priskiriami: geno reguliacin sritis, netoli nuo
promotoriaus, tai yra trumpos sekos prie kuri jungiasi gen raik reguliuojantys baltymai-
enhanseriai (skatintuvai)- skatina geno raik, sailenceriai (slopintojai)- slopina ar blokuoja
geno raik.
Genetinis kodas- yra trij gretim nukleotid sekos kodas DNR molekulje, pagal kur
sintetinami baltymai lstelje. Sintetinant baltymus pagal DNR nukleotid kod, baltymus
sudaranios amino rgtys parenkamos pagal DNR esani trij nukleotid (tripleto) kod- 3
gretimi nukleotidai slygoja tam tikros aminorgties prijungim. is kodavimo sistema
vadinama genetiniu kodu, o trys nukleotidai kodonu (1.1.12 pav.).
Geno veikimas skirstomas 3 etapus: transkripcija, iRNR (informacins RNR)
brendimas ir transliacija (1.1.13 pav.). Transkripcija tai genetinio kodo perraymas naujai

12
sintetinam iRNR molekul. iRNR brendimas (procesingas) tai k tik susintetintos iRNR
molekuls paruoimas transportavimui citoplazm ir transliacijai. Transliacija tai pagal
iRNR esant kod (nukleotid triplet vadinam kodonu), sintetinami baltymai (jungiamos
amino rgi grandins). Amino rgtis pristato transportin RNR (tRNR).



1.1.12 pav. Genetinis kodas. iame paveiksle kodas skaitomas nuo apskretimo centro iors
link: didiausiomis raidmis centre parodytas pirmasis i trij kodon sudarani nukleotid,
maesnmis raidmis- antrasis ir apskritimo iorje- vienas i treij nukleotid, bei j
koduojama aminorgtis.


13

1.1.13 pav. Geno veikimo etapai. 1. Transkripcija kai pagal DNR kod sintetinama iRNR,
kuri yra geno kopija. 2. RNR molekule migruoja i branduolio lstelin terp (citoplazm).
Migracijos metu vyksta eile brendimo proces :intron ikirpimas, organizmui specifins poli
A uodegos sintez. 3. Transliacija- pagal iRNR kod sintetinami baltymai.

2. Miko medi genomika
2.1 vadas genomik ir genom charakteristika.

Genomika tai genetikos aka tyrinjanti organizm genomus, siekiant nustatyti DNR
sek kintamum ir paskirt. Genomas tai visa organizmo genetin informacija, esanti jo DNR
molekules sudarani nukleotid sekose. Vertinant genomo dyd imamas viengubas
(haploidinis) chromosom rinkinys (t.y. po vien i kiekvienos chromosom poros).
Augaluose egzistuoja 3 genomai: lstels branduolio genomas, mitochondrij
genomas, plastidi (chloroplast) genomai (1.1.3 pav.). Palyginti su branduolio genomu,
mitochondrij ir plastidi genomai yra enkliai maesni ir siekia 40 000-200 000 bp.
Mitochondrij ir plastidi DNR yra iedin molekul (udara) ir yra paveldima tiesiogiai i
vieno i tv (spygliuoi mitochondrin DNR paveldima i motinos, chloroplasto DNR i
tvo; lapuoiams atvirkiai- mitochondrin paveldima i tvo, o chloroplasto i motinos).
Lyginamosios genetikos metodais buvo nustatyta, kad plastins yra kilusios i cianobakterij
ir yra isaugoj kai kurias bakterij DNR ypatybes. Dl neutralumo atrankai, nedidelio gen
skaiiaus ir tiesioginio tvinio paveldjimo pobdio (be rekombinacijos), miko medi

14
mitochondrij ir plastidi genomai yra gana konservatyvus (nedaug skiriasi tarp populiacij
ir genotip vienos ries ribose).
Didiausi ir svarbiausi organizmo genomo dal sudaro branduolio genomas.
Branduolio genome genetin informacija yra pasiskirsiusi chromosomose ir apima ne tik
genus, bet ir kit DNR grandinje esani genetin informacij, pvz. vairios kartotins sekos,
judrieji genomo elementai. Eukariot (auktesnio evoliucinio lygmens organizm) genom
dydis vyrauja nuo 1,2 10
7
nukleotid (Saccharomyces cerevisiae) iki 6,0 10
12
nukleotid
(Amoeba dubia). mogaus genomo dydis 3,2 x 10
9
nukleotid (apie 30 000 gen), bendras
vis chromosom DNR ilgis siekt 2 metrus.



2.1.1 pav. mogaus genomo dydis ir struktra gali bti apibdinta taip: jeigu prilyginus vien
DNR nukleotid vienam milimetrui, tai DNR ilgis bt 32000 km ir uimt atstum skersai
Afrikos emyno jei eitumm i ryt vakarus, gen sutiktumm kas 300 m, jo ilgis bt apie
30 m, o koduojanti geno dalis bt tik 1 m, tarpuose tarp gen bt kartotins sekos. Panai
struktra ir medi genom.

Augal genomai sudaryti i unikali (gen) ir kartotini DNR sek (priklausomai nuo
ries gali sudaryti net iki 80% augal genomo, 2.1.2 pav.). Unikaliose DNR sekos yra genai,
kur didioji dalis sek yra gen raik reguliuojanios sekos (tarp j heterochromatinas) ir
intronai (intronai tai nekoduojamos DNR sekos ikerpamos RNR brendimo metu) ir tik apie
1.5-25 % viso genomo sudaro egzonai koduojanios DNR sekos, pagal kurias sintetinami
baltymai. Heterochromatinas tai stipriai kondensuotas chromatinas (chromuotin sudaro DNR
ir j tvarkantys baltymai vadinami histonais), kuris susjs su gen raikos epigenetine
kontrole (iRNR, metilinimas, piston kodas, r. epigenetikos skyrelyje). Pavyzdiui, net apie
30% Populus trichocarpa genomo sudaro heterochromatinas. Kartotines DNR sekas sudaro

15
trumpos tandemins (t.y. tstins sekos einanios viena po kitos be intarp) ar intarpais
perskirtos kartotins sekos ir didel vairov judrij genomo element (JGE). Trumpos
tandemins 2-j nukleotid kartotins sekos pavyzdys yra AC AC AC AC AC AC AC AC ,
kur motyvas AC kartojasi 8 kartus (ymima AC
8
). Manoma, kad toki sek atsiradimo
prieastis DNR replikacijos, rekombinacijos metu atsiradusio klaidos, bet galima ir j
funkcin prasm- gen raik reguliuojani DNR sek viet pokyiai ir taip



2.1.2 pav. Hipotetinis miko medi branduolio genomo pagrindini sudedamj dali
modelis.

atliekamas gen raikos reguliavimas, be to kartotines sekas specifikai atpasta kai kurie
transkripcijos valdymo baltymai. Danai toki kartotini DNR sek ilgiai bna genotipui
specifiniai ir radus keliolika toki individualiems genotipams savit lokus sudaromi
genotip pirt antspaudai, leidiantys gana efektyviai identifikuoti individualius medius ar
net j populiacijas (r. molekulini ymen skyriuje). Tandemikai besikartojanios sekos
daniausiai telkiasi subtelomeriniuose, centromeriniuose chromosom dalyse.
Judrieji genomo elementai (JGE) tai DNR molekuls, galinios judti genomo ribose.
Augal JGE skirstomi transpozonus (RNR transpozonai arba retrotranspozonai, DNR
transpozonai), plazmins (pvz. bakterij migruojanti DNR), bakteriofag elementai ir antros
grups intronai. Didij dal augal JGE sudaro transpozonai. Transpozonai tai DNR
atkarpos, galinios persikelti kitas genomo vietas, kitaip vadinamos okinjaniais genais.
Persiklimas (transpozicija) gali vykti kopijavimo per RNR ar tiesioginio perklimo DNR
bdais. Transpozonai gali sukelti gana enklias mutacijas ir turti reikming tak fenotipini
poymi iraikai bei enkliai pakeisti genomo dyd bei yra laikomi pagrindiniu mutacij

16
altiniu augal genomuose. Paprastai transpozonai laikomi parazitine DNR, kurios
pagrindinis tikslas pasidauginti save, nors dabartiniai tyrimai randa ssaj tarp transpozon
polimorfizmo ir atsparumo bakterijoms bei virusams mechanizm. Pagal savo transpozicijos
bd, transpozonai skirstosi RNR arba retrotranspozonus (kopijuoja save RNR ir vl
siterpia kit DNR viet) ir DNR transpozonus (ikerpiami i perkeliami kit DNR
molekuls viet). Retrotrnaspozonai transkripcijos bdu kopijuojasi RNR molekul, kuri
atbulins transkripcijos bdu kopijuojami DNR. Retrotrnaspozonai elgiasi panaiai kaip
RNR virusai (retrovirusai). DNR transpozonai- tai transpozonai, turintys genus koduojanius
fermentus, kurie gali tiesiogiai manipuliuodami DNR perkelti transpozonus kitas genomo
dalis. Paprastai transpozonai yra bakterins kilms tik prarad funkcines dalis nepriklausomai
veiklai.
Ri genomai skiriasi chromosom skaiiumi, chromosom dydiu, gen skaiiumi,
kartotins DNR kiekiu, egzon ir intron dydiu ir kt. (2.1 lent.).

2.1 lent. vairi organizm haploidinio (viengubas chromosom rinkinys) genomo dydis
nukleotidais.
Mikoplazmos 10
4
- 10
6
Bakterijos (E. coli ir kt.) 10
5
- 10
7
Grybai (2-5) 10
7
Dumbliai (5-7) 10
7
Kirmls ~ 10
8
Moliuskai 5 10
8
5 10
9
Vabzdiai 10
8
5 10
9
Viagyviai ~ 10
9
Dygiaodiai 2 10
8
2 10
9
uvys 3 10
8
- 10
10
Amfibijos 7 10
8
7 10
10
Reptilijos (2 - 3) 10
9
Paukiai 10
9
induoliai 3 10
9
iediniai augalai 2 10
8
10
11
Medis (Populus) 5 x 10
8
(500 mln.)
Genomo dydis turt bti proporcingas genetins informacijos kiekiui ir evoliucijos
lygiui. Taiau pirmuoni, auktesnij augal genomai yra dideli ir sudtingi, o j dydis

17
svyruoja gana didelse ribose. Dl palyginti kompaktiko genomo (apie 500 milijon
nukleotid, 50 kart maesnis nei puies), Populus trichocarpa buvo pasirinkta kaip modelin
ris miko medi genomikos tyrimuose: sekvenuotas (nustatytos DNR nukleotid sekos)
Populus trichocarpa genomas ir vyksta i sek funkcij identifikacija. I 2.1 lentels matyti,
kad DNR kiekis genome nra susijs su organizmo evoliucinio isivystymo lygiu. Tai
vadinama C- reikms msle arba paradoksu. C-reikm yra DNR kiekis haploidiniame.
Eukariotuose C reikme kinta nuo 1,2 10
7
bp (Saccharomyces cerevisiae) iki 6,0 10
12
bp
(Amoeba dubia). Skirtumus tarp genom lemia kartotin DNR (nekoduoja baltym). Tolesni
paaikinimas galt bti, kad evoliucin lygmen lemia ne kartotin DNR (genomo dydis), o
gen raikos reguliacijos skirtumai.
Pagal tyrim tiksl genomika skirstoma tokias kryptis: struktrin, funkcin,
palyginamoji, asociatyvin, statistin ir ekologin genomika. Struktrin genomika usiima
DNR sek struktros identifikavimu ir padties chromosomoje nustatymu (pvz. DNR
sekvenavimas). Funkcin genomika- gen funkcij iaikinimas ir nustatymas kaip genai
lemia fenotip (pvz. gen raikos tyrimai atsake stres ir RNR transkript ifravimas,
mikrogardels). Palyginamoji genomika- skirting medi ir kit augal ri genetins
informacijos palyginimas siekiant suprasti gen organizacij, ekspresij ir evoliucinius
skirtumus. Asociacij genomika- molekulini krimu ir paieka, analizuojant DNR sankibos
grupes (likage disequilibrium) ir vertinant asociacijas tarp aleli ir fenotip ir taip
identifikuojant medi bsimas savybes pagal j DNR. Ekosistemin genomika pati
naujausia genomikos disciplina, integruojanti genetik, genomik, ekologij ir evoliucij
tiriant genetin ekosistemos komponent atsak natrali ir dirbtin atrank, abiotin ir
biotin stres, populiacij evoliucijos dsningumus, medi reprodukcines sistemas ir kitus
veiksnius takojanius genetins ir biologins vairovs evoliucij (toki tyrim pavyzdys yra
ES finansuojamas tarptautinis mokslinis projektas Evoltree http://www.evoltree.eu).
Miko medi genomikos tyrimai apima tokias pagrindines kryptis: molekulini
ymen sistem krimas ir DNR polimorfizmo vertinimas (DNR polimorfizmas tai DNR
sek kintamumas), kiekybini poymi lokus (viet DNR grandinje, kurios randasi
svarbius poymius slygojantis genai) ir kandidatini gen identifikavimas (tai gen grupi
identifikacijos tyrimai), genom sekvenavimas (DNR nukleotid sek nustatymas), gen
identifikacija ir genolapiai (pai gen ir j lokus identifikacija), gen iraikos
(ekspresijos) analiz (kokie genai ireikti atsakant tam tikr stres? tokiu bdu nustatoma
kokie genai (molekuline prasme) kontroliuoja tam tikrus poymius), bei bioinformatika
(biologins informacijos sraut valdymas, kuris be kit svarbi tyrim, taip pat skmingai

18
naudojamas gen sek identifikacijai pagal jau nustatyt gen sek panaumus). . Su
organizm genomika susijusi informacija talpinama internetinse duomen bazse, kur
galima suinoti sekvenuot genom DNR nukleotid sekas, molekulini ymen sekas ir pan.
(pvz. Nacionalinio biotechnologijos centro (NCBI) centrin duomen baz
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

2.2 Molekulini ymen sistemos.
Genetinis ymuo- tai yra imatuojamas morfologinis poymis, kuris yra stipriai
pavedimas ir taip parodo genetinius skirtumus. Genetinius ymenis sudaro (a) morfologiniai
poymiai (2.1.3 pav.), (b) baltyminiai (biocheminiai) ymenys (tai ymenys aptinkantys gen
2.1.3 pav. Genetinio (kairje) ir molekulinio (deinje) ymens pavyzdys. Genetinis ymuo
yra specifinis sezonins augimo pradios laikas: paprastosios egls genotipai enkliai skiriasi
savo sezoninio augimo pradia, kuri yra svarbus adaptacinis poymis; genotipo specifin
sezoninio augimo pradia parodo, kad jis turi savitus augimo pradi slygojanius genus. Su
tam tikrais genais susijs molekulinis lygmuo nustatomas DNR lygmenyje laboratorijoje.
produktus pvz. izoenzimai).

ir (c) molekuliniai (sinonimas- DNR) ymenys. Molekulinis ymuo yra specifin lengvai
identifikuojama DNR nukleotid seka, susijusi su tam tikrus poymius slygojaniais genais.
Molekulinio ymens veikimo principas yra pagrstas tuo, kad molekulinio ymens
atpastama DNR nukleotid seka yra gen ar kitose specifinse nekoduojanios DNR sekose
ar netoli nuo j (vienoje DNR sankibos grupje) ir taip leidia laboratorini analizi pagalba
identifikuoti specifinius individo poymius ar pat individ. Molekuliniai ymenys skirstomi
dominantinius ir kodominantinius (2.1.4 pav.). Dominantiniai ymenys negali atskirti vieno
geno alternatyvi form (aleli), jie gali tik identifikuoti ar genas (specifin DNR seka) yra ar
jos nra (dominantins ymen sistemos pavyzdys yra RAPD molekulini ymen sistema).
Kodominantiniai ymenys gali identifikuoti alternatyvias vieno geno formas (alelius) ir tinka

19
individuali genotip atpainimui (pvz. SSR). Molekuliniai ymenys naudojami genotip,
populiacij ir ri identifikavimui, miko reprodukcins mediagos kilms kontrolei (kilm
nustatymui), genetins vairovs vertinimui DNR lygmenyje, ri poledynmetins
migracijos ir gen migracijos per iedadulkes dsningum nustatymui, selekcijoje
molekulini ymen pagalba (MAS), specifini DNR sek ar gen nustatymui ir
pagausinimui.
s
.1.4 pav. Dominantinio ir kodominantinio molekulinio ymens veikimo samprata.
Kadangi didioji dalis augal genomo sudaryta i nekoduojamos DNR, dauguma
tradicin
ralius



2

i ymen sistem ymi nekoduojamas DNR sekas, kurios nepriklausomos nuo
natralios atrankos (ymenys neutrals atrankai). iuo apsektu ymenys skirstomi neut
ir ireiktus (t.y. esanius gen sekose) molekulinius ymenis. ymen sistemos pasirinkimas
priklauso nuo tyrimo tikslo: siekiant vertinti genetin vairov ar genetinius skirtumus,
neutrals ymenys tinkamiausi, kadangi jie gali aptikti bet kurios genomo dalies DNR se
skirtumus. Taiau iekant DNR polimorfizmo ir vairi poymi ssajos, ireiktus genus ar
j dalines sekas identifikuojantys ymenys yra pranaesni (atsitiktin paieka naudojant
neutralius ymenis neefektyvi).
Miko medi tyrimuose
k
naudojamos molekulini ymen sistemos skirstomos taip:
1. DNR pagrsti ymenys: restrikcini fragment ilgio polimorfizmas (RFLP).

20
2. Polim
),
io polimorfizmas (AFLP),
enys (EST), DNR mikro gardels, pavieni
apsektu is principus (restriktazs tai specials fermentai,
kerpan
n

.
s)
poym
erine grandinine reakcija (PCR) pagrsti ymenys:
2.1 Polimerin grandinin reakcija (PCR),
2.2 Atsitiktinai pagausinta polimorfin DNR (RAPD
2.3 Pagausint (amplifikuot) fragment ilg
2.4 Specifini sek atkarpos (STS),
Makro-, mikro-satelitai, SCAR, CAPS, ISSR.
2.5. Naujos sistemos (ireikt sek ym
nukleotid polimorfizmas (SNP)).
Norint sisavinant molekulini ymen veikimo metodikas svarbu suprasti iuos
s: (a) DNR sukarpymo restriktazm
tys DNR molekul specifinse vietose, angl. restrict- apriboti); (b) polimerins
grandins reakcijos (PCR) ir elektroforezs veikimo principus; (c) ireikt sek kodo
nustatymo esm (iRNR-cDNR ymen sistemas) ir mokti naudotis DNR sek duome
bazmis internete. Kitos ymen sistemos i esms yra i metod deriniai (restriktazi
tikslumas su PCR efektyvumu) ir PCR ymen pasirinkimo ar identifikacijos alternatyvos
ymen sistemos pasirinkimas priklauso nuo tikslo: genetins vairovs tyrimai,
genotip ir populiacij identifikacija ar DNR polimorfizmo ssaj su fenotipiniais (ioriniai
iais paieka ir kiekybini poymi lokus (QTL) identifikacija.
DNR pagrsti ymenys: restrikcini fragment ilgio polimorfizmas (RFLP). RFLP tai
DNR ymen sistema, leidianti nustatyti nukleotid sek skirtumus tarp DNR molekuli
(geneti
R
nius skirtumus), pagal restriktazmis sukarpyt ir speciali markeri paymt DNR
fragment dyd. RFLP veikimas pagrstas DNR molekuls sukarpymu restriktazi pagalba
(restriktazs tai specials enzimai (baltym ris) kurie kerpa DNR grandin specifinse
vietose) ir elektroforeze, kai veikiant elektros sroviai specialiame gelyje vairaus dydio DN
fragmentai juda priklausomai nuo j dydio taip suskirstomi pagal savo dydi sudarydami
specifinius DNR fragment profilius (2.1.5 pav.). Sukarpyta DNR hibridinama su
radioaktyviais ymenimis, kurie jungiasi tik prie tam tikr sek turini DNR fragment
(2.1.6 pav.).

21

2.1.5 pav. Restriktaz EcoRI kerpa DNR grandin ties seka GAATTC.

RFLP sistemos privalumai: (a) Gali atskirti homozigotinius (AA) nuo heterozigotini
(Aa) individ (kodominantinis ymuo); (b) Stabilumas: gaunami tie patys rezultatai
pakartojus analizes su genetikai identikais individais, auganiais skirtingose aplinkose ar
pakartojus analizes po tam tikro laiko tarpo skirtingose laboratorijose su skirting gamintoj
ranga; (c) Detalumas: gebjimas nustatyti keli nukleotid sek skirtumus; (d) Paprastumas
(iskyrus DNR markeri parinkim hibridizacijai). Trkumai: (a) Daug darbo reikalaujantys ir
laboratoriniai metodai (auktesni katai); (b) Reikalauja geros DNR izoliavimo kokybs ir
santykinai didesnio kiekio; (c) Darbas su radioaktyviomis mediagomis; (d) Sudtinga
parinkti tinkamas DNR markeri ir restriktazi kombinacijas (reikalingos iankstins inios
apie tiriamos DNR sekas), pvz., jeigu markeris per trumpas, gaunama per daug skirting DNR
fragment.
RFLP tyrim pavyzdys. Sinclair, W.T.; Morman, J.D.; Ennos, R.A. 1999. The
postglacial history of Scots pine (Pinus sylvestris L.) in western Europe: evidence from
mitochondrial DNA variation (P. puies re-emigracijos dsningumai po paskutinio
ledynmeio Europoje: mitochndrins DNR variacija). Mol. Ecol. 8: 8-888. i tyrim tikslas
buvo nustatyti geografinius mitochondrins DNR (mtDNR paveldima tik i motinos)
haplotip isidstymo dsningumus tarp Europos p. puies populiacij. Metodai: 20
populiacij i kotijos, 18 i kontinentins Europos (20 medi i populiacijos (medyno)).

22
RFLP ymen sistema. Rezultatai. Gauti 3 pagrindiniai mtDNR haplotipai (haplotipas-
genotipas turinti specifin DNR fragment isidstymo profil elektroforezje): A, B, C.
Ispanijos populiacijose buvo rasti vis trij haplotip atstovai, kas rodo didel genetin
vairov; D haplotipas buvo rastas tik vienoje pietinje populiacijoje. Pranczijos, Vokietijos,
Lenkijos, Rusijos ir p. vedijos haplotipas A. iaurs Skandinavija haplotipas B. kotija
pagrinde A, bet polimorfinse populiacijose rastas ir B. Europos p. puies populiacij mtDNR
genomai skirtingi ir atspindi i motinos pavedimus poledynmeio vykusios emigracijos
dsningumus. Ivados: (a) Aukta Ispanijos populiacij vairov: tai palikuonys pietins arealo
dalies populiacij pabgusi nuo ledyno ir natraliai augusi prie ledynmet; (B) Po
ledynmeio, p. puies pasklidimas vyko i 3-j pagrindini adaptacini aplink: Ispanija,
centrin Europa ir iaurin Skandinavija; (C) mtDNR tyrimai gali atskleisti ri vystymosi
dsningumus bei ekologini populiacij grupi ribas.


2.1.6. pav. RLFP molekulini ymen sistemos etapai.




23

2.1.7 pav. RFLP analizs DNR hibridizacijos procedra. Tikslas- prie sukarpyt DNR
fragment prijungti specialiai pagamintus radioaktyvius DNR markerius. Radioaktyvs
markeriai (ang. probe) jungsis tik prie t DNR fragment, kurie turs jiems tinkanias DNR
nukleotid sekas. Radioaktyvus DNR markeris tai trumpa vienos grandins DNR molekul
(pvz. tam tikro geno dalies kopija).


2.1.8 pav. RFLP rezultat interpretacija Genotipe A mutacija sudar nauj restriktazs
atpainimo viet DNR markerio atpainimo regione= Genotipas A turs 2 fragmentus.
Genotipas B tik vien.

Polimerin grandin reakcija (PGR ang. PCR) tai nebrangus ir greitas specifini DNR
atkarp pagausinimo (amplifikacijos) metodas, galintis per keliolika minui pagaminti
tkstanius specifini DNR fragment i nedidelio kiekio DNR. PGR ciklas susideda i 3
etap (2.1.9 pav.): (1) DNR ivyniojimas: auktoje temperatroje dviguba DNR grandin
isivynioja ir tampa prieinama jungiai su vienos DNR grandins specialiai tam pagamintais 2
pradmenimis; (2) Pradmen prijungimas: sumainus temperatr, DNR pradai prisijungia prie
bandomos DNR molekuls atkarpose, kuri sekos sutampa su prado sekomis; (3) DNR
sintez: paklus temperatr, pradedant nuo pradmens, sintetinama nauja DNR grandin DNR
polimerazs enzimo pagalba pagal bandomos DNR nukleotid sekas. Ciklas kartojamas kelis

24
kartus; kuo daugiau cikl tuo daugiau pagaminama DNR fragment. Pagausinti fragmentai
matomai elektroforezs gelyje (2.1.10 ir 2.1.11 pav.).

2.1.9 pav. PGR veikimo principas. Viruje parodyti analizei reikalingi reagentai ir ranga
(PGR gausintuvas, kuris gali tiksliai ir greitai kaitalioti temperatr)). 1 etapas: temperatra
keliam iki 95 C ir DNR vijos atsiskiria; 2 etapas temperatra mainama iki 54C, pradmenys
prisijungia prie tiriamosios DNR ir 3 etapas, paklus temperatr iki 72, vyksta naujos DNR

25
sintez. ie etapai sudaro vien PGR cikl. Paprastai PGR analiz susideda i 50 ir daugiau
cikl taip pagausinat tkstanius specifini DNR fragment, kuri ilgis nusatomas
elektroforezs metodu.


Elektroforez i viraus
DNR
fragmentai
Gelis

2.1.10 pav. PGR rezultat vizualizacija elektroforezs metodu. PGR bdu pagausinti DNR
fragmentai atskiriami elektroforezs pagalba. Principas: veikiant elektros srovei, neigiam
krv turini DNR fragment judjimo greitis gelyje priklauso nuo j dydio.



2.1.11 pav. Elektroforezs gelis (kairje) ir aparatas (deinje).

Svarbiausi PCR aspektai. Pradmenys: trumpos DNR atkarpos (10-30 bp), naudojamos
kaip nauj DNR grandini sintezs pradai. Pradmuo prijungia prie specifins DNR vietos.
Pradmen prisijungimas: po to kai paklus temperatr DNR grandins isiskiria, temperatra
ltai mainama, kad pradmenys galt prisijungti. Reikalingas kariui atsparus DNR
polimerazs fermentas. Paprastai pagausinami 150-3000 bp ilgio DNR fragmentai. Svarbu,
kad DNR pilnai isivyniot paklus temperatr. Optimali pradmen prisijungimo

26
temperatra ir optimali DNR sintezs temperatra. Cikl skaiius (optimalus fragment
skaiius). Ilgesnis paskutinis DNR sintezs etapas, kad susintetinti pilnai udarus
fragmentus. Pradmenys vieni i svarbiausi aspekt skmingai analizei, kadangi tikslas yra
pagausinti kuo daugiau polimorfini DNR sek. Pradmens ilgis: trumpas- pagausins daug
fragment, ilgas- maai (optimalus dydis 10 - 30 bp). Pusiausvyra tarp G-C ir A-T nukleotid.
Pradmen poros DNR sekos nebt komplimentarios viena kitai.
Atsitiktinai pagausinta polimorfin DNR (ang. Randomly amplified polymorhic DNA
(RAPD)) tai molekulini ymen sistema, kai polimerins grandinins reakcijos bdu
pagausinami DNR fragmentai, naudojant 10 bp dydio atsitiktins sekos pradmen
(naudojami identikos sekos pradmenys - vienos grandins trumpos DNR atkarpos). Paprastai
amplifikuot fragment dydis 500-5000 pb (vidutinio dydio genomuose pagausinama 5-10
skirtingo dydio DNR fragment). Pagausinti fragmentai sudaro pakankamai DNR, kas
leidia juos atskirti agarozs gelio elektroforezs bdu, paymint pradmenis etidio bromidu,
kuris vieia UV viesoje (2.1.12 pav.). Lyginant genotipus, RAPD parodo skirtumus tarp
pradmen prisijungimo viet pasikartojimo atstum (t.y. specifini DNR sek buvimo viet
skaiiaus).



2.1.12 pav. RAPD rezultat interpretacija. Lyginant genotipus, RAPD parodo skirtumus tarp
pradmen prisijungimo viet pasikartojimo atstum (t.y. specifini DNR sek buvimo viet
skaiiaus). Polimorfizmas (skirtingumas) priklauso nuo specifini fragment isidstymo
danio skirtum tarp lyginam genotip. Pradas jungsis DNR vietose kur nukleotid sekos
atitiks prado sekas. Jei A ir B genotipai yra skirtingi, j nukleotid sekos taip pat yra
skirtingos ir intervalai tarp pradui tinkani sek pasikartojimo bus skirtingi, todl bus
pagausint) skirtingo ilgio fragmentai.



27
RAPD privalumai: (a) Nereikia i anksto inoti pradmen sek (galima sigyti atsitiktini
sek pradmenis i komercini moni); (b) Pakanka palyginti nedidelio DNR kiekio (5-20
mg); (c) Darbo ir kat poiriu efektyvi polimorfizmo paieka, (d) Nereikia darbo su
radioaktyviomis mediagomis, (e) Paprastesnis ir pigesnis nei RFLP. Trkumai: (a) Negalima
atskirti homozigotini ir heterozigotini genotip (dominantinis ymuo); (b) Jautrumas
aplinkos slygoms ir prastas pakartojamumas (dl jautrumo DNR kokybei, PGR slygoms-
gaunami skirtingi fragmentai, kadangi vienose slygose dl atsitiktinumo pradmuo gali ir
neprisijungti prie vienos i keliolikos prisijungimo viet); (c) Vienodo ilgio DNR fragmentai,
gali bti skirtingos nukleotid sudties (komigracija). RAPD rezultat panaudojami kit
molekulini ymen sistem tobulinimui: atsitiktinai pagausinta PGR (AP-PGR (arbitrary
primed PGR))- naudojami ilgesni pradai, gaunam maiau fragment; DAF (ang. DNA
amplification fingerprinting)- naudoja trumpesnius 5-8 bp dydio pradus, kad gauti didesn
fragment skaii gelyje;
SCAR: neaik, susiliejusi (tariam polimorfinmis) DNR fragment grupi (bang
gelyje) po PGR analizs tikslesnis palyginimas (naudojami du skritingi DNR fragment
identifikuojantys pradai); CAPS nepolimorfini bang gelyje tikslesni tyrimai: fragment
pagausinimas ir j sukarpymas restriktazmis, ko paskoje atkleidiamas DNR
polimorfizmas.
Amplifikuot fragment ilgio polimorfizmas (ang. Amplified Fragment Length
Polymorphizm (AFLP)) tai DNR ymen sistema, leidianti nustatyti nukleotid sek
skirtumus tarp DNR molekuli (genetinius skirtumus), pagal specialiais enzimais sukarpyt,
speciali ymen atrinkt ir polimerins grandins reakcijos (PGR) pagausint DNR
fragment dyd (2.1.13 pav.). AFLP tai restriktazi karpymo tikslumo ir PGR efektyvumo
derinys. Dominantin sistema, nes polimorfizmas nustatomas pagal tam tikr sek buvim
arba nebuvim (PGR pradai jungiasi arba ne). Tiksli technologija, leidianti nustatyti
skirtumus tarp individuali genotip. Galima analizuoti tiek bendr genomin DNR tiek
komplimentari DNR (cDNR). AFLP rezultat interpretacija. AFLP nustato DNR skirtumus
(skirting nukleotid buvim) restriktazi jungimosi vietose ar netoli nuo j. Viena PGR
prad pora produkuoja daug DNR fragment, i kuri 10-20 parastai bna polimorfiniai (gali
bti naudojamos kelios restriktazi PGR prad kombinacijos, kas padidint polimorfizmo
aptikimo tikimyb). Kuo stipresn prad atrenkamoji geba (1+2; 1+3 ar 1+4 nukleotidai) tuo
maiau fragment bus atrenkama. Paprastai fragmentai gelyje vertinami kaip dominantiniai
ymenys (0-yra, 1 nra), taiau alternatyvins alelio formos gali bti identifikuojamos kaip
nedideli tarpai ar itrynimai restriktazs jungimosi sekoje (reikalinga aukta gelio

28
rezoliucija). AFLP privalumai: gebjimas atskleisti polimorfizm (generuoja daug fragment)
ir geras rezultat pakartojamumas (ne taip jautrs reakcijos slygoms kaip RAPD); nereikia i
anksto inoti prad sek; ypa naudinga norint greitai sukurti genolapius ir nustatyti tikslius
cDNR polimorfizmus; AFLP trkumai: generuoja daug fragment, kuri analizei gali reikti
kompiuterizuotos sistemos; pagrinde dominantiniai ymenys. Panaudojimas: genolapiuose
AFLP danai randasi netoli telomer (chromosom gal) ar cetromer (vidurio); auktos
darbo snaudos ir sudtinga technin ranga; genetins vairovs tyrimai; cDNR
polimorfizmas; QTL ymen paiekos tyrimai (genotipo-fenotip ryiai ir genolapiai);
genotip (pirt antspaud) identifikacija.
Restriktaz
Bandoma DNR
Adapteris
Adapteris
Pradas
Pradas
Pradas
Pradas
Restriktaz
Bandoma DNR
Adapteris
Adapteris
Pradas
Pradas
Pradas
Pradas


2.1.13 pav. AFLP sudaro 4 pagrindiniai etapai: (1) DNR sukarpymas 2 skirtingomis
restriktazmis (danai ir retai kerpanti; fragment dydis ~80-500 bp); (2) Vienos DNR
grandins adapteri prijungimas (lipni fragment gal neutralizavimas); (3) Tam tikr
DNR fragment atranka ir pagausinimas dviej pakop PGR cikl ir speciali prad pagalba
(prad gamyba- restriktazs seka + 1 ir +2 ar 5 nukleotidai); (4) DNR polimorfizmas
nustatomas elektroforezs pagalba (poliakrilamino gelis, sidabro nitratas + UV viesa ar
radioizotopai, vytintys markeriai) (paprastai gaunama 50-100 skirtingo dydio fragment).

Specifini sek atkarp (sequence tagged sites (STS)) molekulini ymen sistem
grup sudaro tokios ymen sistemos: (a) Specifini sek atkarpos (STS); (b) Mikrosatelitai

29
arba kartotini sek atkarpos (SSR); (c) Apibrt sek atkarpos (SCAR); (d) Pagausintos ir
sukarpytos polimorfins sekos (CAPS); (e) Kartotini paprast sek intarpai (ISSR).
Specifini sek atkarp ymenys tai unikali DNR nukleotid sek atkarpos, kuri vieta
chromosomoje yra inoma (paprastai 200-400 bp ilgio sekos, pagausimos PGR pagalba).
Skirtingai nuo atsitiktini RAPD prad, STS pradai parenkami taip, kad paenklint
specifines DNR vietas. STS yra pagrinde kodominantiniai ymenys. Pakartotini STS
ymen analizs rezultat tapatumas yra didesnis, kadangi naudojami ilgesni pradai nei
RAPD. Radus specialias sekas identifikuojanius ymenis, tolesnis darbas palengvja ir
prigysta standartinms PGR analizms. Rasti STS nelengva vienas i efektyviausi bt
cDNR bibliotekos ir EST ymen polimorfizmo tyrimai (EST 200-400 bp atkarpos
identifikuojanios cDNR galus).
Mikrosatelitai (kartotini sek atkarpos (SSR)) tai trumpos DNR atkarpos, sudarytos
i viena po kitos pakartot keli nukleotid dydio sek (pvz. AT-AT-AT), ymenys tai
paprastai 20-25 bp ilgio DNR atkarpos supanios kartotini sek atkarpas (2.1.14 pav.).
Mikrosatelitai dar vadinami SSR (ang. simple sequence repeats) kartotini sek atkarpos
(sekos ilgis 2-6 bp, paprastai 2-4 bp (AT)n (AG)n, (TCT)n, (TATG)n)). (AT)n bdingi
augalams. Tam, kad identifikuoti SSR, reikia inoti juos juosiani DNR atkarp sekas
(pakankamo ilgio, kad identifikuoti iuos regionus, paprastai 20-25 bp), pagal jas gaminti
specialias vienos grandins DNR atkarpas- PGR pradmenis. Turint pradmenis
identifikuojamas ir PGR pagalba pagausinamas unikalus SSR regionas (t.y. nustatomi vieno
lokuso aleli skirtumai). Mikrosatelitai parodo paprast sek pasikartojimo skaiiaus
skirtumus tarp lyginam genotip (kartotini sek atkarpos ilgio polimorfizm).
ATG()ATA AT-AT-AT-AT-AT ATG()GTT
pvz. 25 bp
pvz. 25 bp
DNR
Pradmen atpastamos sekos, identifikuojanios mikrosatelit atkarp
Paprast sek (AT) pasikartojimo
atkarpa, kur AT atkartota 5 kartus
kartotin seka
ATG()ATA AT-AT-AT-AT-AT ATG()GTT
pvz. 25 bp
pvz. 25 bp
DNR
Pradmen atpastamos sekos, identifikuojanios mikrosatelit atkarp
Paprast sek (AT) pasikartojimo
atkarpa, kur AT atkartota 5 kartus
kartotin seka


2.1.14 pav. Mikrosatelit ymen sistemos veikimo principas.


30
Privalumai: pakanka slyginai nedaug ir ne tokios aukto kokybs DNR kaip RFLP;
efektyvus polimorfizmo atskleidimas; kodominantinis, danai tinkanti gimining ri
analizei; auktas rezultat pakartojamumas, efektyvus automatizuotas darbas, aikiai
atskiriamos segment bangos. Trkumai: kartotini sek region identifikuojani DNR
atkarp nustatymo poreikis; santykiai auktesni katai nei RAPD. Panaudojimas:
genotip (pirt antspaud) identifikacija; QTL ymen paiekos tyrimai (genotipo-
fenotip ryiai ir genolapiai); populiacij genetins vairovs tyrimai ir identifikacija;
evoliuciniu proces studijos (ri emigracija, gen migracija).
Pagausinti specifini sek regionai (ang. sequence characterized amplified regions
(SCAR)) tai RAPD analizs tsinys, panaudojant polimorfinius ar neaikius RAPD
fragmentus juos identifikuojani ymen gamybai ar tikslesniam tyrimui (2.1.15 pav.).
SCAR ymenys tai 16-24 bp ilgio specifini RAPD fragment galai.

.1.15 pav. SCAR molekulini ymen sistema. RAPD gelyje identifikuojamas dominantis
,
mas
ranaumai: auktesn rezoliucija ir rezultat pakartojamumas nei RAPD (pagrinde dl to,

d amplified polymorphic
SCAR ymuo 1 SCAR ymuo 2
Polimorfinis RAPD fragmentas
DNR
SCAR ymuo 1 SCAR ymuo 2
Polimorfinis RAPD fragmentas
DNR

2
DNR fragment klasteris (banga) (pvz. polimorfinis fragmentas). i banga izoliuojama gelio
ir sekvenuojama. Nustatomi specifiniai fragment identifikuojantys PGR pradmenys
(paprastai 16-24 bp ilgio) i vieno ir kito fragmento galo. ie fragmentai naudojami kaip
ymenys (PGR pradmenys) pakartotinje tos paios mediagos analizje (paprastai gauna
neperpildytas, paprastesnis bang profilis).

P
kad ilgesni pradai); galima atskirti kodominantinius lokusus. Trkumai: specifini ymen
gamyba (klonavimas bakterijas, sekvenavimas); gali prireikti specifini ymen keliolikai
lokus (jei yra daugiau RAPD polimorfini bang); aptinka skirtumus ne visame genome, tik
maoje jo dalyje (paprastai apie 5000 bp dydio fragmentuose).
Pagausintos ir sukarpytos polimorfins sekos (ang. cleave
sequence (CAPS)) tai RAPD analizs tsinys, panaudojant tam tikrus RAPD fragmentus ju
identifikuojani ymen gamybai ir tikslesniam tyrimui, sukarpant pagausintus fragmentus
restriktazmis. CAPS metodas paveria neaikius ar nepolimorfius RAPD pagausintus
fragmentus maesnius daugiau vairovs atskleidianius fragmentus. Lyginant su RFLP,
os

31
nereikia daug darbo reikalaujani Soutern hibridizacijos ir radioaktyvi markeri
elektroforezs. Panaus SCAR tik turi tolesn ingsn DNR sukarpym restriktazmis.
Kartotini paprast sek intarpai (ang. inter-simple sequence repeats (ISSR)) tai
ymen sistema, yminti DNR sekas esanias tarp paprast kartotini sek (mikrosatelit ar
SSR). ISSR principas: PGR pagausinimas naudojant PGR pradmenis (ISSR ymenis)
pagamintus pagal mikrosatelit (SSR) sekas (2.1.16 pav.). Amplifikacija arba bus arba ne, t.y.
ISSR yra dominantiniai ymenys. Pranaumai: jei atlikta SSR analiz ar duomenys rasti
bibliotekose, nereikia i anksto inoti ymen DNR sek; keliolikos lokus analiz vienu
metu; efektyviai atkleidia polimorfizm; individuali genotip identifikacija. Trkumai:
dominantiniai ymenys; gali prireikti darbo su radioaktyviomis mediagomis rezultat

vizualizacijai po elektroforezs.
2.1.16 pav. ISSR molekulini ymen sistema. ISSR ymenys (PGR pradai) identifikuojami
GR pagrstos ymen sistemos sudarytos i toki nauj strategijos: (a) Ireikt sek
ymeny
Dviguba DNR
grandin
CACACACACACACA
C A C A C A C A C A C A C A
GTGTGTGTGTGTGTG
G T G T G T G T G T G T G T G
NNNNNNNNNN|NNNN
ISSR ymuo
ISSR ymuo
DNR atkarpa, kuri pagausins
(payms) ISSR ymenys (N=
bet kokie nukleotidai)
NNNNNNNNNN|NNNN
Paprastos kartotins sekos
(CA)n
Dviguba DNR
grandin
CACACACACACACA
C A C A C A C A C A C A C A
GTGTGTGTGTGTGTG
G T G T G T G T G T G T G T G
NNNNNNNNNN|NNNN
ISSR ymuo
ISSR ymuo
DNR atkarpa, kuri pagausins
(payms) ISSR ymenys (N=
bet kokie nukleotidai)
NNNNNNNNNN|NNNN
Paprastos kartotins sekos
(CA)n

i mikrosatelit sek pratsiant jas vienu ar keliais nukleotidais: galima naudoti vien PGR
pradmen; du skirtingus pradus (pratst nukleotid skirtumai tiek kartotini sek skirtumai);
derinyje su atsitiktiniu RAPD pradu.
EST ymenys EST ymenys
2.1.17 pav. EST ymen sistema.

P
s (EST); (b) DNR mikro gardeli technologija; (c) Pavieni nukleotid polimorfizmas
(SNP). Ireikt sek ymenys (ang. Expressed sequence tags EST) tai dalins ireikt gen
DNR nukleotid sekos (paprastai 200-500 bp), kurias naudojant kaip polimerins grandinins
DNR
Genas
DNR
Genas
DNR
Genas

32
reakcijos (PGR) pradmenis galima identifikuoti ir pagausinti ireiktus genus (2.1.17 pav.).
EST ymenys gaunami sekvenavus vien ar abu ireikto geno (komplimentarios DNR
(cDNR)) galus. Genas nustatomas i cDNR bibliotek ar speciali ymen sistem pag
(pvz. cDNR-AFLP, DNR mikro sekos). Geno funkcija nustatoma pagal gen iraikos vietas
(augalo audinius) ir pagal atsak aplinkos signalus ar stres. EST ypa efektyvi kandidatini
gen paiekos ymen sistema. Miko medi EST efektyvi tokia tyrim seka: genotipai
bandomi tam tikroje aplinkoje; i specifini audini, kuriuose vyksta atsakas stres,
izoliuojama iRNR (geno kopijos); i j sintetinamos stabilesns cDNR molekuls; atsi
bdu atrinktos cDNR dalinai sekvenuojamos ir lyginamos su cDNR bibliotekose esaniomis
inomos funkcijos cDNR sekomis; nustaius atitikimus, pagaminami EST ymenys,
identifikuojantys tam tikr gen ar jo alel. Jei nerandama panai sek bibliotekose
naudojamas cDNR+AFLP=EST metodas: tikslas identifikuoti tam tikrose aplinkos
ireiktus genus ir i j pagaminti EST ymenis (2.1.18 ir 2.1.19 pav.).
alba
tiktiniu
e
2.1.18 pav. cDNR+AFLP=EST EST ymen krimo metodas. Elektroforezs gelyje bus
e,

matomi po 2-j atrankos cikl patek DNR fragmentai. Polimorfiniai fragmentai- tai
bandomose slygose ireikto geno dalys (genotipai identiki, skirtumas tik aplinkos slygos
kurios takavo skirting gen iraik). ie fragmentai izoliuojami i gelio, sekvenuojami ir
pagaminami EST ymenys tolesniam ibandymui.


33
EST Pranaumai: ypatingai naudingi kaip genetiniai ymenys; kodominantiniai (gali atskirti
heterozigotinius genotipus); ymen sekas galima palyginti greitai sukurti; efektyvus
panaudojimas kit ymen sistem tobulinimui (pagrinde PGR pradai, SSR, SNP). Trkumai:
iRNR izoliavimas gali bti sudtingas (iRNR trapi molekul); genetins vairovs tyrimams
btu naudinga ir intron DNR vairov (kurios nra ireiktoje cDNR). Panaudojimas. EST
naudojimas pagrstas tuo, kad ie ymenys yra gen dalys. Naudojami kaip PGR pradai
tikslinio geno identifikacijai ir tolesnei geno polimorfizmo paiekoje populiacijoje su kitomis
ymen sistemomis, pvz. pavieni nukleotid polimorfizmo (SNP) ymen paiekoje.
(ypa naudingi QTL tyrimuose ir naudojimui selekcijoje). Naudojami kaip hibridizacijos
markeriai RFLP ir AFLP ar DNR mikro gardelse. Genetins vairovs nustatymo tyrimuose.
Duomen bazse kaip gen yminios sekos. Bibliotekose yra nemaai cDNR i Pinus
radiata, Pinus tadea, Picea abies, Populus ir Eucalyptus ireikt gen (pvz.
ww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) ar sekvenuot EST (http://dendrome.ucdavis.edu/gen_res.htm).


2.1.19 pav. Puies gen atsaking u gravitacin kontrol cDNR paieka. Bandymo tikslas
identifikuoti EST gen atsaking u gravitacin kontrol (medi augim tiesiai). Sjinukai
laikomi pakreipti, bet augdami isitiesina. Stiebo ilenkimuose izoliuojama iRNR ir lyginama
su kontrols medeli tos paios stiebo dalies audini iRNR bei atitinkani sek paieka
bibliotekose.

DNR mikro gardels (ang. DNA microarrays) tai trumpos daugel gen
reprezentuojanios DNR atkarpos sistemingai idstytos gardelse ant stiklo ar neilono
plokteli, kurios naudojamos hibridizacijai su tiriam genotip DNR (2.11 pav.). i
technologija leidia analizuoti daug gen vienu metu. Principas: bandom genotip DNR

34
fragmentai hibridizuojami (jungiami) su gardelse esaniomis inom gen dalimis (pagrinde
cDNR fragmentai). Tikslas nustatytai kokie genai kada ir kaip stipriai yra ireikti tam tikroje
medio fiziologinje bsenoje (2.1.20 pav.). Tai metodas, leidiantis vienu metu nustatyti
tkstani gen iraik, pagal iRNR iraikos intensyvum.



Fragmento dydis 25 bp
DNR mikro gardel
DNR ploktel sudaryta i
daugybs mikro gardeli
Fragmento dydis 25 bp
DNR mikro gardel
DNR ploktel sudaryta i
daugybs mikro gardeli


2.1.20 pav. DNR mikro gardels pavyzdys. Gardelje esantys DNR fragmentai tai inom
gen atkarpos, pagal j jungtis su tiriama DNR nustatoma ar i DNR yra tam tikr gen dalys.



35
0
100
200
300
400
500
I
n
t
e
n
s
y
v
u
m
a
s
Vlyva augimo pradia
135791
1
1
3
1
5
1
7
1
9
2
1
2
3
2
5
2
7
2
9
3
1
3
3
16
3
6
5
6
7
6
9
7
1
7
3
7
8
7
8
9
9
1
9
3
9
5
9
7
Genai
0
100
200
300
400
500
Ankstyva augimo pradia
135791
1
1
3
1
5
1
7
1
9
2
1
2
3
2
5
2
7
2
9
3
1
3
3
3
5
3
7
3
9
4
1
4
3
4
5
4
7
4
9
5
1
5
6
5
6
7
6
9
DNR
RN RNR R
Baltymai Baltymai
Branduolys
DNR
Lstel Lstel
DNR mikro
ploktels
RN RNR R
DNR mikro
ploktels
I
n
t
e
n
s
y
v
u
m
a
s
Genai
Sprogstantis
pumpuras
Nesprogstantis
pumpuras
Pagal Benfey P. 2004.
Essentials of genomics.
Prentice Hall, 400 p.
0
100
200
300
400
500
I
n
t
e
n
s
y
v
u
m
a
s
Vlyva augimo pradia
135791
1
1
3
1
5
1
7
1
9
2
1
2
3
2
5
2
7
2
9
3
1
3
3
16
3
6
5
6
7
6
9
7
1
7
3
7
8
7
8
9
9
1
9
3
9
5
9
7
Genai
0
100
200
300
400
500
Ankstyva augimo pradia
135791
1
1
3
1
5
1
7
1
9
2
1
2
3
2
5
2
7
2
9
3
1
3
3
3
5
3
7
3
9
4
1
4
3
4
5
4
7
4
9
5
1
5
6
5
6
7
6
9
DNR
RN RNR R
Baltymai Baltymai
Branduolys
DNR
Lstel Lstel
DNR mikro
ploktels
RN RNR R
DNR mikro
ploktels
I
n
t
e
n
s
y
v
u
m
a
s
Genai
0
100
200
300
400
500
I
n
t
e
n
s
y
v
u
m
a
s
Vlyva augimo pradia
135791
1
1
3
1
5
1
7
1
9
2
1
2
3
2
5
2
7
2
9
3
1
3
3
16
3
6
5
6
7
6
9
7
1
7
3
7
8
7
8
9
9
1
9
3
9
5
9
7
Genai
0
100
200
300
400
500
Ankstyva augimo pradia
135791
1
1
3
1
5
1
7
1
9
2
1
2
3
2
5
2
7
2
9
3
1
3
3
3
5
3
7
3
9
4
1
4
3
4
5
4
7
4
9
5
1
5
6
5
6
7
6
9
DNR
RN RNR R RN RNR R
Baltymai Baltymai
Branduolys
DNR
Lstel Lstel
DNR mikro
ploktels
RN RNR R RN RNR R
DNR mikro
ploktels
I
n
t
e
n
s
y
v
u
m
a
s
Genai
I
n
t
e
n
s
y
v
u
m
a
s
Genai
Sprogstantis
pumpuras
Nesprogstantis
pumpuras
Pagal Benfey P. 2004.
Essentials of genomics.
Prentice Hall, 400 p.


2.1.21. Mikro gardeli panaudojimo miko medi bandymuose pavyzdys: gen susijusi
sezoninio augimo pradios kontrole paieka.

SNP (ang. Single nucleotide polymorphism) tai ymen sistema galinti nustatyti vieno
nukleotido pokyius tarp homologini DNR sek (homologins: panaios pagal struktr,
viet ir funkcij~ alternatyvios geno formos) (2.1.23). Augaluose, dauguma DNR skirtum
tarp genotip (DNR polimorfizmas) yra dl vieno nukleotido vietos pokyio tikslinje DNR
sekoje (vadinamas vieno nukleotido polimorfizmas). Tikslas: inom gen alternatyvi form

(aleli) paieka.
.1.23 pav. SNP principas.
NP ir juos yminios specifins gretimos DNR nukleotid atkarpos randamos:
2

S
SNP ymuo
CTCAGACA
CTG GAGT T
Vieno nukleotido pokytis
Genotipas B
GAGT T
Vieno nukleotido pokytis
SNP ymuo
ATG
CTCA A TAC
Genotipas A
SNP ymuo SNP ymuo
CTCA
GAGT T
GACA
CTG
Vieno nukleotido pokytis
Genotipas B
SNP ymuo
CTCA
GAGT T
GACA
CTG
Vieno nukleotido pokytis
Genotipas B
GAGT T
Vieno nukleotido pokytis
SNP ymuo
ATG
CTCA A TAC
Genotipas A
SNP ymuo
GAGT T
Vieno nukleotido pokytis
SNP ymuo
ATG
CTCA A TAC
Genotipas A
CTCA A TAC
Genotipas A
SNP ymuo SNP ymuo

36
(a) sekvenuojant (ar hibridizuojant mikro gardelse) polimorfinius PGR fragmentus,
pagausintus naudojant EST ymenis polimorfinse populiacijose (kilms, klon archyvai); (b)
analizuojant cDNR sek duomen bazse esanias gen sekas (vadinami eSNP). Paprastai
SNP randamas kas 1000-2000 nukleotid. inant SNP viet yminias DNR atkarp sekas,
tolesnis SNP taikymas enklai palengvja naudojant DNR mirko sekas ar PGR ir automatinio
sekvenavim.


2.1.24 Molekulini ymen panaudojamas miko medi tyrimuose (FAO 2004).










37
2.3 Kiekybiniu poymi lokusai

Kiekybini poymi lokusai (ang. quantitative trait loci (QTL))- tai vietos
chromosom DNR, kuriose yra genai, slygojantys kiekybinius poymius. QTL vietas ymi
molekuliniai ymenys. Dauguma ekonomikai svarbi poymi yra slygojami daugelio gen
(poligen). ie genai vadinami kiekybiniais, nes kiekvieno geno tak galima ireikti skaitine
verte (kiekybe). Kiekybini gen vietos chromosomose vadinamos lokusais (kiekybini
poymi lokusai- QTL) (2.1.25 pav.). Tarp j yra genai turintys didesn tak poymiui
(pagrindiniai genai). Galima surasti molekulinius ymenis susjusius su pagrindiniais genais
ir naudoti kaip pagalbin priemon atrenkant individus. Individ atranka, panaudojant
informacij apie genetinius ymen ssajas su genais, vadinama atranka ymen pagalba
(angl. MAS: marker asssisted selection).

20% 50% 15% 5% 5% 5%
ymuo
QTL2
QTL1
QTL3
20% 50% 15% 5% 5% 5%
ymuo
QTL2
QTL1
QTL3

2.1.25 pav. QTL samprata. Kiekybin poym slygojantys stipresns takos genai, kuri
vietos chromosomose vadinamos kiekybinio poymio lokusais.

Jeigu visi poym takuojantys genai turt vienod tak, btu sunku juos visus atskirai
identifikuoti ir naudoti selekcijoje. Kai kurie genai turi didesn tak ar takuoja kit gen
veikl. Tikslas rasti ymenis susijusias su iais genais, galutinis tikslas- rasti paius genus.
ymen ir QTL ssajos nustatymo komponentai: (a) polimorfin populiacija ir poymis (daug
skirting tikslinio geno form) ir bent vienas i tv heterozigotinis; (b) tinkama ymen
sistema tikslinio poymio QTL paiekai; (c) kryminimai (testas ar bus ymenys atskirti nuo
gen rekombinacijos metu); (d) palikuonys- QTL nustatymo populiacija (poymi (QTL
buvimo) ir ymen ssajos vertimas; (e) specifiniai ymens ir QTL ssajos vertinimo
statistiniai metodai (2.1.26 ir 2.1.27 pav.).








38
Lytins
lstels
iedadulkse
Hipotez: netiesioginis ymuo M susijs su
teigiamu genu (G), ymuo m susijs su
neigiamu genu (g)
5 nerekombinantiniai
genotipai (QTL ir
ymuo vienoje
sukibimo grupje)
3 rekombinantiniai
genotipai (38 %) (QTL
ir ymuo nesusiej
nes buvo atskirti)
Principas: kuo silpniau ymuo susiejs su
genu, tuo toliau yra j lokusai chromosomoje,
tuo daniau juos atskiria rekombinacija
Rekombinacija: lytin lsteli
formavimo metu i tvo ir motinos
gautos porins chromosomos
pasikeia dalimis. Galimi 4 genotipai:
M-G; M-g; m-G; m-g
Porins chromosomos
M

2.1.26 pav. ymen ir QTL ssajos nustatymo principas. QTL nustatomi vertinant ssajas
tarp molekulini ymen ir tikslini poymi prie ir po rekombinacijos (tvai- kryminimai -
palikuonys). Tikrinama ar rekombinacija atskyr fenotipin poym ir molekulin ymen.



2.1.27 pav. QTL nustatymo populiacijos sukrimo principas.

G
m
g
M
G
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
ymuo
Genas
Pakankamo dydio ir
polimorfizmo tvin populiacija
vertinimas, statistiniai metodai
Kryminimas
Lytins
lstels
iedadulkse
Hipotez: netiesioginis ymuo M susijs su
teigiamu genu (G), ymuo m susijs su
neigiamu genu (g)
5 nerekombinantiniai
genotipai (QTL ir
ymuo vienoje
sukibimo grupje)
Principas: kuo silpniau ymuo susiejs su
genu, tuo toliau yra j lokusai chromosomoje,
tuo daniau juos atskiria rekombinacija
3 rekombinantiniai
genotipai (38 %) (QTL
ir ymuo nesusiej
nes buvo atskirti)
Rekombinacija: lytin lsteli
formavimo metu i tvo ir motinos
gautos porins chromosomos
pasikeia dalimis. Galimi 4 genotipai:
M-G; M-g; m-G; m-g
Porins chromosomos
M
G
M
G
m
g
m
g
MM
GG
mm
gg
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
g
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
m
G
ymuo
Genas
Pakankamo dydio ir
polimorfizmo tvin populiacija
Kryminimas
vertinimas, statistiniai metodai
1. Tv parinkimas: turintys norimus
genus, kurie identifikuojami pagal
fenotipinio poymio iraik; poymis turi
bti paveldimas)
Molekulini ymen sistema, galinti
identifikuoti DNR fragmentus susijusius
su tikslinais genais
2. Krymindamas= testas ar
rekombinacija nutrauks
ymens ir geno ssaj?
Pavyzdiui,
ankstyv augim
slygojanius
genus bus galima
identifikuoti pagal
pumpur sprogimo
laik
3. Palikuonys = QTL nustatymo populiacija:
palikuoni vertinimas tikslu nustatyti kiek palikuoni
turjo ir fenotipin poym ir molekulin ymen =
ssajos stiprumas (nuo 100-200 medeli)
Kiekviename etape mediaga ir metodai parenkami taip kad maksimaliai palengvint tikslo
gyvendinim
1. Tv parinkimas: turintys norimus
genus, kurie identifikuojami pagal
fenotipinio poymio iraik; poymis turi
bti paveldimas)
Molekulini ymen sistema, galinti
identifikuoti DNR fragmentus susijusius
su tikslinais genais
2. Krymindamas= testas ar
rekombinacija nutrauks
ymens ir geno ssaj?
Pavyzdiui,
ankstyv augim
slygojanius
genus bus galima
identifikuoti pagal
pumpur sprogimo
laik
Pavyzdiui,
ankstyv augim
slygojanius
genus bus galima
identifikuoti pagal
pumpur sprogimo
laik
3. Palikuonys = QTL nustatymo populiacija:
palikuoni vertinimas tikslu nustatyti kiek palikuoni
turjo ir fenotipin poym ir molekulin ymen =
ssajos stiprumas (nuo 100-200 medeli)
Kiekviename etape mediaga ir metodai parenkami taip kad maksimaliai palengvint tikslo
gyvendinim

39
QTL nustatymo efektyvumas didia dalimi priklauso nuo fenotipinio poymio. Poymi
atrankos kriterijai: gen slygotumo kompleksikumas (vienos ir keli grups susijusi gen)
ir QTL nustatymo lengvumas; ekonomin vert (QTL nustatymas duot taikomj naud).
Tikslins miko medi fenotipini poymi grups: (a) adaptaciniai poymiai (pvz.
fenologija: ramybs bsena, sezoninio augimo pradia ir pabaiga, gli medjimas); (b)
reprodukciniai poymiai (pvz. lytin brada ir asimetrija, ydjimo gausumas, vegetatyvinis
dauginimas); (c) medienos kokyb (pvz. bazinis tankis, chemins savybs, mikrofibrili
kampas); (d) atsparumas kenkjams (galima panaudoti gausi .. kultr patirt). Tokie
poymiai kaip medi auktis ar produktyvumas yra kompleksiniai (keliolikos poymi
grupi sveikos iraika), todl efektyviau pradioje nustatyti i pirmini poymi QTL.
Tinkamiausias poymis: slygojamas nedidelio gen skaiiaus; gen taka- nuo vidutins iki
stiprios; stipriai paveldimas (ribota aplinkos slyg taka). Tam, kad gauti heterozigotinius
individus QTL tyrimams galima naudoti: (a) skriting populiacij palikuonis; du tolimos
kilms ir skirting adaptacini poymi genotip adaptacini poymi lokusai bus
polimorfiniai (skirtingi tam tikro geno aleliai), o dauguma j palikuoni heterozigotiniai; (b)
ri hibridus; du artim ri individai yra genetikai skirtingi daugumoje lokus, todl j
palikuonys bus heterozigotiniai. Tikslinga naudoti stipriai tam tikroje ryje ireikt
poymi QTL identifikacijai (pvz. pendula genas Picea abies poryje ar Pinus contorta
atsparumas aliui).
QTL nustatymo statistiniai metodai. Statistini metod tikslas nustatyti potencialaus
QTL ymens ir poymio ryio esmingum ir QTL ymens tak fenotipinio poymio iraikai.
Reikia paversti DNR fragment buvim gelyje skaiius (0- nra, 1- yra) ir suskirstyti
palikuoni fenotipini poymi vertes pagal kiekvieno fragmento buvimo ir nebuvimo klases
(pagal ymen genotipus). Kiekvienam DNR fragmentui (potencialiam ymeniui), reikia
palyginti palikuoni fenotipinio poymio vidurkius tarp ymen genotip (t.y. nustatyti pvz.
palikuoni aukio skirtumus tarp M1M1 ir M2M2 (kodominantinis ymuo) ar tarp turiniu
ir neturini M fragmento palikuoni (dominantinis ymuo) (2.1.27 pav.): (a) ANOVA, t-
testas, regresija (kodais ireikt ymen genotip ssaja su poymio fenotipu), (b) Chi-
kvadrato testas (kategoriniai kintamieji). Jei skirtumai esminiai- ymuo susijs su atitinkamo
poymio QTL; skirtumo tarp vidurki esmingumas = ymens ssajos su QTL stiprumo
rodiklis. Jei yra daugiau nei vienas potencialus ymuo (ymen polimorfizmas gelyje),
naudojamas interval interpoliacijos (maksimalios tikimybs) metodas (Maximum
Likelihood-Lander & Botstein, 1989), alternatyva Composite Interval Mapping (Linked
markers-Zeng, 1993).

40

2.1.28 pav. QTL nustatymo statistins analizs pavyzdys. Atliekami palikuoni DNR tyrimai:
RFLP metodu nustatomas palikuoni RFLP genotipas (M1M1 ar M1M2); Lauko bandyme
nustatomas palikuoni RFLP genotip augimo pradios laikas (fenotipas =QTL indikatorius).
ANOVA pagalba lyginamas RFLP genotip vidutinis augimo pradios laikas: jei skirtumas
esminis- M ymuo susijs su augimo pradios QTL; skirtumo esmingumas = ssajos
stiprumas.

Kiekybinis poymis gali bti slygojamas keliolikos gen. Sudaromi genus ymini ymen
ssajos su j QTL emlapiai (sankibos grupi emlapiai kiekvienai ymen kategorijai).
Tam tikr QTL ymenys idstomi emlapiuose, kur atstumas tarp dviej ymen
ireikiamas pagal tai kaip danai jie paveldimi vienoje sukibimo grupje. Rekombinacijos
tarp dviej ymen danis ireikiamas centimorganais (cM) = rekombinantini genotip
(ymenys buvo atskirti rekombinacijos metu) procentas. Vienoje sankibos grupje esantys
ymenys ~ atitinka vien chromosom. Nustaius QTL atliekamas QTL testavimas
(tikrinimas). Kandidatini gen identifikacija ir tai alternatyvi geno/QTL form (aleli
paieka). Jei testavimo bandymo metu QTL nebuvo pakartotinai gauti, prieastis gali bti per
maas QTL populiacijos dydis, todl QTL nustatymui reikalingos didesns palikuoni
populiacijos (ypa maos takos QTL nustatymui). Pageidautinas maesnis poymi
kompleksikumas: pvz. vietoje aukio vertinti fenologinius poymius ir fotosintetin
potencial. Nepriklausom tyrim rezultatai turi bti raomi bendrus tam tikrai riai
genolapius (palyginamieji genolapiai). Pavyzdys: Eucalyptus grandis- keli nepriklausomi
tyrimai su skirtingomis eimomis aptiko medienos bazinio tankio QTL homologinse
sankibos grupse (Grattapagia ir kt. 1996, Verhaegen ir kt. 1997).
Miko medi QTL identifikacijos rezultatai. Tiksliniai poymiai: adaptaciniai
poymiai (fenologija, tolerancija aliui, sausrai); reprodukciniai poymiai (lytin branda,
ymens M RFLP genotipai
Alternatyva 1: M ymuo
susijs su augimo pradios
QTL, ssajos stiprumas R
2
=78%
M1M1
A
u
g
i
m
o

p
r
a
d

i
a
2
1
M1M2
Anksti
Vlai
Skirtumas esminis,
p<0,05, R
2
=78%
ymens M RFLP genotipai
Alternatyva 1: M ymuo
susijs su augimo pradios
QTL, ssajos stiprumas R
2
=78%
M1M1
A
u
g
i
m
o

p
r
a
d

i
a
2
1
2
1
M1M2
Anksti
Vlai
Skirtumas esminis,
p<0,05, R
2
=78%
100
400
1200
2000
1 2 3 4 150
f
r
a
g
m
e
n
t
o

d
y
d
i
s

(
b
p
)
M
()
T
a
r
p
i
n
i
s
T
a
r
p
i
n
i
s
Fenotipas
lauko
bandyme
ymuo
RFLP
genotipas
M
1
M
2
M
1
M
2
M
1
M
1
M
1
M
1
T
a
r
p
i
n
i
s
A
n
k
s
t
y
v
a
s
A
n
k
s
t
y
v
a
s
M
1
M
1
100
400
1200
2000
1 2 3 4 150 1 2 3 4 150
f
r
a
g
m
e
n
t
o

d
y
d
i
s

(
b
p
)
M
()
T
a
r
p
i
n
i
s
T
a
r
p
i
n
i
s
Fenotipas
lauko
bandyme
ymuo
RFLP
genotipas
M
1
M
2
M
1
M
2
M
1
M
1
M
1
M
1
T
a
r
p
i
n
i
s
A
n
k
s
t
y
v
a
s
A
n
k
s
t
y
v
a
s
M
1
M
1

41
ydjimo gausumas, lytin asimetrija); atsparumas ligoms ir kenkjams (tolerancija
aliuminiui); medienos kokyb (bazinis tankis, stiebo suktumas, gravitaciniai poymiai,
chemins savybs (celiuliozs ieiga)); kiti poymiai (pvz. egls pendula forma, lap
poymiai, stiebo tiesumas, H, D, aknydamosi energija, dauginimosi gyvaakmis geba).
Rys (eils tvarka): Eukaliptas, Populus gentis, pietins puys, P. egl, p. puis, pocg.
Pagrinde naudotos selekcini populiacij rmuose sukurtos sib eimos: atbuline seka nuo
palikuoni link tv. Naudos ymen sistemos pradedant nuo RAPD, RFLP, AFLP, SSR,
dabartiniu metu: cDNA-AFLP, EST, SNP. Efektyvi tolim populiacij ir artim ri
hibridizacija. Pastaba: tokie poymiai kaip auktis yra ivestiniai, keli kit kiekybini
poymi idava, todl efektyviau sumainti poym takojani gen grupi skaii
(kompleksikum) ir iekoti tiesiogini gen grupi QTL.
Miko medi QTL atradimo rezultatus galima sisteminti pagal tokius kriterijus:
poym slygojani QTL skaiius ir QTL takos stiprumas (kiek QTL slygoja poym ir
kokia QTL taka poymio iraikai?); vairi poymi QTL isidstymas genome
(chromosomose) (ar panai poymi QTL yra netoli vienas kito?); QTL iraikos stabilumas
(ar pakartojus tyrim su ta paia mediaga bus gauti tie patys QTL?). Poymio QTL skaiiaus
ir takos tyrim rezultatai: (a) nors teorikai kiekybiniai poymiai slygojami daugelio geno,
rastas stebtinai maas tam tikro poymio QTL skaiius (vidurkis 2,7 QTL per poym); (b)
QTL slygotas fenotipinio poymio kintamumo procentas vyravo nuo 4 iki 63 %= pagrinde
rasta nedaug bet svarios takos QTL; (c) daugumai poligenini poymi tokias ivadas sunku
pritaikyti; prieastis slyginai maos (<150) palikuoni QTL tyrimo populiacijos (dl aukt
DNR tyrim kat) = buvo aptiktas maesnis QTL skaiius nei i tikrj bei j taka
fenotipiniams poymiams gauta didesn nei i tikrj; (d) todl, galutins ivados dl QTL
skaiiaus ir takos darytinos tik po tolesni QTL testavimo tyrim. QTL isidstymo
chromosomose tyrim rezultatai: (principas- ta pati QTL nustatymo populiacija tiriama
skirtingais ymenimis ir vertinami vairs fenotipiniai poymiai): (a) pagrinde, fenotipikai
susijusi poymi QTL buvo vienodose ar netolimose sankibos grupse; (b) jei QTL taka
vienoda, tai reikia, kad vienas genas koduoja baltym, kuris yra nors ir nevienodai, bet
reikalingas abiem poymiams; (c) jei QTL taka skirtinga: du susij genai ar kit bet susijus
poymi slygojantys genai; (d) jei fenotipikai nesusijusi poymi QTL buvo susij-
pleotropija- vienas genas takoja kelis poymius.




42
2.1 lent. Spygliuoi miko medi ryse rasti QTL (tipiniai pavydiai).
Ris Poymis Kryminimo schema
(palikuoni sk.)
ymen
sistema
Referencija
Pinus elliottii aliuminio tolerancija F1 (186) RAPD Kubisiak ir kt. (1999)
Pinus palustris
x eliotti
sjinuko auktis F1 (72) RAPD Kubisiak ir kt. (1997b)
Pinus pinaster megagametofito svoris; skl dygimo laikas,
sjinuko auktis
F2 savidulka (120) RAPD Plomion ir kt. (1996a)
Pinus radiata kankori skaiius; ak kokyb, stiebo skersmuo F1 (134) RAPD Emebiri ir kt. (1997)
medienos bazinis tankis F1 kratutini genotip
atranka
RFLP, SSR Devey ir kt. 2004
Pinus teada medienos tankis; vlyvos medienos procentas,
mikrofibrili kampas, lstels sieneles chemin
sudtis
F2 (172) RAPD, RFLP Groover ir kt. (1994),
Knott ir kt. (1997),
Brown ir kt. (2003)
chemins medienos savybs F2 (172) RFLP Neatle ir kt. 1997
Skersmuo, auktis F2(172) RFLP, RAPD Kaja ir kt. 1999
Pseudotsuga
menziesii
adaptaciniai poymiai F2 (205) RFLP, RAPD Neatle ir kt. 1997
Picea abies pedula forma; genotip DNR miiniai RAPD Lehner ir kt. (1995)
aurea forma (geltoni sprogstantys gliai) ankstyva
lytin branda
F1 (73) EST, AFLP,
SSR
Achere ir kt. (2004)
medienos bazinis tankis vairios eimos ir
genotip DNR miiniai
AFLP, SCAR Markussen ir kt. (2004)
Pinus sylvestris gli lignifikacijos laipsnis, sjinuk auktis,
augimo pabaigos laikas
F1 (108) pietinis x
iaurinis
RAPD Yazdani ir kt. (2003)
Auktis, skersmuo, gli lignifikacijos laipsnis, ak
kampas,
F1 (95) AFLP Lerceteu ir kt. 2000


QTL iraikos stabilumo tyrim rezultatai: (1) QTL aptikimas ir ireiktumas priklauso nuo
laiko, aplinkos ir genetini faktori; laiko faktoriai: genai jungiami tam tikrame medi
ontogenezs etape (pvz. lytins branda); aplinkos faktoriai: aplinka inicijuoja tam tikr gen
jungim (pvz. pumpur ramybs bsena ar sezoninio augimo pradia); genetiniai faktoriai:
kai kurie QTL bdingi tik tam tikrai eimai; todl vertingiausia QTL aptikti keliose eimose;
(2) stiprios takos QTL greiiausiai yra genai jungjai, priimantys aplinkos signalus ir
inicijuojantys kit gen grupi veikl (pvz. sezoniniai medi fiziologins bsenos pokyiai).
Didesnis QTL stabilumas rastas adaptaciniams poymiams (prieastis= auktesnis
paveldimumas) ir rezistentikumo kenkjams poymiams (maesnis kompleksikumas).

2.2 Genom sekvenavimas, gen identifikacija ir genolapiai.
Tam tikros augal ries genomo sekvenavimas tai genom sudaranios DNR bazi
por sekos nustatymas. Sanger DNR sekvenavimo metodo principas yra toks: sekvenuojama
DNR molekul yra pagausinama PGR bdu, panaudojant ymtus pradmenis ir specialius
nukleotid analogus dideoksinukleotidus, kuri dka kiekvienas pagausintas fragmentas
baigiasi specifiniu nukleotidu (G, T, A ar C) ir yra atskiriamas elektroforezs pagalba
priklausomai nuo savo ilgio (2.18 pav.). Pirmame etape sekvenuojama DNR molekul
pagausinama, naujos DNR grandins sintezei kartu su nukleotidais naudojant j dideoksi
analogus - dideoksinukleotidus (ddG, ddT, ddA, ddC), kurie nutraukia naujos grandins

43
sintez esant j analogams. Amplifikacija atliekama 4 skirtingose mgintuvliuose,
kiekviename j naudojant 4 skirtingus dideoksinukleotidus. Tokiu bdu gaunami skirtingo
ilgio DNR fragmentai, turintys skirtingus nukleotidus DNR atkarp gale. Elektroforezs metu
ddG, ddT, ddA, ddC amplifikuoti fragmentai dedami skirtingus takelius. Elektroforezs
skal ymi fragment ilg. Po elektroforezs, pagal kiekvieno fragmento su inomo galiniu
nukleotidu ilg, nustatoma io nukleoido vieta sekvenuojamoje DNR molekulje. Naujesni
efektyvesni sekvenavimo metodai tokie kaip automatins fluorescencijos (vytjimo) metodas
DNR naudojai sintez nutraukianius dideoksinuokleotidus su vytiniomis molekulmis,
kuri spalva priklauso nuo bazs ATG ar C. Elektroforezje amplifikuoti DNR pavyzdiai
leidiami viename takelyje, nuskaitomi lazerio ir automatikai apdorojami kompiuterio.
Sekvenuojant, yra patogu patalpinti DNR bakterij plazmides, kurios tarnauja kaip
bibliotekos. Prireikus


2. 1.29 pav. Vienas pirmj Sanger DNR sekvenavimo metod (pav. pagal Ranelis 2000).

norima DNR atkarpa gali bti susintetinam specifini iai atkarpai molekulini ymen
pagalba (2.1.29 pav. 1 dalis).
Pagrindins genomo sekvenavimo strategijos skirstomos (a) hierarchin arba klon
gretinimo (angl. Clone by clone), (b) hierarchins strategijos atmain ingsniavim (angl.
walking) ir (c) viso genomo sekvenavim i karto. Hierarchin arba klon gretinimo
sekvenavimo strategijos principai yra tokie: DNR skaidymas daugyb pakankamai ilg

44
segment ir didels bakterij klon kolekcijos sudarymas; DNR fragment sudliojimas
fizinius genolapius; minimalaus fragment persidengimo varianto suradimas; kiekvieno
varianto klono sekvenavimas su Shotgun; fragment apjungimas kaimynysts principu
klon gretinius (angl. contig); vis fragment sujungimas vientis sek. is bdas
panaudotas mieli, kirmli, mogaus, iurks genom sekvenavimui. ingsniavimo
sekvenavimo strategijos principai (kai nesudaromi fiziniai genolapiai): DNR skaidoma
daugyb pakankamai ilg segment ir perteklins bakterijos klon kolekcijos sudarymas;
sekvenavimas kiekvieno klono, pirmiausia parinkus kelet kertini klon (angl. seed clones);
vientisos sekos konstravimas vis pridedant sekvenuotus prie jau esam; tokiu bdu
sekvenuotas ryio genomas. Viso genomo sekvenavimas i karto ivengia genolapi
sudarymo. is bdas taikytas sekvenuojant drozofilos, mogaus, pels, iurks, uns
genomus.

2.1.30 pav. Genom dydis nra proporcingas organizm evoliuciniam lygmeniui.

Naujai sitvirtinantys sekvenavimo metodai. Pirosekvenavimas (angl. pyrosequencing)
- tai kiekybinis metodas (analizuojamos gautos pirogramos), paremtas enzim panaudojimu,
kur galima taikyti ikart visai DNR. is metodas yra pigus ir greitas bei pasiymi trump
DNR atkarp analize. Tai pat perspektyvus sekvenavimas panaudojant nanopor (naumas -
100 mln. bp per 1 dien) (www.ist.temple.edu/~vucetic/ cis595spring2003/)

45
Sekvenavimo rezultatai. Eukariot genomai turi santykinai maai koduojani srii.
Eukariot genomus didija dalimi sudaro kartotins sekos. 2006 m. publikuoti pilni 528
genomai; prokariot vykstantys genom dekodavimai- 1148; eukariot vykstantys genom
dekodavimai- 720 (www.genomesonline.org). Genom dydis nra proporcingas organizm
evoliuciniam lygmeniui (2.19 pav). Kai kurie duomenys apie sekvenuotus genomus pateikti
2.2 lentelje. Augal genomai skiriasi dydiu, ploidikumu ir chromosom skaiiumi:
Arabidopsis- 125.000 Kb; Bananas (Musa)- 873.000 Kb; Lilium- 50.000.000 Kb. Iki 2007 m
vasaros pilnai sekvenuoti augal genomai: Arabidopsis thaliana (Thale Cress, 2000-12-14);
Oryza sativa L. ssp. indica (ryiai), 2002-04-05; Cyanidioschyzon Merolae (raudonieji
dumbliai, anf. Red Alga) 2004 04-08; Oryza sativa ssp. japonica (ryiai), 2005-08-11.
Ostreococcus tauri (Green Alga) 2006-08-01; Populus balsamifera trichocarpa (Balsam
Poplar) 2006-09-15; Ostreococcus lucimarinus (Green Alga) 2007-05-03.

2.2 lent. Kai kurie duomenys apie sekvenuotus genomus.
2 3200 4.7 mln. bp Escherichia coli
(bakterija)
32 6300 12 mln. bp Saccharomyces
cerevisiae (miels)
12 19,100 97 mln. bp Caenorhabditis
Elegans
( li ji ki l)
10 25,500 125 mln. bp Arabidopsis thaliana
(baltaiedis vairenis)
8 13,600 180 mln. bp Drosophila
melanogaster (vaisin
24 ~40,000 450 mln. bp Oryza sativa L.
(ryis)
40 ~30,000 2500 mln. bp Mus musculus
(pel)
42 ~30,000 2,750 mln. bp Rattus norvegicus
(iurk)
46 ~30,000 3,164 mln. bp Homo sapiens
(mogus)
Chromosom
skaiius (2n)
Apytikslis
gen
Dydis, bazins
poros
Organizmas

Nustaius genomo nukleotido sekas, sekantis svarbus udavinys yra j identifikavimas
(anotacija). Genomo anotacija ar iaikinimas tai genus atitinkani DNR sek

46
identifikavimas, siekiant atsakyti klausimus: kiek gen yra ir tam tikrose genomo vietose,
kokius baltymus jie koduoja, kokie yra reguliaciniai mechanizmai ir sveikos schemos. Tai
pagrinde atliekama bioinformatikos technologij pagalba, lyginant neinomas sekas su
inom funkcij DNR sekomis: universalios gen pradios (pvz. ATG kodonas ar TATA
seka) ir pabaigos (pvz. TAG, TGA kodonai) nukleotid sekos, ribosomins kilpos, kartotin
sekos; atsitiktinai isidst nukleotidai bdingi introninms geno dalims. Kiti gen
identifikavimo metodai grindiami homologija su jau inomais genais (naudojant
kompiuterines programas, pvz. GenomeScan kompiuterin programa): (a) zooblotingas, kai
hibridizuojant naujai nustatyto vienos ries geno DNR sekas su inomais kit ri genais,
galima identifikuoti t gen analogus; (b) CpG (C einanio po G) salels, kuri buvimas
nustatytose DNR sekose padeda rasti vis gen; ios salels labiau bdingos bendriniams
(angl. housekeeping) genams, pvz., tokiems, kurie koduoja lstels energetikai btinus
baltymus; (c) egzono terpimas (angl. exon trapping) paremtas iniomis apie tam tikras
nukleotid sekas eukariot genuose yminias introno pradi ir pabaig. Jei gautos mDNR
ilgis pasikeiia, vadinasi svetimos DNR egzonas buvo atpaintas ir prijungtas. Galima ir
tiesiogin gen paieka pasinaudojant jau inom gen EST ymenimis. Idja grindiama tuo,
kad identikos sekos atlieka pana vaidmen ir kituose genomuose. Specialios kompiuterins
programos padeda identifikuoti genus pagal nukleotid sek ireiktum (BLAST, FASTA,
TBLASTN).
Gen iraikos (ekspresijos) analiz tai pagrindinis metodas identifikuojant tam tikrus
poymius kontroliuojanius genus. Gen ekspresija tirti pasirenkamos dvi strategijos (a)
tradicin biologija: iekoma gen, kurie skirtingai pasireikia tam tikros aplinkos slygose
(daniausiai atsaku stres) bei tiria i gen funkcijas ir nustato tiriamo geno sveik su
kitais genais, pvz. vieno genotipo kopijos auginamos skirtingomis slygomis, i atitinkam
audini izoliuojama iRNR ir lyginama su kontrols iRNR, skirtingai ireikta iRNR gali bti
iekom gen produktas; atliekama homologini sek paieka duomen bazse (2.1.31 pav.);
(b) tyrimai paremti mikrogardeli (jau inom gen ymen bibliotek) principu: galima
masin paralelin gen ekspresijos analiz; nedidel genom galima tirti vis ikart; nustato ne
tik atskirus besiskirianius genus, bet ir besiskirianias gen grupes; analiz parodo
santykinio ekspresijos lygio skirtumus; analizuoti galima ne tik atskir molekul, bet ir j
kompleksus; efektyvi funkcin gen analiz; galima identifikuoti reguliacinius ir lsteli
procesus.



47











2.1.31 pav. Gen iraikos analizs principas simuliuojant stres: medis kloduojamas ir jo
kopijos bandomos normaliuose ir streso slygose; i atitinkam audini iskiriam iRNR, i jos
sintetinama cDNR ir tiriami skirtumai tarp cDNR- streso atsakui specifin cDNR gali bti
atsaking gen kopija.

Gen, QTL ir j molekulini ymen identifikacijos tyrim rezultatai paymimi
genolapiuose. Genolapiai bna fiziniai, kur atitinkamose chromosomose paymtos gen,
QTL ar j ymen vietos (lokusai) ir santykiniai (sankibos grupi), kur atstumas tarp gen
ymimas rekombinacij tarp j daniu (matuojamu morganais). Genolapiai pagrinde sudaryti
ioms miko medi gentims ir rims: (a) Populus (Cervera et al. 2001; Yin et al. 2002) P.
deltoides, P. nigra ir P. trichocarpa); (b) Picea (Plomion 2000), P. abies, P. glauca ir P.
mariana; (c) Pinus (Kubisiak et al. 1995; Plomion 2000) including P. brutia, P. edulis, P.
elliottii, P. palustris P. pinaster, P. radiata, P. strobus, P. sylvestris ir P. thunbergii ir (d) kitos
rys Plomion 2000; Butcher et al. 2002; www.pierroton.inra.fr/genetics/Quercus; Acacia
mangium, Cryptomeria japonica, Larix leptolepis, Pseudotsuga menziesii, Quercus robur and
Taxus brevifolia (FAO 2004). Genolapi lyginimas (angl. comparative mapping) gali bti
panaudotas gimining ri bendr arba konsensuso genolapi sudarymui, taip pat QTL viet
nustatymui bei evoliucijos tyrimams, surandant genominius pokyius. Mikrosatelit ymenys
yra tinkami iems tikslams pasiekti, nes jie yra kodominantiniai, bdingi tik tam tikram
lokusui, polimorfiki, tolygiai isidst visame genome, o taip pat gali bti bendrai taikomi
genetikai artimoms rims tirti. Pagal FAO (2004) genomikos tyrimai pagrinde sutelkti
tokia medi gentis: Pinus (32 %), Populus (18 %), Eucalyptus (12 %) ir Picea (9 %).
Svarbiausi poymiai: medienos savybs per lignino kiekio reguliavim (57%), atsparumas

48
sausros ir alio stresui (20%), genetins vairovs nustatymas (8%), augimo greitis (6%),
ydjimo biologija (5%) ir atsparumas biotiniams veiksniams (4).

2.3 Bioinformatika
Bioinformatika tai informacini technologij taikymas biologins informacijos
saugojimui, tvarkymui ir analizei (naudojimui). Biologin informacija tai DNR ir RNR
nukleotid sekos (cDNR, genai, sekvenuoti genomai, molekuliniai ymenys), genolapiai,
koduojam baltym charakteristika, mokslini tyrim rezultatai. Informacins technologijos
tai duomen masyv tvarkymas, analiz ir rezultat pateikimas kompiuterini program
pagalba. Biologins informacij srautai taip padidjo, kad j analiz galima vadinti duomen
kasyklomis (ang. data mining). Brangiai kainuojani biotechnologijos tyrim efektyvumas
priklauso nuo spartaus tyrim rezultat informacijos praeinamumo (kam tirti ar sekvenuoti
DNR jei tikslins nukleotid sekos jau yra inomos). Biotechnologija spariai besivystanti
kryptis: pasaulyje dirba tkstaniai mokslinink grupi ir produkuoja gausyb informacijos.
Reikia sujungti vis mokslinink kompiuterius vien tinkl ir tinka tinkamai tvarkyti ir
suprantamai pateikti informacij. DNR sek duomen masyvai yra per dideli, kad efektyviai
juos analizuoti rankiniu bdu (pavyzdys: DNR sekos atitikimo paieka inom gen DNR
sek duomen bazse). Duomen masyvai talpinami genetines duomen bazes (pagrinde
DNR sekos) spariai didja tokiu lygmeniu kad yra poreikis specialiai ios informacijos
tvarkymui paruot specialist bioinformatik bei speciali informacijos tvarkymo
priemoni (duomen bazi ir e-program) specialiai pritaikyt bioinformacijos tvarkymui ir
analizei. Bioinformatika suderina tokius komponentus kaip: (a) kompiuterins analizs
metodai (paiekos varikliai, analizs programos); nemai duomen masyvai yra nemokami ir
laisvai prieinami per Internet, tai ypa patogu nedidelio biudeto centrams, kurie gali atlikti
komiuterines gen sek analizes ir atrasti naujus genus; (b) duomen bazs: DNR, RNR sekos
(sekvenuoti genomai, ymenys ir pan.); baltym amino rgi sekos (vir 120 000 baltym);
baltym molekulin struktra (vir 20 0000 baltym erdvin struktra).
Pagrindins bioinformatikos kryptys: (a) genom sek analiz: sekvenuot genom
sekos, cDNR sekos, EST, SNP ymen sistem sekos: QTL ir gen paiekos tyrimai; (b)
molekulinis modeliavimas: kompiuterin baltym sudties ir erdvins struktros prognoze
pagal nukleotid sekas; (c) filogenija ir evoliucija: informacija apie ri ir populiacij
evoliucij pagal gen sek panaumus; (d) statistin biologija: biologins informacijos
apdorojimo ir analizs e-priemoni ir statistini metod krimas ir vystymas.

49
Genom sek analizs tikslas yra gausi DNR ir RNR sek informacijos sisteminimas
genomini emlapi pagalba ir analiz specialiomis kompiuterinmis programomis.
Kompiuterizuoti interaktyvs genominiai emlapiai tai atitinkamai susisteminti nukleotid
sek rinkiniai paversti elektronin interaktyv format. Genominiai emlapiai tai efektyvus
rankis gen, genomini sek, ireikt sek (cDNR) ar molekulini ymen sankibos grupi
paiekai ir palyginimui (panau elektrinines knyg bibliotekas). Pavyzdiai: Ar tiriamas
genas yra kitos ries genome, kada ireiktas? Kaip homologini sek genai isidst
chromosomose ir kokia tvarka? Su kokio inomo geno sekomis, tyrimuose ireikto geno
sekos buvo panaios? Kokius pasigaminti PCR pradus, kad efektyviau aptikti genetin
variacij norimame poymyje? Kaip atskirti koduojamas ir nekoduojamas sekvenuoto
genomo dalis?. Koduojam sek nustatymui naudojamos kompiuterines programos ir kodono
pirmumo principas taikomas sekvenuot genom tolesnje analizje. inant tam tikra medio
biocheminje sudtyje gausaus baltymo pagrindin amino rgt, kompiuterio pagalba galima
iekoti DNR atkarp, kuriuose vyrauja i amino rgt koduojantis tripletas (kodonas, pvz.
CUG) (2.1.32 pav.).
















2.1.32 pav. Gen paieka DNR sekose. Analizs metu, tiksliniam kodonui suteikiamas
pirmumas ir pagal kodono pasikartojimo dan apskaiiuojant kodono pirmumo rodiklis, kuris
identifikuojamas kaip intronas ir baltym koduojanio geno dalis.


50
Filogenija tai biologijos aka tirianti asociacijas tarp vairi organizm (geni , ri,
pori ir pan.). ios disciplinos tikslas yra homologini (panai) gen sek paieka tarp
organizm, geni ir ri Bendr vystymasis ssaj tarp vairi ri nustatymas (principas:
panaios rys turi panaesnes baltym amino rgi ar DNR nukleotid sekas). Baltymai,
kuri pirmin struktra panai tarp ri, sudaro baltym eimas, o erdvin struktra-
blokus. Mokslininkai rekonstruoja evoliucinius ryius tarp ri ir nustato kada paskutin
kart lyginamos rys turjo bendrus tvus.
Molekulinio modeliavimo tikslas- kompiuterin baltym sudties ir erdvins (3-D)
struktros prognoze pagal nukleotid sekas (viena i proteomikos dali). Puiki ieitis jei
nemanoma atlikti gana brangi baltym struktros nustatymo metod rentgeno
kristalografijos pagalba. Baltym sekos apraomas raidmis (kiekviena aminorgtis- raid
(viso 20 raidi). Pagrindiniai 4 etapai: (a) rasti inomos erdvins struktros baltymus, kuri
aminorgi sekos panaios tiriamo baltymo sekas; (b) palyginti abiej baltym sekas
tikslu nustatyti identikas dalis, kurios bus naudojamos kaip jungi pavydiai modeliavimui,
(c) sudaryti tiriamo baltymo erdvin model pagal jungi pavydius; (d) ibandyti erdvin
model pagal eil testavimo kriterij.
Statistins biologijos tikslas biologini duomen analizs ir interpretacijos priemoni
krimas. Priemons, kurios galina efektyv prijim prie duomen masyv, j tvarkym ir
naudojim (pagrinde, duomen bazi programos, glaustame, naudojimui internete
tinkaniame formate). Krimas nauj algoritm (matematini formuli) ir rodikli, kurie
padt kompleksini duomen masyv analizje (pvz. DNR sek asociacij tyrimai, baltym
struktros modeliai ir baltym grupavimas pagal j panaum. Pavyzdys- BLAST duomen
baz internete. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) tai specialiai sek palyginimui
duomen bazse skirta programa. BLAST viena i pagrindini nemokam sek palyginimo
program ir yra laisvai prieinama Internete (pvz. NCBI www puslapis).
Pagrindins miko medi biologins informacins sistemos (Duomenys apie DNR
RNR ir baltym sekas, On-line analizs programos (pvz. BLAST)): NCBI (JAV
nacionalinis biotechnologins informacijos centras); EMBL (Europos molekulins biologijos
laboratorija) (http://www.embl.org/ ) ir EBI (Europos bioinformatikos institutas
http://www.ebi.ac.uk/); miko mediai: pagrinde TreeGenes informacin sistema (Dendrome
projektas, JAV). (http://dendrome.ucdavis.edu).
Genomika yra labiausiai besivystanios sritys miko biotechnologijoje. Tiktina, kad
visas genomas ar didioji dalis ireikt gen sek bus artimiausiu metu gauta, be Populus
trichocarpa, dar bent 2 miko medi rims tai Pinus taeda ir Eucalyptus globulus. Tada

51
dar labiau suintensyvs funkcins genomikos vaidmuo (mikrogardeli taikymas, modelini
medi ri lyginimas su tiriamomis, genetini modifikacij tyrimai). Didels EST
bibliotekos bus naudojamos kandidatini gen tyrimuose, ypa padaugjus modelini medi
ri su pilnais fiziniais ir genetiniais genolapiais. Lyginamoji genomika ir jos taikymas gali
pasiekti ne tik ries, genties, bet net ir eimos lyg. Kartu su fundamentaliaisiais tyrimais
iaugs ir taikomj tyrim apimtys. Kartu su tradicine medi selekcija bus taikomi
siejamosios (angl. association) genetikos metodai, identifikuojant norimus gen alelius. Vis
daugiau gen bus identifikuojama genetini modifikacij tyrimuose.

3 Miko medi epigenetika
3.1 Epigenetikos samprata
Epigenetika studijuoja paveldimus gen funkcijos pokyius nesusijusius su branduolio
DNR nukleotid sek pokyiais. Epigenetinis efektas reguliuoja gen veikim ir yra susijs
su paveldimais, taiau potencialiai grtamais, gen raikos, bet ne paios DNR sekos
pokyiais. Epigenetinis efektas reguliuoja gen veikim ir yra susijs su paveldimais, taiau
potencialiai grtamais, gen raikos, bet ne paios DNR sekos pokyiais. To paties geno
skirtingi epigenetikai reguliuojami aleliai vadinami epialeliais. Pavyzdiui, kad genas bt
aktyvus, t.y. vykt geno transkripcija (nuskaitymas), reikia atlaisvinti DNR grandin nuo
histon oktamer nukleksomoje. Epigenetiniai pokyiai gali kontroliuoti histon ir DNR
sveik nukleosomoje. Be to, ilgalaikis geno utildymas ar aktyvacija (individo adaptyvumo
padidinimas) gali bti hipotetiniai ymenys tolesnei DNR mutacijai DNR replikacijos mitozs
ar mejozs metu. Tai nauja ir perspektyvi tyrim sytis, kadangi epigenetinio kintamumo
takos ribos laukini augal fenotipiniams poymiams, populiacij struktrai ir adaptyvumui
dar nra inomos. Epigenetiniai pokyiai ypa tinkami toki stacionari biologini sistem
kaip miko medi evoliucijai. Epigenetins modifikacijos gali pasireikti aplinkos stresori
poveikyje (pvz. dl poliploidizacijo, ar audini pakenkim); virus, mobili element
mutagen sukelt DNR pakitim neutralizacijoje, transgen (GMO) nutildyme; tolimoje
hibridizacijoje (branduollio dominavimas), apomikss prevencijoje (genomo imprintingas);
in vitro dauginime (somakloninis kintamumas). Medi sezoninio augimo ciklas bei
ontogenezinis ciklas tai pat nemaa dalimi lemiamas epigenetikos. Iskiriami trys pagrindiniai
augal epigenetinio gen reguliavimo mechanizmai: (a) chromatino struktros pokyiai dl
histon modifikacijos; (b) tiesioginis DNR metilinimas; (c) mikroRNR (interferencin RNR)
(3.1 pav.).

52


















3.1 pav. Epigenetins kontrol sir gen ekspresijos lygmenys: kokiu ekspresijos etapo metu
gali vykti j veiklos laikinas slopinimas ar utildymas (ekspresijos kontrol) ir ilgalaikis
ijungimas (epigenetinis pokytis). Branduolyje: histon modifikacija ir DNR promotori
metilinimas, citoplazmoje interfercins (trikdanios) RNR (iRNR ) veikla.


3.2. Chromatino modifikacija ir histon kodas.
Chromatino permodeliavimas siejamas su nukleosom padties pokyiais, dl kurio
vyksta chromatino permodeliavimas DNR topologijos ir jos prieinamumo reguliaciniams
baltymams pokyiai (stipriai kompaktuotas chromatinas vadinamas heterochromatinu).
Tam, kad vykt geno transkripcija (t.y. transkripcijos faktoriai ir RNR polimeraz galt
prisijungti prie gen promotori), reikia, kad DNR grandin bt atpalaiduota nuo
vandenilini jungi su histonais, kurie turi specifines i aminorgi polimer sudarytas
uodegas vadinamas N-uodegomis (3.1 pav.). i uodeg chemin modifikacija turi esmin
tak chromatino koncentracijai ir tu bdu takuoti gen ekspresij (3.2 pav.)



53











3.1 pav. Histonai kontroliuoja chromatino kompaktikumo lygmenis.


3.2 Aktyvus (viruje kairje) ir neaktyvus kondensuotas (kairje) chromatinas ir histon
uodegos modifikacijos pavyzdys: prie tam tikr aminorgi prisijungusios molekuls.
Btent i uodeguos esani aminorgi satelitini jungini modifikacijos turi esmin tak
DNR transkipcijos prieinamumui. .

Pavyzdiui, histono Nr.3 (nukleosom sudaro 4 poros histon) N-uodegos lizino-9 (skaiius
reikia amino rgties pozicij uodegoje) metilinimas sukelia kondensavim
heterochromatin (gen utildymas dl kompaktins chromatinio bsenos), o lizino-14
acetilinimas susijs su gen aktyvacija. Nukleosom sudaro (1) baltym erdis, sudaryta i 8
histon molekuli (histonai tai baltymai, priskiriami globulinams, 8 histon molekuls
nukleosomos erdyje sudaro oktamer: histon ymjimas: H2A, H2B, H3, H4), (2) DNR

54
grandins 2 vijomis apsuka nukleosom ir (3) DNR nukleosomos vijas fiksuojanio H1
histono (3.3 pav.). Nukleosoma gali bti atskirta nuo nukleosomas siejanios DNR (linker
DNR) degraduojant j DNR nukleazi pagalba, kurios suskaido (degraduoja) laisv DNR, bet
nelieia DNR, kuri stipriai apvyniota aplink nukleosomos erd (tyrimais nustatyta, kad aplink
nukleosom apvyniotos DNR ilgis 146 bp.

3.3 pav. Nukleosomos sandara.

Histon uodegos takoja 30 nm chromatino silo (2-j nukleosom eili silas-
paskutinis chromatino kompaktacijos lygmuo) formavimsi: (a) N-uodegos gali supakuoti
nukleosomas chromatino silus (b) net ir esant kompaktikai chromatino bsenai, N-
uodegos gali laisvai judti, tokiu bdu bti tinkama priemon vairi signal perdavimui.
vairios molekuls prisijung prie N-uodegas sudarani amino rgi gali sumainti arba
padidinti DNR prieinamum transkripcijai (3.4 pav.). ios molekuls jungiasi prie histono
aminorgi kovalentinmis jungtimis ir ar egzistuoja specifin j prisijungimo sistema,

vadinam histon kodu (r. emiau).
.3 pav. (a) Scheminis nukleosomos pavaizdavimas: histonai, j uodegos ir DNR (b)
s
su
3
kiekvieno histono N-uodegos turi specifines aminorgi kombinacijas, kurios sudaro
galimyb specifinms jungtims tam reikalingose vietose. vairi molekuli prisijungima
ioms jungtims jautriose vietose gali trukdyti ar atvirkia skatinti DNR grandins ssajas
nukleosomos histonais (pav. i Molecular.biology of the cell).

55
Histonai sintetinami citosolyje (lstels terp tarp branduolio ir sieneli), pakuojami
nukleosomas ir transportuojami branduol. Mus dominanios N-uodeg modifikacijos
branduolyje po histon jungimosi nukleosomas. Tai atlieka specials branduolyje esantys
enzimai: pvz. acitiltransferazs (acetilinimas), deacetilzs (acetilo grupi paalinimas).
Histon N-uodeg modifikacijos pirmiausia veikia (a) 30-np chromatinio silo ir tolesn
chromatino pakavim, (b) kontroliuoja atrakcij speciali baltym kompleks prie atitink
paruootos chromatino atkarpos: priklausomai nuo tikslios N-uodeg modifikacijos, ie
baltym kompleksai gali (1) toliau tsti DNR ir nukleosom atskyrim taip skatinami gen
aktyvum ar (2) atvirkiai skatinti j pakavim heterochromatin (r. pav. sekanioje
slaidje).
vyksta

amai

Pagrindiniai histon N-uodeg kovalentini modifikacij tipai yra tokie: (a)
Acetilinimas (Ac): prie aminorgties lizino prisijungia acetilo grups molekul; taip
sumaja histon teigiamas krvis, jie praranda giminingum DNR ir tokiu bdu skati
transkripcija; Hipoacetilinimas slopina gen raik, nes chromatinas i euchromatino virsta
heterochromatnu (stipriai kondensuotu); danai histon acetilinimas per gen ekspresij
reguliuoja augalo vystymosi stadijas; (b) Metilinimas (Me): prie lizino prisijungia metilo
grups molekul. Poveikis- kondensavimas heterochromatin ir gen tildymas; (c)
Fosforilinimas (P): prie serino prisijungia fosfor jungini grups. Funkcija panai ka
gen ekspresijos kontrol; (d) Ubikvitininimas: ubikvitinas tai santykinai didesn 76
aminorgi dydio baltymo molekul, jos funkcija tyrimo stadijoje.
nama
ip Ac-
Histon kodas tai histon funkcini dali chemins modifikacijos sistema, skirta
gen fu ).

nkcijos reguliavimui (analogika genetiniam kodui, lemianiam baltymus) (3.5 pav.
Galima tam tikra modifikacij kombinacija, turinti specifin reikm chromatino struktrai ir
nukleosomos bei DNR tarpusavio sveikai. inoma tik keli i kombinacij funkcija (dalis
histon kodo). Pvz. prisijungus metilo grupei prie H3 lizinio Nr.9, nukleosoma atpastama
baltym grups, kondensuojanios chromatin heterochromatin. Kai kurios modifikacijos
yra susij, pvz. H3 vietos Nr.9 metilinimas blokuoja H3 vietos Nr.10 fosforilinim ir
atvirkiai.







56

3.5 pav. Histon s
odifikacijos, kuri reikm pateikiam apaioje. Histon N-uodeg modifikacijos turinios
gen aktyvumui: Me-metilo, Ac-acetilo, P- fosfat grups, U- ubikvitinas. Skaiius
arodo amino rgties viet (skaiiuojant nuo N-galo); raid ymi tam tikr amino rgt

in DNR molekuls modifikacija, kurios metu metilo grup
(CH3) prijungiama nukleotido citozino aromatiniame iede (bazje), kas sukelia geno
i ymimi CpG, CpCpG, CpNpG DNR motyvai (pvz.
CCGG
iai
transpozonus. Augaluose metilo grup pernea metiltransferazs (Met1, Cmt3, Drm2), j
kodas. Viruje histon uodegos ir iki ios nustatytos j kovalentin
m
tak
p
(vienos raids kodas); galima modifikacij kombinacija, sudaranti histon kod (pav. i
Molecular.biology of the cell). .

3.3 Tiesioginis DNR metilinimas.
DNR metilinimas tai chem
transkripcijos trikdius. Daniausia
seka, kuri yra atpastama kai kuri restriktazi); paprastai vyksta DNR replikacijos
metu (lstelms dalinantis, aktyviai augant augalui ar reprodukcijos metu). Metilinimas geno
promotoriaus regione sukelia transkripcijos nutildym (prie metlinto C jungiasi represorin
baltymai MeCP1 ir MeCP2). Metilinimas ne tik slopina gen veikl, bet ir nutildo

57
aleli mutacijos turi esmin tak fenotipui ir ilikimui. Metlinimas gali vykti de novo
(anksiau nemetilintuose specifinse sekose sekose) ar pusiau metilintose DNR
(hemimethylation), gaunamose i pilnai metilntos dvigrands DNR replikacijos. Tr
miRNR molekuls komplimentarios tam tikrai geno promotoriaus sekai yra susij su C
motyv metilinimu DNR grandinje (RNA-directed DNA methylation) (Mette ir kt. 20
vairios dvigrandins (dsRNR) gali tarnauti kaip signalins molekuls tolesnei
metiltrasferazi veiklai.
Tam tikri Arabidobsis thaliana ekotipai turjo specifinius gen promotori metili
dsningumus (Cervera et al. 2005). Tai gali atitikti prisitaikymo dsningumus prie specifins
aplinkos slyg. Metilinto citozino chemin sudtis labai panai timinido (tim
prijungta D-riboz), todl galim
umpos
00).
nimo
ino bazje
a tolesn chemin konversija timin; tokiu bdu vykt
perman

3.6 pav. Anksti sezonin i aln. is
aplinkos slyg sukeltas


Nuo nukleotid chemini
ktyvum takuojani baltym veikimui. Kaip genus reguliuojantys baltymai gali atpainti
entin DNR mutacija. Galima hipotez, kad kai kurie metilinio dsningumai gali
tarnauti kaip enklai DNR mutacijoms ir bti vienas i genetins adaptacijos mechanizm
tokiose stacionariose biologinse sistemose kaip mediai (3.6 pav.). Kadangi epimutacijos
yra potencialiai grtamos, galimi teigti, kad tai pereinamas adaptacinis mechanizmas
skanuojantis permanentini mutacij btinyb naujoje aplinkoje.



augim pradedantys p. egls medeliai, danai pakenkiam
stresas gali sukelti epigenetinius pokyius.
sek priklausanti DNR molekuls forma ir satelitini
jungini sukelta ios formos modifikacija turi didel tak su DNR sveikaujani ir gen
a

58
DNR nukleotidus pagal j kratuose esanius vandenilini jungi donorus ir receptorius
(nenutr
eotid

rups, kurios suformuoja hidrofobinius isikiimus, parodytos geltonai. H atomai, esantys
nginyje su C atomais, yra neaktyvus naujoms H-jungtims (pavaizduoti baltai). (b)
in

acijos
mbriogenez (3.8 pav.). Gametogenezs stadijoje dauguma gen promotori yra umetilinti,
skirian
kurti nauj
ekspresija.
aukiat dvigubos DNR grandins vandenilini jungi)? Pasirodo, kiekvienas
nukleotidas (A, C, T, ar G) turi specifines potenciali vandenilini (H) jungi donor ir
receptori vietas erdvinje DNR grandins struktroje (H jungtys tai vietos prie kuri
pirmiausia jungiasi su DNR sveikaujantys baltymai, t.y. orientuoja reikiamus gen
reguliavimo baltymus link reikiam viet jungiai) (3.7 pav.). Todl pagal DNR nukl
seka susiformuoja specifin iorini jungi prie DNR molekuls sistema.
3.7 pav. Kaip genus reguliuojantys baltymai gali atpainti DNR nukleotidus pagal j
kratuose esanius vandenilini jungi donorus ir receptorius (nenutraukiat dvigubos DNR
grandins vandenilini jungi). (a) Parodytos 4 galimos bazi por kombinacijos, kur
potencials H jungi donorai parodyti mlynai, o H jungi receptoriai raudonai. Metilo
g
ju
Kiekviena nukleotid seka turi unikal H jungi sistemos kod- DNR nukleotid ior
atpainimo kod. Paveiksle pavaizduoti H jungi donorai ir receptoriai kiekvieno nukleotido
kratuose irint DNR spirals didij ir maj vijas. Parodytos 4 nukleotid kombin
(pav. i Molecular.biology of the cell). .

Augaluose DNR metilinimas gali reguliuoti gen ekspresij reprodukcijos metu.
Reprodukcijos metu pastebti skirtingi DNR metilinimo dsningumai tarp atskir
reprodukcijos stadij: gematogenez, apvaisinimas, zigotos pirminis vystymaisi,
e
t visus resursus u gamet vystymsi ir apvaisinam atsaking gen funkcijai. Po
apvaisinimo daugum gen yra nemetilinti ir pradins totipotentins lstels gali at
organizm, kai per DNR metilinim ir histon kod reguliuojama vystymosi gen

59
Pastebta, kad po kai kuri vystymosi stadij lik metilinimo pokyiai ilieka ir brandiuose
palikuonyse. Nors tvo ir motinos aleliai turi skirtingas sekas, epigenetinis mechanizmas
ekspresuoja juos skirtingai, priklausomai nuo to tvas ar motina juos suteik.





3.8 pav. Augal gen promotori metilinimo dsningumai reprodukcins fazs metu.

Miko medi DNR metilinimo dsningumai apvaisinimo, zigotos ir gemalo vystymosi metu.
orvegijos mik tyrimo instituto mokslininkai (Johansen ir kt., 2006) atliko p. egls
imus
liautinse kamerose: testuota hipotez, kad temperatra prie ir po apvaisinimo gali suketi
taka po
us.
N
palikuoni poymi iraikos priklausomumo nuo temperatros reprodukcijos metu tyr
k
epigenetinius pokyius palikuonyse (pvz. DNR metilinimas). Atlikti 2 skirtingi testai (3.9
pav.). Testas I. Vertinta temperatros taka prie apvaisinim. Testas II- temperatros
apvaisinimo. Rezultatai parod, kad tik po apvaisinimo vyks temperatros pokytis turjo
esmin tak palikuoni augimo ritmui: iltesnje aplinkoje brendusi zigota produkavo
vlesns sezonins augimo pradios ir pabaigos palikuonis (panaesnius pietinius genotip














60

61

ohansen ir kt. 2006). Testas I. Vertinta temperatros taka prie apvaisinim. Testas II-
mperatros taka po apvaisinimo.

3.10 pav. Hipotetinis M-AFLP analizs pavyzdys: tiriamos vieno klon dviej ramet su
pumpur sprogimu susijusio geno promotorius (izoliuotas EST ymen pagalba).


3.9 pav. Norvegijos mokslinink atlikt tyrim metodika ir rezultat interpretacija (apaioje)
(J
te

A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys vienodi
B
B
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys vienodi
B
B
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys skirtingi
B
B
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys skirtingi
B
B
Apvaisinimas
Metilinimas- ekspresijos reguliacijai (be takos
palikuonims)
Metilinimas- atsivelgiant aplink, kurioje
palikuonims teks augti
Gametogenez Zigotos vystymasis ir embriogenez
Testas I. Testas II.
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys vienodi
B
B
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys vienodi
B
B
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys skirtingi
B
B
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys skirtingi
B
B
Apvaisinimas
Metilinimas- ekspresijos reguliacijai (be takos
palikuonims)
Metilinimas- atsivelgiant aplink, kurioje
palikuonims teks augti
Gametogenez Zigotos vystymasis ir embriogenez
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys vienodi
B
B
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
A B
iki apvaisinimo 30C ;
Po apvaisinimo: 20C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 10C ;
Po apvaisinimo: 20C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys vienodi
B
B
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys skirtingi
B
B
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
A B
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 30C;
iedadulks
A
Krymi nimas B
iedadulkmis
iki apvaisinimo 20C ;
Po apvaisinimo: 10C;
A
alta: 10C
ilta: 30C
A klonai
Palikuonys skirtingi
B
B
Apvaisinimas
Metilinimas- ekspresijos reguliacijai (be takos
palikuonims)
Metilinimas- atsivelgiant aplink, kurioje
palikuonims teks augti
Gametogenez Zigotos vystymasis ir embriogenez
Apvaisinimas
Metilinimas- ekspresijos reguliacijai (be takos
palikuonims)
Metilinimas- atsivelgiant aplink, kurioje
palikuonims teks augti
Gametogenez Zigotos vystymasis ir embriogenez
Testas I. Testas II.
H
p
a
I
I
CCGG
-
M
C C G G
-
M
EcoRi
GAATTC
G A A T T CCCGG
HpaII
-
M
C C G G
metiliacija
AATTC
Rameta A. EcoRi + HpaII kombinacija: HpaII
nekerpa vidurinje dalyje nes yra CpG
G G
CC
adapt
CCGG
-
M
C C G G
M
pradas pradas
3. Jungiami adapteriai ir PCR pradai +1+2 nukleotidai
2. Restriktazs sukarpo DNR
AATTC
G G
CC
-
M
GG
C C
G
A A T T C
CCGG
-
M
C C G G
-
M
4. PCR elektroforezje gaunamas
1 ilgas fragmentas: promotorius
buvo metilintas.
MspI
CCGGC C G G
EcoRi
GAATTC
G A A T T CCCGG
MspI
-
M
C C G G
-
M
GG
C C
G
A A T T C
AATTC
G G
CC CC GG
C C G G
MspI
MspI
AATTC
G G
CC CC GGC C G G
MspI
paII
kerpa vidurinje dalyje nes nra metiliacijos
Rameta B. EcoRi + HpaII kombinacija: H
adapt
pradas
pradas pradas pradas
4. PCR elektroforezje gaunami 2
trumpi fragmentai: promotorisu
nebuvo metilintas
EST1 EST2
H
p
a
I
I
H
p
a
I
I
CCGG
-
M
C C G G
-
M
CCGG
-
M
C C G G
-
M
C C G G
-
M
EcoRi EcoRi
GAATTC
G A A T T CCCGG
HpaII HpaII
-
M
C C G G
-
M
C C G G
metiliacija
AATTC
Rameta A. EcoRi + HpaII kombinacija: HpaII
nekerpa vidurinje dalyje nes yra CpG
G G
CC
adapt
CCGG
-
M
C C G G
-
M
C C G G
M
pradas pradas
3. Jungiami adapteriai ir PCR pradai +1+2 nukleotidai
2. Restriktazs sukarpo DNR
AATTC
G G
CC
-
M
GG
C C
G
A A T T C
CCGG
-
M
C C G G
-
M
AATTC
G G
CC
-
M
GG
C C
-
M
GG
C C
GG
C C
G
A A T T C
G
A A T T CA A T T C
CCGG
-
M
C C G G
-
M
CCGG
-
M
C C G G
-
M
C C G G
-
M
4. PCR elektroforezje gaunamas
1 ilgas fragmentas: promotorius
buvo metilintas.
MspI MspI
CCGGC C G G CCGGC C G GC C G G
EcoRi EcoRi
GAATTC
G A A T T CCCGG
MspI MspI
-
M
C C G G
-
M
C C G G
-
M
GG
C C
-
M
GG
C C
GG
C C
G
A A T T C
G
A A T T CA A T T C
AATTC
G G
CC CC GG
C C G G
MspI
AATTC
G G
CC CC GG
C C G G
MspI
CC GG
C C G G
MspI MspI
MspI MspI
AATTC
G G
CC CC GGC C G G
MspI
AATTC
G G
CC CC GGC C G G
MspI
CC GGC C G G
MspI MspI
paII
kerpa vidurinje dalyje nes nra metiliacijos
Rameta B. EcoRi + HpaII kombinacija: H
adapt
pradas
pradas pradas pradas
4. PCR elektroforezje gaunami 2
trumpi fragmentai: promotorisu
nebuvo metilintas
EST1 EST2 EST1 EST2
DNR metilinim galima nustatyti restriktazmis: methylation sensitive amplification
s RNR (miRNR ir siRNR).
polymorphism (MSAP ar M-AFLP metodai) (3.10 pav.). DNR sukarpoma retai kerpania
restriktaze (pvz. EcoRi). Gauti fragmentai toliau sukarpomi danai kerpaniomis metilo
grupei jautriomis restriktazmis - MspI ar HpaII, abi atpasta 5-CCGG-3 DNR sekas ir
kerpa ties 2-ru C. HpaII neveikia, jei 2-ras C nukleotidas- umetilintas 5C aromatiniame
iede, abejose DNR grandinse (t.y. jei bus umetilinta tik viena grandins pus, restriktaz
kirps DNR grandin). MspI neveikia, jei 1-mas C nukleotidas- umetilintas 5C aromatiniame
iede, bent vienoje i DNR grandini. Todl HpaII sukarpys vis DNR atkarp, o MSpI tik
nemetilintas DNR atkarpas, taip nurodydama, kur yra aktyvs genai.
Bisulfitinimas ir pyrosekvenavimas yra DNR metilinimo nustatymo metodas ilgesnse
atkarpose. DNR modifikuojama paveikiant j bisulfitu: metilinti C lieka nepakit, o
nemetilinti C paveriami uracil (U, RNR baz). PCR bdu DNR pagausima, tik vietoje
uracilo lieka timinas. Atliekamas PCR pagausintos DNR sekvenavimas: C ilaikymas
nepakitusioje pozicijoje rodo metilinim, o timino atsiradimas vietoje citozino rodo
nemetilinto C buvim. Sekos po kuri nebuvo G (naudojamos kaip kontrol).

3.4. Maosios interferencin
RNR interferencija tai procesas, kai maos RNR molekuls degraduoja dvigrandes
sRNR) RNR molekules ir skatina homologini DNR sek metilinim. RNRi isivyst kaip
ovos prie virusus mechanizmas. Maosios RNR tai 20-25 nukleotid ilgio RNR molekuls,
dalyvau
.
lio

i
(d
k
janios RNR interferencijos (reguliacijos) mechanizmuose susijusiose su gen
ekspresija. Pavyzdiui, maosios interferencins RNR molekuls dalyvauja paramutacijose
Kartu su gameta paveldtos vieno i porini aleli miRNA ar siRNR gali takuoti kito ale
iraik, nors miRNR ar siRNR generavusio alelio ir nebus zigotoje (Mendelio dsnio apie
nepriklausom poymi paveldjim korekcija). Augaluose maosios RNR skirstomos dv
klases: (a) siRNR (short inhibitory RNR) yra egzogenins kilms ir dalyvauja svetimos DNR
(retrovirus, endogenini transpozon) atpainime ir degradacijoje, bei tiesioginiame siRNR
komplimentari DNR sek ir histon N-uodeg metilinime (siRNR yra 21-24 nt ilgio) ir (b)


miRNR (micro RNR) sintetinama sav gen ir dalyvauja endogenini gen ekspresijos
kontrol
nt ilgio
je susijusioje su augalo raidos valdymu (vystymusi) (kontroliuoja lapo poliarizacij,
iedo vystymsi) bei klaidingai besireikiani vietini gen nutildyme; bna 20-25
(miRNR genai kil i invertuot pasikartojani sek (IR DNR)).

62
Trumpos inhibitorins siRNR dalyvauja post-transkripciniame gen tildyme. si
veikimo principas pavaizduotas 3.11 pav. Endogenins ir iorins kilms DNR
RNR
sekos sugeba
generuoti dvigrandes RNR (dsRNR) molekules, tuo bdu paleisdamos gen tildymo
mechanizm: ds RNR skaidym specifini sek siRNR molekules, skirtas tam tikr gen
NR sintez (ds- double
strande
kad
veikimo principas
mRNR paiekai ir degradacijai. ingsniai: (a) dvigrands dsR
d), (b) dsRNR atsiradimas veikia kaip signalas specialioms RNR nukleazms (pvz.
Rnaz-III), kurios degraduoja dsRNR atskiras trumpas RNR molekules (20-23 bp ilgio),
vadinamas siRNR (si-short interfering); (c) siRNR inkorporuojamos nukleazi kompleks*
(RISC) ir veda j prie homologini viet viengrands mRNR (ssRNR) molekulse tam,
jos tapt atpastamos ir degraduojamos (sunaikinamos). Visas procesas vyksta citoplazomoje
ir labai greitai.



















3.11 pav. siRNR




63
Kitas siRNR interferencijos bdas yra dalyvaujant RNR priklausomai RNR-polimerazei
DR), kai siRNR gali tarnauti pradmeniu sintetinant mRNR komplimentari grandin, o
usidarius dvigrand dsRNR karpoma siRNR, kurios toliau dalyvauja slopinime (b atvejis,
aveiksle deinje, kai RDR jungiasi prie netipins RNR (pvz. be poly adenilinit gal) ir
intetinama dsRNR atpastama Dicer nukleazi. Taip, lstel patekusi arba lstelje
usiformavusi dsRNR skaldoma Dicer nukleazs komplekso pagalba siRNR, kuri gali
rnauti pradmeniu kit dsRNR sintezei. Tokiu bdu siRNR padauginama (atvejis c paveiksle
einje). RNR grandins sintez, panaudojant pradmeniu siRNR, labai svarbus yra siRNR 3-
H galo buvimas, nes is galas tarnauja pradmeniu. siRNR tai kada konservatyvus
echanizmas daugumos eukariot ryse. Augaluose prim kart pastebtos Hamilton ir
aulcombe (1999). siRNR yra kovos prie virusus priemon, kai virusai generuoja dsRNR
fekcijos metu.
miRNR ir siRNR: transkripcinis gen tildymas
(R
s
p
s
s
ta
d
O
m
B
in
. siRNR ir miRNR gali tarnauti kaip
edlys ne tik RISK nukleazms, bet ir DNR metilinimo bei histon uodeg metilinimo
ompleksams (RITS komplekso vedimas prie H3 N-uodegos lizino 9 metilinimui, kas sukelia
ondensavim heterochromatin (Sigova et al. 2004). Tokiu bdu RNRi dalyvauja tiek TGS
iliacijos mechanizmas nustatytas pagal Arabidobsis
rimus. dsRNR gali bti susintetina vairias bdais, skaitant (a) sence (s) ir antisens (as)
NR grandini transkripcij, (b) atvirktini DNR transktipt RNR (c) segtuko formos RNR,
) RDR sintez. DCL tipo nukleazs (dicer like) skaido dsRNR trumpas RNR (parodytos
1,
mi
a joms
:
v
k
k
tiek PTGS. RNR vedamos DNR met
ty
D
(d
punktyrine linija), kurios toliau veda DNR meltilinimo enzimus metiltransferazes (MET
DRM1, DRM2) link homologini (reikiam) DNR sek. Pirma, nestipriai de novo meilina
CG, CnG, Cnn motyvai (pusiau balti rutuliukai) (de novo: naujai anksiau nemetilint sek
metilinimas). Kitos DNR metiltransferazs toliau reguliuoja metilinim priklausomai nuo
esanios RNRi kiekio. AGO1-4 yra branduolyje ir jungiasi su trumpomis RNR ir paded
sveikauti su homologiniais lokusais; Tam tikros metiltransferazs atlieka savit funkcija
HDA6 ir MET1 palaiko pirmin CG metiliacij, Cnn motyv metiliacija negali bti
palaikoma be trump RNR, DRD1 ir DDM1 atlieka de novo metlinim ir jo palaikym.
Mikro RNR (miRNR) veikimas (3.12 pav.). MiRNR pirmatakas (segutuko fo
RNR molekul) yra koduojama tarp gen esaniose genomo srityse- pvz. kartotinje DNR
miRNR pirmtakas, sudarytas i nepilnai komplementari invertuot pasikartojim,
suformuoja savo
rmos
.
segtuko formos struktras, kurias branduolyje skaldo viena i Dicer
nukleazi. Susidars 70 nukleotid ilgio nepilnai komplementarus dupleksas
transportuojamas citoplazm, kur j toliau skaido Dicer tipo nukleazs. Susidaro RNR

64
dupleksas, kuris turi 2nt isikius 3-OH gal. Susidariusi dvigrand dsRNR jungiama
RISC kompleks ,kur viena i dsRNR grandi degraduojama ir gauta miRNR naudojama
arba degraduoti i branduolio transportuojamai mRNR (jei miRNR pilnai komplementari
mRNR), arba stabdoma mRNR transliacija (jei miRNR dalinai komplementari).

3.12 pav. Mi RNR veikimo principas.

Kokie yra dvigrandi RNR molekuli (dsRNR) altiniai? Augaluose vis RNR
mechanizmai vyksta alia vienas kito: (a) dsRNR sintez i DNR ar RNR (RD
(b) dsRNR skaidymas speciali RNR nukleazi (Rnasi) pagalba, (c) viengradini mRN
skaidymas siRNR, vedam RISK nukleazi komplekso (d) siRNR amplifikacija RDP
polimeraz. Maosios RNR yra svarbus faktorius RNRi sistemoje, nes veikia kaip gidai,
nurodantys prie kuri RNR molekuli represoriniai kompleksai turi prisijungti. Maos RN
gaunamos skaidant dsRNR, todl svarbu aptarti dsRNR altinius. dsRNR altiniu
i
R polimerazs),
R
R
s galima
skirstyti dirbtins, natralios kilms ir RDR sintetinamas dsRNR. Dirbtiniai altiniai
(pvz. transgenai, virusai). Antisens DNR gen inkorporacija, kai Antisens transgenas
sintetinama RNR komplimentari natralaus geno pre-mRNR. Kartotins transgen kopijos
gali sukelti dsRNR sintez RDR pagalba, gautos dsRNR sukarpomos siRNR, kurios veda
histon uodeg metilinimo kompleks RITS (RNR induced initiation of transcriptional
silencing) link histono 3 N-uodegos 9 amino rgies lizino, kurio metilinimas susijs su DNR
koncentracija heterochromatin (Sigova ir kt. 2004). Daugumos virus turi ssRNR, ukrtus
lstel virus replikazs gamina dsRNR, kurios yra lengvas taikinys RNRi degradacijai. Kita
vertus, virusai evoliucionuoja ir turi savo kovos mechanizmus, tokius kaip siRNR jungiantys
baltymai. Natrals altiniai (koduojamus sav augalo gen ar kit sek (pvz. transpozon).

65
Pirmiausia tai miRNR genai, kil i invertuot pasikartojani sek, kurios einanios tam
stem siRNR
. Taip pat gali
b Savos
tikroje sistemoje vien po kitos gali sudaryti pilnai ar dalinai komplimentarias dsRNR
molekules (degraduojamos DICER miRNR). Transpozonai taip pat gali sudaryti panaias
and loop dalines dsRNR molekules (Sijen ir Plasterk 2003). I transpozon kil
gali dalyvauti j produkt degradacijoje ar pai transpozon DNR metilinime
ti sintetinama sence ir antisence DNR grandins puss o j RNR jungtis dsRNR.
RDR (nuo RNR priklausomos polimerazs- RNR dependent RNA polymerase) kilms.


3.13 pav. Bendras RNR interferencijos (RNRi) mechanizmas augaluose (pav. i Plant
epigentics).

Bendras RNR interferencijos (RNRi) mechanizmas augaluose pavaizduotas 3.13 pav.
RNRi galima skirstyti endogenins kilms (miRNR genai, transpozonai), inkorporuota
virus DNR ir egzogenins kilms dirbtinai terpti genai. Post transkripcinis transgen
tildymas (post transcriptional gene silencing (S-PTGS): (a) Nuo RNR priklausoma RNR
polimeraz (RDR6) atpasta ir jungiasi prie netipini transgeno RNR (paymta vaigdute),

66
sintezuoja nestabilias dsRNR kurios AGO1, HEN1 (DCL2/4) nukleazi kompleks skaidomis
siRNR, kurios savo ruotu dalyvauja netipini RNR paiekoje ir skaidyme (vesdamos RISK
kompleks) ar degraduojamos. (b) (R-PTGS) IR (inverted repeats) kopij tildymas, kurio


s
paios slygoja nepilnai komplimentari dsRNR sintez; ios dsRNR karpomos DCL2/4
nukleazi
Endogenin a arba
entari mRNR),
arba stabdom

paveldim
d tas ir lieka
nepriklausom (pvz. A1) turi
tak
tak alelio

siRNR, kuri telsn funkcija panai (a) atvejyje aprayt funkcij.
s kilms miRNR sintez i miRNR prekursori Gauta miRNR naudojam
degraduoti i branduolio transportuojamai mRNR (jei miRNR pilnai komplem
a mRNR transliacija (jei miRNR dalinai komplimentari).
5.5. Paramutacija.
Paramutacija tai dviej vieno lokuso aleli tarpusavio sveika, kai vienas alelis sukelia
us kito alelio ekspresijos pokyius (3.14 pav.). Paramutacija prietarauja Medelio
sniui, kad gamet formavimosi metu aleliniai genai atsiskiria atskiras game
i vieni nuo kito. Vykstant paramutacijai vienas i alelini gen
kitam aleliniam genui (A2) palikuonyse, nors pats alelis A1 nebuvo perduotas
3.14 pav. Paramutacij pavyzdys. Su aleliu A1 susijusius RNRi molekuls turi
A2 ekspresijai palikuonyse, kuriuose paio A1 alelio nra.


67
palikuonims. Kas yra perduodama tai alelio A1 palikimas- maosios RNR (miRNR, siRN
esanios gametos citosolyje ir gametogenzs metu galinios sukelti A2 alelio epigene
R)
tines
ametos (kiauialsts)
ei i vyrikos, motininio genotipo paramutacija gali turti didesn tak.
Paramutacija pirm kart buvo atrasta R.A. Brik 1950-tais metais Wisconson-Madison
as kukurzuot kryminimus, jis pastebjo kad specifinis, silpnai
ekspres
dl
a
utacija
i
suteikia eil z skl spalva pereit
poymio variacija yra
kontroliuojam tacij molekulinio
mechanizmo su epigenetiniais gen
tildymo mechanizm os RNRi
molekuli: su param tino bsenos stabilumas
reikalauja mop1 geno, kuris RNR polimeraz). RDR
yra b , kurios sukelia paramutacijas.
Tikslus RNRi veikim ra aikus, bet kaip ir kiti
epigenetiniai poky is mutacijomis ar DNR
metilinimu.

4. Genetin
4.1 Metodai.
btin gen modifikacija ir
nelytinio gen perklimo metod naudojimas tikslinei poymi, produkt ir proces
modifikacijai (FAO 2004). Genetikai modifikuotas organizmas (GMO)- tai organizmas
modifikacijas (paramutacij), kurios gali ilikti ir palikuonio embriogenezs ir visos
ontogenezs metu. Tad, RNR kaip ir DNR yra paveldim genetin informacij perduodanti
molekul. Kadangi daugiau citosolio ir organeli patenka i motinins g
n
universitete. Tirdam
uotas alelis red1, sukeliantis kukurz skl raudon spalv, gali paveikti stipriai
ekspresuot alelini gen paveldjim. io paramutageniko alelio poveikis tssi per kelt
generacij. Taiau, generacij kaitoje, pradinis paramutagenikos RNRi kiekis gali mati
didesns kit gamet citosolio dominavimo, taip sumaindamas paramutacin efekt. Tai yr
pagrindinis skirtumas nuo permanentini DNR mutacij. domu, tai, kad alelio param
gali bti vairaus stiprumo, priklausomai nuo paveldtos RNRi kiekio gametos citosolyje, ta
Genetin ininerija (sin. genetin modifikacija) tai dir
pereinam fenotipo iraik, kaip pvz,. red1 atveju kukur
nuo baltos iki raudonos. Tai sudaro iimt i dsningumo, kad tstin
a daugelio gen. Dabartiniu metu spartjantys paramu
atskleidimo tyrimai parod, kad paramutacijos yra susij
ais. Aleman (2006) pasil, kad paramutacijos yra vedam
utacijomis ir transpozon tildymu susijs chroma
koduoja RDR (nuo RNR priklausani
tina, kad palaikyti pakankam RNRi molekuli skaii
o mechanizmas paramutagenezje n
iai, tai yra susij su histon uodeg kovalentinm
ininerija.
kurio gen visum (genom) yra terptas svetimas genas (ai).


68






















4.1 Pagrindiniai genetins ininerijos etapai: (1) DNR izoliavimas; (2) geno izoliavimas ir
klonavimas, (3) geno modifikacija; (4) transformacija (geno perklimas svetim organ


Iskiriami 4 pagrindiniai genetins ininerijos etapai: (1) DNR izoliavimas; (2) geno
izoliavimas ir klonavimas, (3) geno modifikacija; (4) transformacija (geno perklimas
svetim organizm).
izm).
DNR izoliavimas. Lstels branduolyje yra chromosomos, sud
DNR molekuli, kuriose esantys genai slygoja vis organizmui reikaling baltym gamyb.
Reikia iskir
arytos i
ti i DNR molekul i kit lstels organeli ir chromatin sudarani baltym:
stu azotu ir sutrinami, taip suardant lsteli sieneles; (2)
e tirpale ir centrifuguojami: tirpalas sluoksniuojasi ir
kitos sunkesns molekuls nusda mgintuvlio dugne; (3) pylus organinio
tirpikli
NR
a
yra isiskirdamos i tirpalo; (5)
NR izoliuojama ir laikoma pastovaus PH tirpale.
Geno izoliavimas ir klonavimas.
(1) augalo audiniai ualdomi sky
sutrinti audiniai itirpinami druskingam
DNR, RNR ir
o (pvz. fenolis), itirpsta prie DNR ir RNR prisijung baltymai; pylus vandens su
pamaiius, tirpalas sluoksniuojasi: tirpiklis su baltymais nusda, palikdamas DNR ir R
molekules virutiniame sluoksnyje; (4) paveikus tirpal ribonukleazs enzimu degraduodam
RNR, o pylus alkoholio, DNR molekuls koncentruojasi taip
D
Vizualiai iskirti gen nemanoma. Sudaromos gen
i
pecifinse bakterij DNR molekulse) kartotekos: (1) restriktazs (kerpantieji enzimai)
b bliotekos, t.y. skirting DNR dali (~geno dydio) patalpint bakterij plazmidse
(s

69
sukarpo DNR molekules apytikriai geno dydio dalis; (2) tirpalas su sukarpyta DNR
as tirpal su bakterij plazmidmis, kurios i anksto sukarpytos t pai enzim
agalba ir specialiai modifikuotos, terpiant antibiotikams atspar gen; (3) kadangi
lazmids DNR ir tiriamos DNR molekuls sukarpytos tomis paiomis restriktazmis (tinka
NR atkarp ir plazmidi DNR galai), DNR atkarpos siterps plazmids; (4) plazmids su
aujais genais terpiamos atgal bakterijas elektros oko bdu (lsteli sienels trksta ir
lazmids patenka vid); (5) bakterijos supilamos antibiotik tirpal; kadangi buvo
audotos plazmids, turinios atspar antibiotikams gen, gyvos liks tik naujus genus
rinios bakterijos; (6) bakterijos dauginasi, susidaro j kolonijos; kad kiekvienoje lktelje
t skirtinga DNR atkarpa, reikt keliolikos tkstani lkteli. Norima DNR seka ir
enas atpastamas ir taip gali bti iimamas i gen bibliotekos specifini sek ymen

pilam
p
p
D
n
p
n
tu
b
g
(ETS) ir polimerins grandinins reakcijos pagalba (4.2 pav.).




4.2 pav. Specifini DNR sek ar gen paieka bibliotekose atliekama EST ymen ir PGR
amplifikacijos pagalba.





70


4.3 Gen dytos 3 skirtingos
koduojan tis (paymta
spalvotos form


Geno m
modifikacijos principas- geno funkcini dali pakeitimas. Paro
ios dalys, o pasekoje pasikeiia baltymo amino- rgi sud
os)
odifikacija. Genus galima modifikuoti, pakeiiant j f
lygot pageidaujam poymio iraik. Prie atliekant geno m
as: (a) kada reikia norimo baltymo? (atsakingas prom
o? (promotorius); (c) kiek norimo baltymo reikia
unkcines dalis taip, kad
terpus, genai s odifikacija
reikalingas planavim otorius); (b) kur
riekia norimo baltym ? (promotorius).
) Kokio baltymo reikia? (koduojanti dalis). Reikia parinkti tikslinius geno promotoriaus ir
oduojanios dalies derinius. Pvz. jei norima modifikuoti organizm terpiant tam tikram

? (jei per genas bus ireiktas per daug intensyviai tai be reikalo
audot iteklius). Problemos pavyzdys: pastebta, kad dirvos bakterijos genas BtCRYA
amina baltymus nuodingus kenkjams; taiau perklus bakterijos gen augal, jo pradas
etiks ir nejungs geno = reikia pakeisti prad. Gali bti naudojami du inomi gen pradai-
35S, ir PEP: 35S pradas gautas i tam tikro viruso ir aktyvuota genus visose lstelse (gali
jungti bet kok gen bet kur), todl terptas genas veiks visame organizme visus metus;
(d
k
kenkjui nuoding baltym koduojant gen, reikia vertinti: k ir kada valgo kenkjai? kiek
nuodingo baltymo reikt
n
g
n

71
PEP pradas gautas i fotosintezje dalyvaujanio geno, kuris veiks tik aliuose audiniuose ir
tik iltojo sezono metu. Geno modifikacijos metodika pavaizduota 4.4 pav.

.4 pav. Geno modifikacijos metodika.


4

Transformacija tai naujo geno yra terpimas lsteles, i kuri iauginamas naujas
augalas. Genai terpiami funkcij negijusias lsteles (kalius) bakterij, daleli
bombardavimo ar elektros impuls pagalba. Mikrodauginimo metodai leidia i i lsteli
(audini) iauginti nauj augal. Geno terpimo sunkumai: genas turi patekti btent
chromosomas; po terpimo lstels turi likti gyvos; kaip identifikuoti kuriose lstelse genas
siterp? turi bti parinktos specialios lstels (kaliusas), kurios gali iaugti nauj augal;
naujas genas neturi siterpti esanio geno dal, bet j pilnai pakeisti. Taikant bakterij
transformacijos metod augalo kaliuso audiniai laikomi tirpale su bakterijomis, kurios paios
natraliu bdu terpia savo migruojanias plazmides kaliuso lsteli branduoliuose esanias
DNR molekules. Privalumai - tai natralus metodas, bakterija pati terpia savo plazmid kar
su nauju gen terpimui tinkania DNR molekuls viet (bus ivengta problem kai genas
terpiamas ne branduol ar viduryje kito geno, kas sutrikdo jo veikl).

tu
Gen patrankos
transformacijos metodas: mikroskopins aukso dalels padengiamos 100-tais geno kopij
iaunamos kaliuso lsteles. Principas- vaakumo, kameroje dalels iaunamos aukto slgio

72
dujomis. Minusas genas gali siterpti bet kur ir kelis kartus vienoje vietoje. Atliekama
transformacijos kontrol: ibandoma daug transformuot GMO augal (transformuoti
trankami pagal EST ymenis) ir atrenkami tik sveiki turintys modifikuot poym (pvz. i
1000 vnt.- 1 vnt.).
a
GM augalo iauginimas audini kultros metodu. Audini kultra tai augalo
iauginimas dirbtinje aplinkoje (in vitro) i izoliuot lsteli grups (audinio). Audini
ros principas yra toks: nedidel meristeminio (auganio) audinio dalis (i vairi augalo
pvz. i gemalo uuomazgos ar pumpuro), dedama maitinimo terp, kuri neturi augimo
hormon, sakani kok audinio tip joms vystytis, todl lstelms dalinantis,
susiformuoja specifins funkcijos neatliekani lsteli mas, vadinama kaliusu. Kaliuso
stels turi vis naujo augalo iauginimui reikaling genetin informacij. djus tam tikrus
diferenciacij gemalo ar stiebelio pirmines lsteles slygojanius augimo hormonus ir
paveikus tam tikru temperatros ir viesos rimu, iauginamas naujas gemalas ar augalas.
Tam, kad atskirti kaliuso lsteles su nauju genu, naudojami molekuliniai ymenys (ar
specialios fluorescencins molekuls), kurie terpiami naujus genus turinias bakterij
plazmides ir taip patenka augalo lsteles kartu su naujuoju genu. Audini kultros problema
tinkamos terps, aplinkos slyg reimo ir hormon derinio parinkimas, kuris gali skirtis tarp
kult
dali
l
j
-
i ir genotip. Alternatyvos audini kultrai: gen terpimas lytini organ pradines
r kiauides- i augal skliniai palikuonys turs
aujus
erciniu
umas,
r
lsteles, kurios isivystys iedadulkes a
n genus; gen terpimas tiesiogiai iedadulkes; ied mirkymas skystyje su
modifikuotomis bakterijomis (perspektyviausias).
4.2 Miko medi genetins ininerijos pasiekimai.
Miko medi genetin modifikacija atliekam moksliniu (fundamentu) ir kom
(taikomuoju) tikslais. Fundamentini moksl tikslai yra isiaikinti kokius poymiu kokie
gena slygoja, koks veikimo mechanizmas, kaip juos veikia aplinka, kokie j paveldjimo
dsningumai. Taikomj tyrim tikslai yra naudos siekimas, dirbtiniu bdu terpiant
pageidaujam poymi slygojanius genus. Poligen nulemtus poymius yra sunkiau valdyti
gen ininerijos metodais. Todl modifikacija atliekama keli gen slygojamiems
poymiams ar poymiams, poligeniniams poymiams, kuriems yra identifikuoti svari tak
turintys (pvz. homeotiniai) genai (4.5.5 pav.): (a) atsparumas herbicidams, kenkjams ir
ligoms, (b) medienos poymiai, (c) ydjimo kontrol (sterilumas: padidintas produktyv
apribotas gen/ri iplitimas, vaisi alergen sumainimas miest eldiniuose; ydjimo
indukcija: greitesn selekcija, naujos selekcijos galimybs), (d) toksini mediag skaidymas

73
(atsparumas tarai); (e) kiti specifiniai poymiai, pvz. vaistini savybi pagerinimas.
Genetini modifikacij tyrim kryptys miko medi biotechnologijos srityje: DNR se
modifikacijos (geno iraikos vietos ir produkto modifikacija) ir gen ekspresijos
reguliavimas (pvz.
k
antisens technologija). DNR sek modifikacijos. Svetimo geno terpimas
medi traliu
tai
r
rodukcija
i
genom turi neimatuojam potencial. Taip galima kryminti ris, kurios na
bdu savaime nesikrymina. Transformacijos sukl nema visuomens susirpinim ir
lm griet bioapsaugini protokol testavimui ir dauginimui atsiradim. Kai kurios alys (a
net valstijos) ir organizacijos apribojo GM medi testavim ir sodinim. Rizikos vertinimo
studijos yra reikalingos, esant modifikuot gen iplitimo pavojui. GM medi rep
turi bti eliminuota ar pavlinta iki rotacijos amiaus ribos. Biotechnologiniai metodai gal
ymiai pagerinti medienos plauo, kaip ir kit svarbi poymi kokyb ar kiekyb.Gen
reguliavimas/ijungimas. Gen funkcijos slopinimas pasiekiamas terpiant genus. is meto
bus vis plaiau taikomas, kai bus sukaupta pakankamai duomen naudojant mikrogardeli i
proteomikos analizs bdus. Ateityje isipls funkcins genomikos taikymo srii sra
taiau kartu ir etini problem gali daugti.

das
r
as,

4.5 pav. Pagrindins kryptys, kuriomis vykdomi miko medi genetines modifikacijos
tyrimai (pagal FAO 2004).



74
Daugeliuose laboratorij tuopa yra naudojama kaip modelin sistema: tinkamu
gen ininerijai, komercin svarba, pritaikomumas kitoms medi rims. Reprodukcijos
sterilumo ininerijoje naudojama strategija: padti sumainti susirpinim dl tran
plantacij veisimo (btina slyga ir komercinei skmei); ilaikyti greit augimo temp;
sumainti genetin tar. Populus genties medis buvo pirmasis genetikai modifikuotas 1986
m. ir ilieka labiausiai itirtas ir tiriamas dl genetini modifikacij panaudojimo (47 % vis
tyrim). T lemia ir kai kuri ios ries genotip lengvas genetinis transformavimas bei
vegetatyvinis dauginimas reikalingas testavimui. Toliau pagal apimt sekt tyrimai Pinus (19
%), Eucalyptus (7 %), Liquidambar (5 %) ir Picea (5 %) gentyse. GM medi bandomuosius
eldinius didele dalimi sudaro 4 gentys (Populus, 51 %; Pinus, 25 %; Liquidambar, 11 %; ir
Eucalyptus, 7 %) (FAO 2004).
Medienos savybi genetins modifikacijos pavyzdys-
mas
sgenini

lignino genetin modifikacija.
Medienos lstels pagrinde sudarytos i celiuliozs, hemiceliuliozs ir lignino, kuris
supaprastintai vadinamas lsteli klijais. Kaip ir celiulioz, ligninas sudarytas i C, H ir O2,
taiau jie idst skirtingai, suformuodami ski

rtingas molekules, klasifikuojamas kaip fenoli
polimerai, sudaryti i feno-propano monomer. Ligninas pagrinde randasi tarplstelinje
terp edienos
mas resinje
me
tarpl , (b) ruoiantis
iemai, m
tarpl
medienos l sunku
suskaldyti to tus grybine
liga pad nis lignino
panaudojim (ligninas
iskiria d
celiulioz l
maesnis lig
lignin uo celiuliozs. Daniausiai lignino genetin modifikacija atliekama siekiant
urio
nkanti jungiai) su vieno i lignino sintezei reikaling enzim
(oksida s ar peroksidazs) gen RNR; vietinio ir naujai teprto gen RNR sudarys dvigrand
RNR molekul, kuri yra sukarpoma speciali dvigrandes RNR molekules atpastani kaip
je ir suklijuoja lsteles vien prie kitos. Apytikriai liginas sudaro 1/3 sausos m
s ir yra svarbus komponentas celiuliozs gamyboje. Ligino ypa daug komp
dienoje (stiebo sulinkimo pusje). Ligninio biologins funkcijos: (a) ligninas upildo
stelin terp taip suklijuodamas lsteles ir priduodamas medienai tvirtum
edeli gliai lignifikuojasi- virsta i ali sulting sumedjusius rudus-
stelinje terpje spariai sintetinamas ligninas virsta el formos mas ir apsaugo
steles nuo alio; (c) ligninas padeda formuoti vandens indus, lignin
dl jis yra efektyvus fizinis barjeras ento ir fito kenkjams (usikr
idja lignino sintez) be to jis palaiko stiebo stabilum (tvirtum). Ekonomi
as: (a) daugiau lignino: tvirtesn mediena, didesn energetin vert
augiau energijos nei celiulioz), (b) maiau lignino: popieriaus gamyboje, kur
atskiriama nuo lignino, kas yra ekonomikai ir ekologikai brangus procesas. Tod
ino kiekis pageidaujamas poymis popieriaus mass gamyboje, kai reikia atskirti
n
sumainti jo kiek ir tinkamum popieriaus gamyboje. Modifikacijos tikslas terpti gen k
iRNR yra komplimentari (ti
z

75
nenorm

diata

ar

al reikin enzim ir taip slopinant i gen veikl ir ligninio sintez (antisens
technologija 4.6 pav.). Identifikuotas vienas i lignino sintezje dalyvaujani gen 4CL ir
sumainta jo ekspresija, naudojant antisens metod. Pakeitus lignino sudedam dali
syringilio ir guaiacylio santyk, galima lengviau atskirti lignin nuo celiuliozs (Pinus ra
Jounin ir Goujon 2004). Identifikuotas vienas i syringilio sintezje dalyvaujani gen-
CAld5H (reguliuojanio syringilio sintezs intensyvum) ir modifikavo CAld5H ir 4CL gen
ekspresij drebulje. Rezultate GMM turjo 52 proc. maiau lignino, taip pat GMM buvo
pagreitinta ksilemos lsteli branda (Populus Chiang ir kt. (2003).




4.6 pav. Antisens technologija, pritaikyta lignino sintezs slopinimui, terpiant oksidazs
peroksidazs enzim gen RNR (paveiksle nurodoma kaip lignino gen) komplimetari
RNR koduojanius genus.

Atsparumo oksidaciniam stresui genetin modifikacija. Tokie aplinkos stresai kaip
ozonas, intensyvi viesa, karis ir sausra gali sukelti oksidacin stres augalo lstelse.
Oksidacinis stresas (OS) apibriamas kaip aling laisvj radikal molekuli kaupimasis
augalo lstelse. Laisvieji radikalai tai atomai ar j grups turintys neporin elektron skai
(laisv elektron) ir todl yra labai reaktyvs, gali paeisti lsteli sienels, baltym ir DNR
molekules. Molekuliniame lygmenyje OS sukeliamas kai laisvieji radikalai prisijungia i kito
i
s

76
molekuls deguonies atomo vien elektron. ioje formoje deguonis sudaro ypa reakty
hidrokslio radikalus. Enzimas superoksidismutaz (SOD) skaldo laisvuosius radikalus ir taip
juos neutralizuoja. Genetin modifikacija, iuo atveju, galima terpti modifikuot SOD
su daniau transkribuojamu promotoriumi ar terpiant daugiau SOD geno kopij. Bandymai
parod, kad tabako augalai su padidinta SOD geno ekspresija buvo labiau atspars ozono
poveikiui, o GM medvins , alfaalfa ir kukurz augalai buvo atsparesni aplinkos stresams
(Breusegem ir Inze 2004). Su sumedjusiais augalais tyrimai atliekami Suomijos
biotechnologijos institute, kur Betula pendula medeliai paveikiami kritin
vius

gen
mis ozono dozmis,
kas sukelia laisv radikal formavimsi lsteli sienelse bei kartu aktyvuoja u i radikal
neutralizacij atsakingus genus. I kontrolini ir paveikt medeli t pai audini
identifikuojami tie genai, kurie buvo ireikti stres patyrusiuose augaluose bet nebuvo
ireikti kontroliniuos augaluose (2 to paio genotipo kopijos gali bti naudojamos kaip
kontrol ir kaip testuojamas augalas, taip eliminuojant skirting genotip efekt, 4.7 pav.). ie
kandidatiniai genai toliau tiriami: sekvenuojami, skaidomi funkcines dalis, lyginami su
genais duomen bazse bei naudojami GM ibandymuose. Indukuojamos dirbtins mutacijos
ir stebima kuris i kandidatini gen turi stipresn tak poymio iraikai. Kadangi O3
poveikis aktyvuota etileno sintezs gen veikl, bandoma etileno kaip signalins molekuls
apie stres perdavjo vaidmuo atsakant laisv radikal atsiradim ir atitinkam gynybini
gen aktyvacij (Arabidobsis). Pagrinde tyrimai su tabaku ir Arabidobsis (Breusegem ir Inze
2004).


4.7 pav. Skirtingai (diferencijuotai) ireikt gen paiekos modelis miko mediuose.


Ireikt gen
identifikacijos
modelis
DNR
RNR

77
Atsparumas vabzdiams. Tai labiausia paplits GM poymis tiek ems tiek mik
kyje. Principas: identifikuojamas ir terpimas atitinkamam kenkjui nuodingo baltymo
sintez slygojantis genas. Taip ivengiama ekonomini nuostoli bei brangaus ir gamtai
alingo purkimo insekticidais. Baltymas gali bti nuodingas ir giminingam kenkjui. Taip
GM patirtis i ems kio buvo pritaikyti miko mediuose. Skmingiausias pavyzdys CR
genai, identifikuoti ems bakterijoje Bacillus thuringiensis (Bt CRY genai) slygojantys
kenkjams nuoding baltym sintez. CRY gen su augalams bdingu promotoriu
augalus jie tampa atspars kenkjams. Naudojami ir virkinimo toksini genai (PIN2 bulvs
genas, stabdantis proteazs sintez). Bandymai atlikti su drebule, maumediu, eukaliptu, kai
kuriomis puies ir egls rimis) (Klopfenstein ir kt. 1991, Heuchelin ir kt. 1997, Su
Lagrimini 1993, Lida ir kt. 2004). Iki 2006 m. vienintel komerciniu bdu naudojama G
miko medi ris yra Populus tomentosa Kinijoje: terptas vienam i lap kenkj nuod
baltym sintetinantis modifikuotas CRY genas (4.7 pav.). Jautrios vabzdi gentys:
Lepidoptera, Coleoptera, Dipytera.

Y
mi terpus
llivan ir
M
ing


4.7 pav. Genetikai m dfiikuot BtCRY gen Populus
tomentosa tapo atspari lap


Atsparumas virusam
odifikuota drebul Kinijoje: terpus mo
grauikams (nuotrauka Dag Lindgren).
s. Po bakterij ir grybini lig
ikroorganizm sukeliani pakenkimu
virusai yra treia pavojingiausia
augalams patogen (m s) kategorija. Virusai siterpia
apkrst s lstels DNR ir dideliais kiekiais gamina savo apvalkinio baltymo ir DNR ar RNR
li
uvim kad ivengti kaimyni audini infekcijos. Genetin modifikacija gali padti (Jeske
o
kopijas ir taip sutrikdo normal lstels funkcionavim ar indikuoja uprogramuot lste
,

78
2004):

s
(a) kosupresija, kai identifikuojamas viruso baltyminio apvalkalo sintezs genas ir jis
terpiamas augalo DNR, virusins infekcijos atveju, augalo imunin sistema greiiau
sureaguoja padidint io geno iraik ir blokuoja tiek virusinio tiek modifikuoto geno
transkripcij (paprastai metilinant geno promotori); (b) antisens metodai, kai terpiami
virusini gen antisens genai blokuojantys j transliacij ar dviej grandini RNR molekuls
atpastamos specifini RNR degradazs enzim ir yra degraduojamos, (c) daugumai em
kio kultroms pavojing virus genai identifikuoti ir j sekos inomos (Jeske 2004).
Atsparumas grybinms ligoms. Enzimai glutanaz ir chitinaz yra susij su
patogenins grybienos lsteli sieneli hidrolizacija ir padidina augalo atsparum grybinei
ligai (pvz. Cercospora bacco tabako augaluose) (Tenhaken 2004). Antimikrobiniai peptid
(defencin) genai enkliai padidina atsparum prie bakterijas, grybines ligas ir net virusus.
Pvz. teigiam rezultat dav bandymai su transgeniniais tabako augalais su i ridiko izoliuotu
defensino genu RsAFLP2: enklai padidjo atsparumas grybinms infekcijoms. Dide
lipid transportavimo peptid LTP2 g

sn
en ekspresija transgeniniuose Arabidobsis augaluose
padidino atsparum grybinei infekcijai (Tenhaken 2004). Modifikuoti ribosomas
deaktyvuojani baltym u promotoriumi deakatyvuoja
tik svetim lsteli ), ir padidina atsparum prie
mikrobus ir grybines ligas (bandym uotos
lsteli mi promotori.
Kartu su uvusiomis l
Atsparum
(RIP) genai su paeidimu indukuojam
ribosomas (sustabdo baltym sintez
ai su tabako augalais) (Tenhaken 2004). Program
rties geno ekspresija prie io geno prijungiant patogeno indukuojam
stelms na ir patogenas (Tenhaken 2004).
as herbicidams. gijus atsparum herbicidams, gali
as krm ris miko eldiniuose.
terpimas modifikuotas genas, sintetinantis tam
ma efektyviai kontroliuoti
agresyvias piktoles ir nepageidaujam Principas: (1)
identifikuojamas ir tikrai herbicid klasei
jautrius bet modifikuotus baltymus ir herbicido toksinai nesijungia prie modifikuoto geno
baltym triptofano, tyrosino ir
m valino ir leucino
sitenz opulus tremula ir Pinus radiata); (2) identifikuojamas ir terpimas i mikrob
izoliuo
(pvz. herbicidas glifosatas (Roundap) blokuoja baltym
fenilanino sitenz Populus alba, Populus trichocarpa, Eucalyptus grandis, Larix decidua ir
Pinus radiata medeliuose, herbicidas chlorosurfulonas blokuoja balty
P
tas genas koduojantis enzim, kuris detoksikuoja (sugeria ir degraduoja) herbicido
toksinus (GM naudota vairi Populus ri medeliuose, Eucalyptus, Picea abies (Ho ir kt.
1998, Bishop-Hyrley ir kt. 2001).
Atsparumas sunkiesiems metalams. Sunkieji metalai (pvz. Cu, Zn, Ni, Cd, Hg) sudar
junginius su azoto atomais baltymuose ir taip juos deaktyvuoja, bei jungini su 02 pasekoje
o
produkuoja alingus laisvuosius deguonies radikalus. ie pakenkimai danai sukelia spygli

79
ar lap chloroz (geltimas dl chlorofilo netekimas) ir stabdo augim. Principas: randami su
atsparumu susij genai ir stiprinamas j poveikis modifikuojant iuos genus prijungiant
daniau transkribuojamus promotorius. Identifikuotos gen grups: (1) neutralizavimas p
junginius su nemetalais (paprastai jungtys su baltymais vad. paprasfitochelatinu,
metalotioneinu)), (2) sekvestracija (metalo jono prisijungimas); (3) alinimas i lsteli; (4)
biotransformacija (gen modifikacija i bakterij atspari tam tikram metalui (pvz. merA
genas i bakterijos, skaidantis gyvsidabrio jonus); (5) taisymas- genai atsakingi u paken

er
kt
audini gijim.
ydjimo ir vyriko sterilumo indukcija. Mediai be vyrik ied/strobil neskleist
iedadulki: (a) GM mediai gali bti bandomo be GM pasklidimo rizikos, (b) mediai
sodinami miestuose, kur yra nemaai iedadulkms alergik moni. Principas: (a) terpimas
lsteles udani genus (pvz. Barnazs genas, degraduojantis visas RNR) su iedini
struktr gen promotoriais (bandymai su Populus. Kitas bakterijos rastas genas Barstar y
Barnazs inhibitorius ir naudojamas kontroliuoti jo ekspresij; (b) su iedini struktr
iniciacija susijusi gen supresija ar, norint saktinit ydjim, yd formavimuisi
gen (FLC ar EMF) supersija antisens metodu. Pinus radiata, Arabidobsis, Betula pendula,
Ecalyptus, Populus ryse identifikuoti ied iniciacijoje dalyvaujantys ir vyrik strob
formavimo genai ir j promotoriai (pvz. LEAFY, PrCHS1 ir PrCHS2 ekspresijos tyrimai ir
cDNR sekos, Walden ir kt. 1999). Ankstyvo ydjimo jungimas: padidinta LEAFY geno
ekspresija su CaMV35S promotoriumi indukavo ankstyv Arabidopsis

ra
kliudani
il
ydjim. Bandomos
rys: Eucalyptus, Populus, Betula. Skinner ir kt. 2000, Mellan ir kt 2001, Lemmetyinen ir
Sopanen 2004.
Atsparumas klimatiniams aplinkos stresams. Atsparumo tokiems stresams kaip sau
ar altis poymiai yra kompleksins daugelio gen sinergetins veiklos pasekms. Todl,
norint pasiekti rezultat, reikia skaidyti iuos kompleksinius poymius. Iskiriamos tokio
atsako stres kategorijos: (a) greita reakcija (alinami tiesioginiai pakenkimo padariniai;
atsako sistemos panaios tarp ri), (b) pokyiai, kad pasiekti nauj metabolizmo
pusiausvir, esant stresui (pvz. udaryti stomatas esant dehidracijai), pvz. PaFT4 geno
ekspresija p. egls medeliuose susijusi su pumpur sukrovimo laiku ir rudenini aln
pakenkim ivengimu (Gyllenstrand et al. 2007) (3) ilgalaikiai vystymosi pokyiai. Vystam
tokios miko medi atsako aplink
sra
s
os
os stres modifikacijos ir tyrim kryptys: (a) skatinti
metabo

lizm, terpiant aktyviau transkribuojamas atsaking gen kopijas ar kelias geno
kopijas (pvz. spartesnis augimas per azoto asimiliacijos efektyvumo padidin (tyrimai su
Picea ir Populus, Gallardo ir kt. 1999) ar osmotinio slgio reguliavimas ksilemos tracheidse;

80
(b) streso signalo perdavimo sistemos efektyvumo didinimas (pvz. atsakas dehidracij ir
vaksini jungini sintez lapo epidermyje, ar stomat udarymo greitis ir standumas; stie
spygli lignifikacijos greitis atsake emesnes temperatras, atsako fotoperiodo pokyius
greitis; pagrinde su signalini molekuli (giberelinas, ABA rgtis, etilenas, citok
sinteze susij genai; (c) ekspresijos tyrimai ir skirtingai ekspresuot DNR analiz bei susijus
gen identifikacija (atsako stres tyrimai klimatinse kamerose, cDNR analizs ir EST
ymen krimas).
bo ir
ininai ir kt.)
i
odifikacij pasiekim miko sektoriuje apibendrinimas. Genetini m Transformuot
augal
- 17)

in vitro regeneracija turi technini apribojim daugumai ri ir genotip. Genetikai
transformuot augal linijos yra sukurtos Populus, Eucalyptus, Pinus (kartu su P. taeda
ir Picea geni rims. Regeneracijos procesai dar nra tinkamai itirti ar netgi tinkamai
kontroliuojami (ypa brandiuose audiniuose). Dar nra GM medi, kurie galt bti
panaudoti komerciniais tikslais (www.agbios.com). Kontroliuojani poymius gen
terpimas yra ribojamas esant nepakankamai ini apie molekulin i poymi kontrol
Dauguma svarbi selekcijai poymi (augimas, adaptyvumas, medienos kokyb ir pan.) yra
poligeniniai, todl atskiras genas maai takoja poymio pasikeitimus. Aplinkosaugos
taisykls nurodo, kad GM naudojimo taka aplinkai turi bti sekama ilg laik (ia bt ir
gen stabilumas, iedadulki ir skl platinimas, taka kitiems ekosistemos elementams).
Taisykli grietumas lemia galutinio produkto kainos padidjim, lyginant su vienmeiais
augalais. Plaios bendradarbiavimo programos, kaip kad Populus, Pinus ir Eucalyptus
tyrimai, skatina pasiekimus miko medi genetini modifikacij srityje. Yra inicijuojami
GM medi stab
.
ilumo abiotinio streso slygomis ir j takos aplinkai projektai. Daug naujos
inform


teomikos
iems
oleri,
os
jim
acijos yra gaunama i genom bibliotek apie medienos kokyb, augim ir atsparum
stresoriams. Ypa EST bazi vystymasis turi didel potencial, taiau j panaudojimas
praktinje selekcijoje vargu ar prasids ateinaniame deimtmetyje. Kai kurie mokslininkai
mano, kad genom tyrimai bus pleiami ymiai daugiau nei gentini transformacij. Daug
kas priklausys nuo to, kaip i sritis vystysis ems kyje. Tyrimai genomikos ir pro
srityje padidins ir klasikins selekcijos efektyvum. Klasikiniu selekcijos bdu gaunam
miko medi varietetams prireikia 15-20 met ir tai kainuoja madaug 400 000 JAV d
neskaitant investicij (Fenning and Gershenzon 2002). Kol kas molekuliniais ymenimis
paremtai selekcijai reikia kur kas daugiau investicij. Taiau tikslesn selekcins mediag
atranka ir vertinimas, paremti biotechnologiniais metodais, pads pasiekti didesni laim
klasikinje selekcijoje.

81
Bioetika. K mano mokslininkai? Tai yra mitas, kad mons sugalvojo gen
perklim augalus. Tai vyko daug milijon met per dirvos bakterijas, ir dabar yra galimyb
panaudoti j DNR genetinei transformacijai miko mediuose. Mes turtume galvoti apie
galutin produkt, o ne apie proces, kuriuo jis gaunamas. Ir nieko nra blogo tame, kad
genetin ininerija reikalauja kruoptaus patikrinimo, nes ir prastins selekcijos bdu gauti
genotipai yra dar kruopiau tikrinami ar testuojami (Prof. Toby Bradshaw, Vaingtono
universitetas). Viena dilema ilieka, ir ji susijusi su GM geno, migravusio natral medyn,
atpain

).
imu, nes kultrini augal selekcija buvo vykdoma imtmeiais, o miko medi ji
siekia tik kokias 4 kartas ir dl to jie maai skiriasi nuo neselekcionuot genotip. Todl
reikt naudoti gen ymen Catch-22, kad aptikti t gen (Prof. James Hamrick, Dordijos
universitetas).
4.3 Genetins modifikacijos taikymo mik kyje ypatumai.
Dabartiniu metu pasaulyje yra vir 210 bandym su GM miko mediais, 16 ali
(pagrinde JAV). Daniausiai tiriamos 4 gentys: Populus (51%), Pinus (23%), Liquidambar
(11%), Eucalyptus (7%). Pus GMM tyrim skirti metod krimui (gen stabilumas,
ekspresija) ar fundamentaliems klausimams. Kita pus tyrim: (a) tolerancija herbicidams
(13%), (b) tolerancija kenkjams (12%), (c), chemins medienos savybs (9%), (d)
reprodukciniai poymiai (6%) (FAO 2004 FAO.2004. Preleminary rewiev of biotechnology
in forestry including genetic modification. Working paper FRG/59E, FAO, Rome, Italy.
Komerciniu mastu GMM naudojami tik Kinijoje: Populus hibridai (P. alba x tomentosa) ir
Populus nigra, kuriuose buvo terptas modifikuotas Bt genas, koduojantis kenkjams
nuoding baltym. i modifikuot medi naudojimo apimtys: 300-500 ha (2002 m.). Atlikti
dviej pakop lauko ibandymai ir gauti visi teisiniai leidimai, reikalingi Kinijoje.
Su GMO testavimu susijusios problemos. Testavimui reikia laiko Prie naudojant
genetikai modifikuotus medius komerciniu mastu juos reikia ibandyti. Tam reikia nema
laiko. ems kyje GMO testuojami keli rotacij metu. Kaip su miko mediais? Ar genas
bus ireiktas? Kaip takos kitus poymius? Ar naujai terptas genas bus ireiktas vlesniame
amiuje? Puis ir egl testavimas trukt bent 20 met. Tai gana nemaos laiko ir kat
investicijos. GM sukelia esminius tikslinio poymio pokyius, kurie yra drastikesni nei
klasikinje selekcijoje, bandant pakeisti gen danius. Todl GMM ibandymas turt bti
ilgesnis. Ryiai tarp poymi, vertint laboratorinje ir lauko aplinkose danai bna silpni:
reikalingas ilgesnis testa
ai

vimas.

82
Ar galima lengvai pritaikyti ems kio GMO pasiekimus mik kyje? Testuo
santykinai trumpai ir nedideliuose bandymuose, ekologins GM pasekms gali likti
nepastebtos. Atsparumas herbicidams turi ribot panaudojim mik kyje. Vienintel
realizuota nauda tai atsparumas kenkjams, lignino kiekio lstelse ir iedini struktr
modifikacija.
jant
Svarbu integruoti tradicini miko medi genetini tyrim rezultatus GMM
tyrimus. Pastaruoju metu nemaa dalis miko medi genetini tyrim finansavimo yra
nukreipta GMM ir su jais susijusiems biotechnologijos tyrimams. enkliai sumajo kit
miko medi genetikos srii, kurios yra naudingos mik kiui, finansavimas. Miko
medi biotechnologiniai projektai per daug sukoncentruoti metod vystym ir praranda
ssajas su nemaa miko medi tyrim patirtimi (Fenning 2002).
Su GMO dauginimo kiniame lygmenyje susijusios problemos. I keli transformuot
pus reikia padauginti
vegetat u
ez ar
aprasti
d

lsteli reikia iauginti medel ar kelet medeli. Transformuotus genoti
yviniu bdu iki komerciniu mastu priimto donorini genotip skaiiaus. Komercini
mastu donorinius genotipus reikt dauginti vegetatyviniu bdu ekonomikai efektyviais
metodais. Nepageidaujami GMM gali pasklisti per iedadulkes. Naudojama organogen
somatin gemal genez: gaunama apie 10 medeli. ie 10 medeli testuojami- ar bus
ireikti terpti genai. Produkuojamas didesnis skaiius donorini genotip: galimi p
augn aknydinimo metodai. Komercinis naudojimas: masinis dauginimas- efektyviausia
vegetatyvinis: organogenez, somatin gemal genez, augnai (rooted cuttings). i meto
kombinacija priklauso nuo ries vegetatyvinio dauginimo ypatum: pagrinde spygliuoiai
lapuoiai.
Reikalingi tiek metodiniai tiek statyminiai mikininkysts taisykli polyiai.
Palyginkime prastin mikininkyst su GMO naudojimu. prastin mikininkyst: (a)
selekcija = pranas genotipai; (b) sklin plantacija/medynas= sklos, (c) medelynas =
sodmenys; (d) eldymas ilgos apyvartos kiniai mikai (pakankama ries genetin
vairov, gamtai artimas idstymas, ri miiniai)l (e) medyn prieira (retinim sistema,
sanitarin prieira), (f) galimas natralus medyn atkrimas. GMM mikininkyst. (a)
selekcija = pranas genotipai, genai ir GMM sukrimas; (b) GMM mikrodauginimas
laboratorijoje ir = donoriniai klonai; (c) medelynas ir vegetatyvinis dauginimas = sodmen
(d) eldymas trumpos apyvartos kiniai mikai (nedidel ries genetin vairov, kiniu
poiriu patogus sistematinis medi idstymas); (e) medyn prieira (sanitarin prieira
(f) negalimas natralus atkrima
ys;
);
s. Esminis skirtumas- GMM auginimas galimas tik trumpos
rotacijos eldiniuose. Sklins plantacijos- nereikalingos, nes GM reprodukcin mediaga

83
gaunam i
mins
da
a naudoti sterilius medius; galima apseiti be gamtinio aspekto (4.9 pav.).
Monok keli
i bti
je ir Pinus sylvestris (deinje) bandomieji eldiniai Rok
004 m.)
a tik vegetatyviniu bdu (kodl? Dl rekombinacijos nemaa dalis sklini palikuon
gali neturti terpto naujo geno). Tinkamiausi GMM panaudojimui yra auktos ekono
verts ri trumpos rotacijos eldiniai (pvz. Populus, Eucalyptus): aktualiausia GM nau
(dabartiniu metu rezistentikumas kenkjams); maesn pasklidimo rizika (nes rotacija
trumpa); galim
loniniai GMM eldiniai bt jautrs kitiems aplinkos veiksniams. Reikt bent
klon. pvz. tam, kad kenkjai negyt imuniteto GMM Bt geno baltymui, tarp GMM gal
maiomi nemodifikuoti klonai. Tam, kad sumainti GMM pasklidimo rizik, GMM
eldiniams tikt nevietins rys (4.8 pav.)

4.8 pav. Pinus controrta kair
Kelmyne (2

Genetikai modifikuot augal keliami pavojai ir j vertinimas. GMM gali leng
pasklisti: sklos neamos vjo; iedadulks skrenda tkstanius kilometr; lytins
reprodukcijos bdu gauti GMM palikuonys gali turti defekt, kurie nekontroliuojama
pasklist. Ieitis- sterils mediai. Sterilumas gaunamas terpiant knock-out genus, kurie
ijungia lytins struktras brandinanius genus. Sterilumo indukcija padidina GMM k
katus. Genetikai modifikuoti organizmai: (a) patys gali neturti tiesiogins neigiamos
moni sveikatai, bet j metabolizmo produkt poveikis gali bti toksikas arba alerginis ir
pasireikti daug vliau po kontakto su tokiais organizmais; (b) gali bti patogeniki monm
kurie turi imunitet natraliai egzistuojantiems organizmams; (c) gali bti potencialus
nepageidaujam gen kombinacij perdavimo kitoms organizm rims horizontalaus gen
dreifo metu altinis; (d) gali pasireikti netikt poymi genetikai modifikuotuose
vai
i
rimo
takos
s,

84
augaluose, neprognozuojamai pakisti augal populiacijos dl konkurencinio pranaumo,
palyginti su nepakeistais augalais. Tai i esms gali pakeisti evoliucijos krypt ir sukelti
nevienodas pasekmes teik gyvnams, augalams, tiek ir monms. Gen ininerija palyginti
nauja biotechnologijos sritis ir iki iol pasaulyje ji vertinama nevienareikmikai. Didia
pavojus ikyla kai genetikai modifikuoti augalai ar gyvnai ileidiami aplink, kur jie tur
galimyb krymintis su laukiniais augalais ar gyvnais. Taip gali bti sunaikintas natralus
genofondas, paeistas ekosistem stabilumas. Danai GMM bandymai tampa alij ar
eko-faist protestuojani prie GMO aukomis (kaip ir bangini ar vri mediok
skerdyklos, branduolins jgains, plyni miko kirtim
usias
i
l,
ai). GMO lauko test priirtojai
danai baiminasi j sunaikinimo. Pasekms padidj GMO sukrimo katai.





4.9 pav. GMM mikininkysts modelis.


Apibendrinant, GMM gali bti netolimoje ateityje naudojami jei (a) rotacija
apie 10-15 met ; (b) egzotin ris (ribotas iplitimas); (c) egzistuoja klonins
mikininkysts metodai (ekonomikai efektyvus vegetatyvinis dauginimas); (d)
veikianti selekcin programa (nra adaptacini problem, yra kompetencija ir lauko
bandymai); (e) noras rizikingai investuoti.




85
5. Genetins vairovs tyrimai.
5.1 vadas
Tam tikros miko medi ries genetins vairovs tyrimai (ries viduje) skirti
genetins vairovs dydio, pobdio ir geografinio isidstymo dsningum nustatymui
molekuliniame lygmenyje, populiacij evoliucijos ir dinamikos bei mogaus takos
populiacij genetinei vairovei tyrimai, panaudojant molekulinius ir genetinius ymenis bei
populiacins genetikos principus.
Didioji dalis medi molekulins genetikos tyrim atliekama genetinei vairovei ta
populiacij ir populiacij viduje itirti (57% vis tyrim), nemaai tyrim skirti
rp
itirti gen
geografin perneim poledynmeio migracijos kelius ir gen perneim tarp populiacij
(12%) bei poravimosi sistem ir giminysts ryi populiacijose tyrimams pirt antspaud
me
nra pla ose.

susikrim tu (pvz.
prieglobs
klimatini
poym dis);
(c) m k
veisimas).
5.2 Tyrim
viduje,
tarp populiacij, tarp region ir kt. vertinimas; (b) Ryi tarp individ, populiacij, region ir
kt. vertinimas apim atstum tarp vis por apskaiiavim; (c)
ryi tarp individ, populiacij, region, gaut analizuojant skirtingus poymi rinkinius,
pavaizdavimas klusterin
ymens n
(1) kiekybiniai
todais (12%), taksonominiai ir filogeneiniai tyrimia (6%). Kol kas i tyrim rezultatai
iai taikomi praktinse miko medi genetini itekli isaugojimo program
Medi ri populiacij genetin vairov ir populiacij struktra priklauso nuo (a) j
o istorijos- evoliucijos paskutinio ledynmeiu ir poledynmeiu period me
io zonos; migracijos keliai, gen migracija tarp populiacij; ekologini ir
slyg pobdis (gradientas) j plitimo regionuose); (b) ri gyvavimo istorijos
iai (pvz. apdulkinimo dsningumai; skl plitimo dsningumai, dauginimosi pob
ogaus veikla (pvz. emdirbysts plot pltra mik sskaita, skl perklimai, mi
metodika
Genetins vairovs analiz apima iuos tris etapus: (a) Variacijos populiacij
a geometrini arba genetini
se dendrogramose.
Molekulini ymen duomenys yra binariniai: turi tik dvi reikmes 1- ymuo yra , 0
ra (5.1 pav.). Duomen statistinje analizje naudojami kintamieji skirstomi taip:
kintamieji: (a) tstiniai, turintys bet koki reikm, pvz. medi auktis (m),
), dien skaiius iki pum akn svoris (g), lapo plotis (cm pur sprogimo (dienomis), (b)
diskretiki, ireikiami pilnu skaiiumi, pvz. vaisi skaiius: 1, 2, 3, 4, 5 ir t.t., grybo
vaisiak skaiius: 1, 2, 3, 4, 5; (2) kokybiniai ni poymiai ar savybs: (a) kategoriniai,

86
turintys reikmes i daugelio galim: (i) eilikieji (ordinal): kategorijos, kurioms bdingas
mo laikas - 1, vidutinis - 2, vlyvas 3, (ii) nominals:
kategorijos, kurios nesusij, pvz., ied spalva: geltoni - 1, raudoni - 2, balti - 3, purpuriniai
4, (b) b
Tarppopulacin genetin vairov vertinama naudojant iuos rodiklius: (a)
ciacija pagal vien lokus (gST); (b) tarppopuliacin diferenciacija
pagal k
t
ius lokuse; (b) pagal variant danum
naudoj ;


se
ini
tie
patys). D = 1 kai du pavyzdiai neturi bendr genetini element
eilikumas, pvz., ankstyvas sprogi
inariniai, turintys tik dvi reikmes: yra - 1, nra - 0, pvz., alelis lokuse, lap
plaukuotumas, lig ar aln paeidimai ir kt.

5.1 Molekulini ymen duomen masyv sudarumas. Viruje elektroforezs DNR
fragment profilis. Apaioje DNR fragment buvimas ar nebuvimas elektroforezs gelyje
paveriamas 0 ir 1 duomen masyv.

tarppopuliacin diferen
elet lokus (GST); (c) populiacijos indlis bendrai genetinei vairovei; (c) F statistika
(Wright); (d) molekulins dispersijos analiz (AMOVA). Molekulini ymen genetin
vairov populiacij viduje vertinama: (a) pagal variant skaii - naudojant iuos rodiklius:
polimorfizmas (polimorfizmo mastas) Pj; polimorfini lokus proporcija; alelini varian
turtingumas (kiekis) A; vidutinis aleli skai
ant iuos rodiklius: vidutinis laukiamas heterogenikumas He; Nei genetin vairov
efektyvus aleli skaiius Ae. Tai pat gali bti vertinama nukleotid vairov pagal kelet j
sek atskirame genomo regione populiacijoje (rodiklis kinta nuo 0 iki 1 ir parodo nukleotid
vairov pagal kelet sek duotame genomo regione. Jis yra tapatus aleli vairovs loku
rodikliui). Genetinis atstumas tarp dviej pavyzdi yra ireikiamas proporcija genet
element (aleli, gen, gamet, genotip), kurie dviejuose pavyzdiuose nra bendri (ar

87
Objektai grupuojami ar klasifikuojami kategorijas ar klases pagal j bendrus bruo
arba ryius. Grupavimas gali bti: (a) hierarchinis: (i) esminis, kuris mgina atskleisti tikr
prigimt ar form, (ii) kladistinis, kuris remiasi geneologija ar filogeneze, (iii) evoliucinis,
kuris remiasi filogeneze ir evoliucini pokyi kiekiu, (iiii) fenetinis, kuris remiasi d
kiekiu organizmo poymi ir jo gyvenimo ciklu
us
j
idiausiu
; (b) nehierarchinis; (c) persidengiantis.
Efektyvus yra fenetinis grupavimo metodas tai vairi poymi naudojamas klasifikacijos
proced i trys
jungimo
pai
me
5.3 Tyrim
roje: morfologini, fiziologini, ekologini, molekulini, citologini. Naudojam
pagrindiniai grupavimo metodai: paprastojo jungimo (artimiausios kaimynysts); pilnojo
(toliausios kaimynysts) ir vidutinio jungimo (UPGMA). Skirtingi metodai i t
duomen sudaro skirtingas dendrogramas. Tyrjas turi ianalizuoti ryius keliais
todais ir analizuojant kartu su kita turima informacija pasirinkti labiausiai tinkani.
pavydiai
Populiacij genetin vairov (ries viduje). Tyrim pavydiai:
Serija Quercus robur tyrim Europoje pagal chloroplast DNR paplitim ir variacij
nustatant filogeografin struktr, poledynmeio migracijos kelius ir ledynmeio
io zonas ir kt. (Petit et al, 2002, Csaiki et al 2002 ir kt.),

prieglobs
rimai
s Europoje tyrimai DNR mikrosatelit ymen
paga
udoti
,
Fraxinus excelsior genetins vairovs pasiskirstymo, filogeografins struktros ty
chloroplast DNR ymen pagalba (Vendramin et al 2006)
Fraxinus excelsior genetins vairov
lba (Heuertz et al 2003, 2004).
Fagus sylvatica chloroplast DNR haplotip pasiskirstymo studijos Europoje (Vendramin
et al, 2006).
Picea gentyje buvo ivystyti motinine linija paveldimi mitochondrij ymenys ir pana
tiriant populiacin struktr iauriniame juodosios puies arealo pakratyje (Jaramillo-
Correa et al. 2002).
Sukurti kodominantiniai mikrosatelit ymenys Kanados medi rims Larix layalii
Larix occidentalis (Khasa eta al 2000, Rahman et al 2001), Picea glauca (Hodgetts et al
2000) tinkami selekcijai vystyti, palyginamajai genomikai, molekulinei ekologijai,
genetini resurs tvarkymui ir isaugojimui.
Tiriama genetin vairov ir populiacin struktra Larix layalii ir Larix occidentalis
Kanadoje (Khasa et al in press).

88
ES FP7 projekto EVOLTREE programoje (2006-2010) Europoje numatoma identifikuoti
adaptacijai klimato pokyiams reikmingus genus ir tirti genetin

vairov trijose
mod
5.2 menis
(V l haplotipin
dif ldinmetins imigracijos

5.3
Ec grups. Du atskiri iplitimo arealai:
a)iaur eio rekolonizacija vyko i 2 arba 3
elinse medi gentyse (Pinus, Populus ir Quercus).


pav. Fraxinus excelsior populiacij vairovs tyroimai pagal chloroplast DNR y
endramin ir kt. 2002) . Analizuotos 185 populiacijos. Nustatyta dide
erenciacija; keturios pagrindins haplotip grups sutikanios su po
keliais; atitikimas tarp iedadulki ir genetini duomen.
pav. Picea abies mtDNA kartotin sek variacija (Sperisen ir kt (2001) - Molecular
ology 10: 257-263). Dvi pagrindins haplotip
s Europa b)Piet-centrin Europa. Poledynm
ledynmeio prieglobsio zon: Maskvos ir Karpat bei Balkan.


89
Filogeografini studij apibendrinimas. Daugumai medi ri bdinga
geografin struktra. Diferenciacija pagal cpDNA stipriai varijuoja priklausomai n
l perneimo (skleidimo) strategij. Daugelio medi r
filo uo
sk i divergencijos ir vairovs
ndencijos Europoje yra panaios. Ledyn prieglobsio zonoms charakteringa didel
divergencija bet nedidel
genetin
esmin inform
suprasti pasekm
atsivelgti
genetin sistem
rekombinacij
tyrima
nem
populiacijas, kuri
inform
ilogeografiniai tyrimai turt galinti prognozuoti ri migracijos pobd, apimtis ir kryptis
torizacija galins sertifikuoti ir
sekti medienos judjim panaudoti
sertifikuoti/ym
Filogenetiniai ty
te
variacija populiacij viduje. Dl gen perneimo ir hibridizacijos
vairov populiacijose didja iaurs kryptimi nuo prieglobsio zonos.
Filogeografini tyrim ir pritaikymo perspektyvos. Filogeografiniai tyrimai gali teikti
acij, galinani atskirti dabartinius procesus nuo proces, vykusi praeityje,
es toki svarbi veiksni kaip kolonizacija ir kt. Tam pasiekti btina
gyvenimo istorijos poymius (tokius, kaip skl iplatinimo pobd ir kt.) ir
(tokius, kaip perdavim per organoidus vyrik ir moterik gamet ar
) ne kaip fiksuot, bet kaip evoliucionuojani. Tuo bdu filogeografiniai
i gali pasitarnauti evoliucins biologijos inovatyvioms studijoms. Turt atsirasti
aai filogeografini tyrim praktinio pritaikymo. Pvz. identifikuojant rajonus ar
genetinius iteklius reikt isaugoti. Filogeografini studij teikiama
acija apie skl perneim bus svarbi vertinant rizik, susijusi su GMO auginimu.
F
vykstant klimato pokyiams. Filogeografin inventorizacija galins sertifikuoti ir sekti
sodmen, skl ar kt. judjim ir taip nustatyti rajonavimo laikymosi teisingum ar nelegalius
reprodukcins mediagos perklimus. Filogeografin inven
ir taip nustatyti nelegal mik kirtim. Bus galima
ti produktus gaunamus i tvarios mikininkysts region.
rimai tai evoliucin organizm istorija, danai vaizduojam
u. Ir yra tik viena tikra organizm filogenetin istorija.
atskleidia parinkt filogenetinio medio struktr
s metodus nustatomas organizmo ar m
cinis kelias (delecijos, insercijos, substitucijos). Mo
olekulinius duomenis nustatomi
(pvz., naudojant rRNR sekas). Fenetinis grupavimas atliekam
a
klasteriniu grupavim
Taksonomija/klasifikacija . Molekulins
evoliucijos studijos - naudojant kladistiniu olekuls,
baltymo ar geno evoliu lekulins
sistematikos studijos - naudojant m genealoginiai ryiai tarp
ri ar populiacij as
lasifikacijos procedroje naudojant vairius vieno tipo poymius (morfologinius,
i proporcingi atstumui ar
panaumui tarp grupuojam vienet ar yra proporcingi evoliucini pokyi mastui.
k
fiziologinius, ekologinius, molekulinius, citologinius) arba skirtingo pobdio poymi
derinius, kas galina padidinti klasifikacijos tikslum. Kladogramose ak ilgis nieko
nereikia ir parodomi tik genealoginiai ryiai. Filogram ak ilgia

90
Populiacij identifikacija. Populiacijos gali turti tik joms bdingus specif
ar j derinius (haplotipus) ir todl gali bti identifikuojamos molekulini ymen pagalba
svarbu reprodukcins mediagos kilms kontrols sistemoje. Miko reprodukcins media
kilms rajonui ar populiacinei priklausomybei nustatyti yra naudinga turti populiacij
molekulini ymen pirt antspaudus. Populiacijos , kuriose neaptikta neturini savit
aleli gali bti identifikuojamos pagal haplotip danius bei j kiek, jei ris toje teritorijoje
inius alelius
. Tai
gos

pasiym
i
i i haplotip vairove. Taiau pakankamam tikslumui pasiekti btinas didelis
pavyzdi (medi) kiekis kiekvienoje populiacijoje. Neturinios savit aleli populiacijos
gali bti identifikuojamos pagal aleli danius bei j kiek. Taiau didesniam tikslumu
pasiekti btinas didelis pavyzdi (medi) kiekis kiekvienoje populiacijoje.
Genotip identifikavimas (gen banko kolekcij mediagos, klon, sukaupt klon
kolekcijose ar sklinse plantacijose, klon in vitro ir kt.). Atskiri genotipai ar klonai gal
patikimai identifikuojami (t.y. atskiriami vieni nuo kit) pagal genospaudius (sin. DNR
pirt antspaudus- specifinius DNR fragment derinisu elektroforezs gelyje), sudarytu
polimorfinius ymenis (pvz. Mikrosatelitus, AFLP) pagal daugel lokus. Patikimam
nustatymui reikia bent 13 lokus (SSR). Palikuoni genotip tvus galima nustatyti
(identifikuoti) pagal tv ir motin aleli kombinacijas. Jei kandidatai tvus neinomi,
reikalingas labai didelio kiekio medi daugialokusinis tyrimas. Jei kandidatai inomi,
pakanka tirti alelius maesniame lokus skaiiuje. Atskiro genotipo populiacin
priklausomyb nustatyti sudtingiausia, nes paprastai tie patys genotipo aleliai yra randami
daugelyje populiacij. Populiacin priklausomyb galima nustatyti tik retais atvejais, ka
genotipas turi alel, kuris yra retas ir bdingas tik vienai konkreiai populiac

i bti

s pagal
i
ijai.
Genosp al
ama RFLP

masis
netin
audi metodas (genetic fingerprinting) naudojamas identifikuoti individus pag
DNR pavyzdius. Metodas sukurtas 1985 metais. Pradioje tam buvo naudoj
ymen metodas, vliau PCR paremti metodai AFLP, STR, SNP. Tikrinamo abejotino
arba neinomo klono genotipo genospaudiai lyginami su spjam genotip (pvz. pliusini
medi, klon i klon archyv arba in vitro klon banko) genospaudiais.
DNR metodais tiriami poravimosi pobdio (mating pattern) klausimai: gen
perneimo i kit medyn intensyvumas ir proporcijos; savidulkos laipsnis; krymini
tarp gimining individ, inbrydingas; neatsitiktinio poravimosi laipsnis; medyn ge
struktrizacija; efektyvusis populiacijos dydis; genetins vairovs priklausomyb nuo
derani medi skaiiaus, lyi proporcij, medi isidstymo ir kt.; tarprin
hibridizacija.


91
6. Mikrodauginimas.
6.1 vadas.
Mikrodauginimas tai vegetatyvinis (nelytinis) dauginimas in vitro (dirbtinje
aplinkoje): augn aknydinimas, organogenez ir somatin gemal genez (FAO 2004).
Pagrindinis vegetatyvinio ir mikrodauginimo privalumas greitas identik tam tikro individo
kopij gavimas. Lytinio dauginimo atveju reikia laukti lytins brandos (pvz. apie 10-20 m
eglei), be to 1/2 gen gaunama i tvinio genotipo, kas gali bti nepageidaujama. Termin
definicijos.

. p.
Morfogenez- tai lsteli diferenciacij skirtingus audinius ir struktras.
Organogenz- organ formavimosi ir vystymosi procesas: augal morfogenzje tai gli ir
akn d

iferenciacija i kaliuso, meristemos ar suspensini audini (audiniai skystoje
maitinimo terpje) lsteli. Kai lsteli diferenciacijos galutinis rezultatas yra apibrtas
organas (aknis, glis), is procesas vadinamas organogenez; kai diferenciacijos galutinis
rezultatas nra organas morfogenez (pvz. organo uuomazga ar organ kompleksas).
Audini kultra- tai augalo iauginimas i audini laboratorijoje.In vitro dauginimas-
auginimas dirbtinje aplinkoje (laboratorijoje). Meristema- aktyviai besidauginanios l
produkuojanios naujus audinius.
Pagrindiniai miko medi mikrodauginimo metodai: (1) Organogenez- augal
iauginimas i meristem (pvz. kaliuso) laboratorinse slygose (labiau tinkantis
(2) somatin (nelytin) gemal genez- gemal iauginimas i kaliuso ir dirbtin skl
sukrimas laboratorinse slygose bei prastinis medeli auginimas i skl (tinkantis
spygliuoiams, dl sunkum su organogeneze); (3) somatin hibridizacija: nelytin
genotip somatini lsteli protoplast (lstel be sienels) suliejimo metodas (4) augn
aknydinimas ar skiepijimas: jaun medeli gli karpymas, gli aknydinimas ir augn
auginimas medelyne (pigiausias metodas).
6.2. Organogenz
Organogenz- organ formavimosi ir vystymosi procesas: augal mo
stels

lapuoiams);
is skirting

rfogenezje tai
gli ir ystoje
),

lo
ikaling genetin informacij. Paveikus kaliuso meristemas specifiniais lsteli
akn diferenciacija i kaliuso, meristemos ar suspensini audini (audiniai sk
maitinimo terpje) lsteli (6.1 pav.). Audiniai i vairi augalo dali (pvz. drebuls irgini
dedamos lkt, kur esanti terp neturi augimo hormon, sakani kok audinio tip
joms vystytis . Lstelms dalinantis, susiformuoja specifins funkcijos neatliekani lsteli
mas, vadinama kaliusu (trukm apie 1 mn.). Kaliuso lstels turi vis naujo auga
iauginimui re

92
transformacij tam tikros funkcijos lsteles slygojanius augimo hormonais (organogenz)
peratros ir viesos rimu, jungiami reikalingi genai ir iauginamas naujas
augalas, mikrogli ar pumpur indukcijos ir aknydinimo bdu.
li

i
Organogenezs etapai: (a) donorinio augalo dalies (eksplanto) parinkimas (pvz.
pumpur
ir tam tikru tem



6.1 pav. Mikrodauginimo metod derinio schematinis pavaizdavimas. 3 pagrindiniai
organogenezs metodai: a) tiesiogin mikrogli indukcija i eksplanto audini ir j
aknydinimas, b) adventyvini (spontanini) pumpur indukcija, pumpur sprogimas ir g
iauginimas c) gli indukcija i kaliuso ir tolesnis aknydinimas. Somatin gemal genez
(embriogenz) (apaioje). Deinje parodytos medelio dalys, i kuri gali bti paimti audinia
mikrodauginimui.


, nesumedjusi gli audiniai), sterilizacija ir audini kultros iniciacija; (b)
adventyvin (spontanik) pumpur indukcija ir i pumpur iaugusi gli suformavimas,
arba tiesioginis mikrogli proliferavimas kaliuse (pagrinde veikiant hormonu citokininu
augim skatinanioje terpje); (c)| mikrogli aknijimas (pagrinde veikiant hormonu
auksinu augim skatinanioje terpje sunkus etapas dl ukrato rizikos), (d) augal
adaptavimas nesterilioje aplinkoje.

93
Maitinimo terps ir hormonai: (1) maitinimo terps tai kiekvienai riai specifins
augim skatinanios terps (metabolizm ir viesos energijos sisavinim skatinantys enzimai,
maisto mediagos ir angliavandeniai (energijos ir anglies altinis: pvz. gliukoz); (2)
hormonai tai audini diferenciacijos reguliatoriai. Mikrodauginime naudojamos tokios
a
em
sen

l
m ines
l
klonuoti, ioms gemal pirminms lstelms indukuojamas augimas gemalus, kurie
apvelkami dirbtiniu maisto mediag sluoksniu ir taip paveriami dirbtines sklas. Dirbtins
genezs stadija (Mik institutas, vedija) (kairje).
velkamas kiet maistmediagi luktu, kurios sudrkus
pradeda irti ir tampa prieinamas maisto rezervas gemalui (deinje).
pagrindins grups: (a) auksiniai pagrinde indikuoja pridtini akn formavimsi ir
virnini pumpur vystymsi, (b) citokininai indikuoja lsteli diferenciacij glius, (c)
giberelinai skatina skl dygim, (d) abscizin rgtis yra augimo inhibitorius ir naudojam
brion susidarymo i kaliuse stimuliacijai, (e) etilenas slopina audini augim ir skatina j
jim, (f) adeninas naudojamas mikrogli regeneracijai paspartinti.
6.3. Somatin gemal genez
Alternatyva audini kultrai organogenzs bdu yra somatin gemal genez- tai
vegetatyvinio mikro-dauginimo metodas kai gemalai iauginami i vegetatyvini ar
negametini (somatini) audini (6.2 pav.). Somatin= nelytin (augalai turi lytins ir
somatins (augimo) lstels). Somatin gemal genez = gemal gamyba i nelytini
steli. Gemal genezs sinonimas embriogenez (ang. embryogenesis)Manipuliuojant
aitinimo terpmis ir aplinkos slygomis, indukuojama audini profiliacija gemal pirm
steles, kurios gali bti ualdomos skystame azote neribotam laikui. Norint genotipus
sklos auginamos prastu bdu medelius medelynuose (pigu).


6.2 pav. P. puies somatins gemal
Dirbtini skl maketas: gemalas ap

94
Pagrind
o
ez

u:
aus p.
stini i

inis somatins gemal genezs privalumas, kad juvenyliniai donorinio genotipo
audiniai gali bti laikomi giliai ualdyti neribot laiko tarp ir bet kada gali bti paimti
somatiniam gemal klonavimui. Tolesnis naudojimas komerciniu mastu (priklauso nu
ries): dirbtins sklos (paprastoji puis, nes augnai sunkiai siaknija); klonin
mikininkyst (hedges) (p. egl, nes augnai lengvai siaknija); somatin gemal gen
naudojama Pinus sylvestris, Pseudotsuga menziessi, Pinus taeda, P. radiata, Picea glauca x
engelmanni (6.6 pav.); i gemalinio audinio gabaliuko galima veisti apie 6 ha miko
(Timmis 1998).








6.3 pav. Vien met amiaus p. puies medeliai iauginti somatins gemal genezs bd
medeliai nesiskiria nuo prastini i skl iaugint medeli (kairje). Dviej met ami
puies medeliai iauginti somatins gemal genezs bdu: medeliai nesiskiria nuo pra
skl iaugint medeli (vedijos mik institutas) (deinje).

6.4 pav. Vienas i komercinio embriogenezs panaudojimo pavydi, taikomas vienos i JAV
kompanij.

95
6.4 Somatin hibridizacija.
Somatins hibridizacijos metodas taikomas tada, kai norima sukryminti negimin
ris, suliejant j genomus. Gauto hibrido chromosom skaiius yra lygus abiej tvini
augal chromosom sumai. Pagrindiniai somatini hibrid krimo etapai: (a) gauti
protolastus (lstels gali bti gaunamos i vairi augal lap); (b) sulieti gautus protoplast
panaudojant elektros lauk arba cheminiu bdu; (c) i gaut lsteli iauginti nauj augal.
Definicija: protoplast- plant or bacterial cell that has had its cell wall removed
(
ingas


us,
org/biotech101/glossary.cfm www.ncbiotech. ). Daugumoje atvej somatiniai hibridai gali
ti v
ugal selekcines linijas. RFLP DNR genospaudiai gali bti panaudoti, norint sitikinti, ar
krai buvo gauti somatiniai hibridai.
.5 Augn aknydinimas
Augn aknydinimas tai vienas i paprasiausi ir seniausia naudojam
egetatyvinio dauginimo metod: jaun medeli gli karpymas, gli aknydinimas ir
ugn auginimas medelyne (6.5; 6.7 pav.). Donoriniai augalai (ang. hedges) auginami

aiaus. Didjant amiui, gli
aknijimo
ugnus. vedijos mik institutas 1998.
b l kryminami su tvine rimi tam, kad naujieji genai bt inkorporuoti kultivuojam
a
ti

6
v
a
medelyne iki 3 m. amiaus, t.y. pakankamas augalo pajgumas produkuoti glius karpymui.
Donorini augal gliai karpomi ir aknydinami, taip gaunant j kopijas, kurias galima veisti
mike. Karpymo intensyvumas dindinamas priklausomai nuo m
si potencija maja. Pavyzdiui, p. egls optimalus amius 3-10 m.

6.5 pav. Picea abies donoriniai genotipai (hedges), skirti vegetatyviniam dauginimui
aknydinant a

96

6.6 pav amiaus p.
egls aug oresni ir
Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology). Cambridge
University Press; 2 edition

FAO, 2004. Prelimin dification. Forest
Genetic Resources , FAO. Rome, Italy.

Gallardo, F., Fu, J., Cant E.G 1999. Expression
of a conifer gl 6.

Jain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micro restry Sciences, V.75,
Kluwer Academic Publi

Heuchelin, S.A., Jouanin, L 7. Potential of proteinase
inhibitors for enha sts. In

Klopfenstein ation, genetic engineering,
and molecula 177.
ounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In: Molecular
. 167-
. Picea abies augn aknydinimas medelyne. Viruje: tipiki dviej met
nai: nra esmini skirtum nuo sjinukai (augn stiebeliai iek tiek st
oniniai gliai ilgesni). Apaioje: augnai paimti nuo vyresni medi auga kaip akos-
linkima on.


8. Literatros sraas

Genetin modifikacija
(February 7, 2002), ISBN: 0521004713.
ary review of biotechnology in forestry, including genetic mo
Working Paper FRG/59E, Forestry Department
n, F.R., Garca-Gutirrez, A., Cnovas, F.M. & Kirby,
utamine synthetase gene in transgenic poplar. Planta, 210: 192
propagation of Woody Trees and Fruits. Fo
shers, ISBN: 1402011350.
., Klopenstein, N.B. & McNabb, H.S. 199
nced resistance to Populus arthropod and pathogen pe
, N.B., Chun, Y.W., Kim, M.S. & Ahuja, M.R., eds. Micropropag
r biology of Populus. Gen. Tech. Rep. RM-GTR-297, pp. 173

J
genetics and breeding of forest trees (Kumar, S. and Fladung, M. eds). Haworth Press Inc., p
191.


97
Lemmetyinen
breeding of fo

Lida, W., Yifan, H., Jianjun,
genetics and

Kirsi-Marja Ok 4X.
Publisher: CRC.

Kreuzer, H a
American So

Kumar, S. and Fladun
Press Inc., 42

Yanchu ):
5361.

Plomion, C., Pionnea
the developing

Mellan, R., Brunne s.
In: Molecula
58.
s for the Future, ISBN: 1891853716.
kinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering of floral
terility in forest trees. In S.M. Jain & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody plants, Vol. 1, pp.
Kluwer.
ourte, Y. 2003. GMO: Transgenesis in Plants. Science Publishers Inc. ISBN: 1578082609
z W. H (eds.) 2004. In Plant biotechnology and transgenic plants.
N 0-8247-0794-X.719 p.

oroplast DNA variation of white oak
a
ean countries.
utovskii and David B. Neale. Forest Genetic Resources Working Papers, Working Paper FGR/3
ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics and
rest trees, p. 263-291.
H. 2004. Transgenic forest trees for insect tolerance. In: Molecular
breeding of forest trees, p. 243-261.
sman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN: 08247079
nd Massey, A. 2001. Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Teachers.
ciety Microbiology; 2nd edition, ISBN: 1555811752.
g, M. (eds.). 2004. Molecular genetics and breeding of forest trees (. Haworth
9 p.
k, A.D. 2001. The role and implications of biotechnological tools in forestry. Unasylva, 204(52
u, C. & Baillres, H. 2003. Identification of tension-wood responsive proteins in
xylem of Eucalyptus. Holzforschung, 57: 353358.
r, A.M., Skinner. J., Strauss, S. 2001. Modification of flowering in transgenic tree
ra breeding of woody plants (Morohoshi and Komamine eds.) Elseverier science. 247-
2

Sliesaraviius, A ir Stanys, V. 2005. ems kio augal biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius, ISBN
9986-433-36-3.

Steven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science and
ociety. Resource S

S
s
135153. Dordrecht, Netherlands,

T
Oksman-Caldentey, K.M. and Bard
Mercel Deker Inc. USA, ISB

Genetins vairovs tyrimai

Avise J.C. 2004. Molecular markers, natural history and evolution 2nd edition, Sinauer Associates;
440 p.

Bucci, G. Vendramin G.G. 2000. Delineation of genetic zones in the European Norway spruce natural
range: preliminary evidence. Molecular Ecology 9: 923-934.

Conner J.K., Hartl D.L. 2004. A Primer of Ecological Genetics ISBN: 087893202X 304 p.

saikl U.M., Glaz I., Baliuckas V., Petit R.J., Jensen J.S. 2002 Chl C
in the Baltic countries and Poland Forest Ecology and Management 156 (1-3): 211-222.

riksson G. & Ekberg I. 2001. An introduction to forest genetics. SLU Repro, Uppsal E

Fineschi S, Taurchni, D. Villai F., Vendramin G.G. 2000. Chloroplast DNA polymorphism reveals little
eographical structure in Castanea sativa Mill. (Fagaceae) throughout southern Europ g
Molecular Ecology 9 (10): 1495-1503.

FAO 2001. Forest genomics for conserving adaptive genetic diversity. Paper prepared by Konstantin
. Kr V

98
(July 2001). Forest Resources Development Service, Forest Resources Division. FAO, Rome. FAO
website www.fao.org/fo

sources Development Service, Forest
esources Division. Rome, Italy.124 p.
999. Which DNA marker for which purpose? Final compendium of the research
roject on development optimization and validation of molecular tools for assessment of biodiversity in
euertz, M., J-F. Hausman, I. Tsvetkov, N. Frascaria-Lacoste, X. Vekemans, 2001: Assessment of
.
1615-1623.
. Vekemans, G. G. Vendramin, 2004b: Chloroplast DNA variation and postglacial
colonization of common ash (Fraxinus excelsior L.) in Europe. Molecular Ecology 13: 3437-3452.
ge University Press, 384 p.
umar S. and Fladung M.. 2004. Molecular genetics and breeding of forest trees. Food Products
alme A.E., Vendramin G.G. 2002. Chloroplast DNA variation, postglacial recolonization and
etit, R.J., Kremer, A. and Wagner, D.B. 1994. Geographic structure of chloroplast DNA
., Geburek T., Vendramin G.G. 2001. Tandem repeats in
lant mitochondrial genomes: application to the analysis of population differentiation in the conifer
ius. 663 p.
t and mitochondrial markers:characteristics and applications. Course
n Genomics and Forest Tree Stress Tollerance Chania, September 16-27, 2002. Forest Tree
Cambridge
iences, V.75,
r
umar, S. and Fladung, M. eds). Haworth Press Inc., p. 167-

FAO 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. Forest
Genetic Resources Working Paper FGR/59E. Forest Re
R

Gillet E.M. (ed.). 1
p
forest trees in the E U DGXII. IFF Univ. Gttingen.

H
genetic structure within and among Bulgarian populations of the common ash (Fraxinus excelsior L.)
Molec. Ecology 10:

Heuertz, M., S. Fineschi, M. Anzidei, R. Pastorelli, D. Salvini, L. Paule, N. Frascaria-Lacoste, O. J.
Hardy, X
re

Howell S.H.. 1998. Molecular genetics and plant development. Cambrid

Kremer, A., Petit, R.J. 1993. Gene diversity in natural populations of oak species. Ann Sci For 50,
Suppl 1: 186-202.

K
Press, ISBN: 1560229594.

P
hybridization in hazel, Corylus avellana. Molecular Ecology 11 (9): 1769-1780.

P
polymorphisms in European oaks. Theoretical and Applied Genetics 87 (1-2): 122-128

Sperisen C, Buchler U, Gugerli F, Matyas G
p
Norway spruce. Molecular Ecology 10 (1): 257-263.

Ranelis V. 2000. Genetika. Lietuvos MA leidykla. Viln

Vendramin G. 2002. Chloroplas
o
Breeding Institute, CNR, Florence, Italy


Mikrodauginimas

Desmond S. T. Nicholl. 2002. An Introduction to Genetic Engineering (Studies in Biology).
niversity Press; 2 edition (February 7, 2002), ISBN: 0521004713. U

FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. Forest
enetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy. G

ain, S.M. and Ishii, K. 2003. Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Forestry Sc J
Kluwer Academic Publishers, ISBN: 1402011350.

Jounin, L and Goujon, T. 2004. Tuning metabolism through genetic engineering in trees. In: Molecula
enetics and breeding of forest trees (K g
191.


99
Lemmetyinen ir Sopanen 2004. Modification of flowering inforest trees. In: Molecular genetics and
breeding of forest trees, p. 263-291.
94X.
teven H. Strauss, H. D. Bradshaw 2004. The Bioengineered Forest : Challenges for Science and
biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius, ISBN
986-433-36-3.

n & S.C. Minocha, eds. Molecular biology of woody plants, Vol. 1, pp.
35153. Dordrecht, Netherlands, Kluwer.

Kirsi-Marja Oksman-Caldentey.2002. Plant Biotechnology and Transgenic Plants. ISBN: 0824707
Publisher: CRC.

S
Society. Resources for the Future, ISBN: 1891853716.

Sliesaraviius, A ir Stanys, V. 2005. ems kio augal
9

Skinner, J.S., Meilan, R., Brunner, A.M. & Strauss, S.H. 2000. Options for genetic engineering of floral
sterility in forest trees. In S.M. Jai
1

100