Está en la página 1de 11

Auktos galios dvimats elektroforezs panaudojimas

proteominje analizje

praktiniai mokymai


Baltym pavyzdi elektrofotetinis frakcijonavimas poliakrilamidiniame gelyje yra vienas i
svarbiausi analitini ir, kai kuriais atvejais, preparatyvi darbo ranki tyrjui dirbaniam su
baltymais. Naudojant metod galima frakcijonuoti ir palyginti sudtingus baltym miinius,
vertinti valymo eigoje baltym varum bei tokias fizines baltym charakteristikas, kaip juos
sudarani subvienet sstat, baltym, molekulin svor, krv ir izoelektrin tak.
Plaiausiai baltym analizei yra naudojama SDS-Poliakrilamido Gelio
Elektrogorez (SDS-PAGE), kai baltym tirpinimui naudojant Na dodecilsulfat, denatruoti,
neigiamai apkrauti baltymai PAGE frakcijonuojami pagal baltym molekulin svor.
Baltymin kompleks miini analizei bei miini valymui gali bti naudojamas
IzoElektroFokusavimo (IEF) metodas, kai denatruot baltym judjimas yra slygojamas
tirpi amfolit sukuriamo pH gradiento poliakrilamidinio gelio tinkle. pH gradientas
poliakrilamido gelyje susiformuoja, kai amfolitai (maos apkrautos organins molekuls
daugyb amfoterini buferi) veikiami elektros lauko migruoja gelyje iki savo izoelektrinios
tako (pI), pastarjame sukurdami pastovi pH reikm turini srit pasiymini stipriu
buferiniu talpumu ir geru laidumu. Denatruoti baltymai itirpinti specialiuose tirpinimo
buferiuose pH gradient turiniame gelyje migruoja iki baltymo pI atitinkanio tako ir
pastarjame sustoja. iuo metu baltym frakcijonavimui naudojami standartizuoti, imobilizuot
pH gradient turintys 4% poliakrilamidiniai geliai IPG utikrinantys standartizuot
frakcijonuojam baltym pasiskirstsym izoelektrofokusavimo metu. Naudojant IEF geljyje
galima gauti iki 100 baltym frakcij. Vienoj elektroforetinje sistemoje pagal baltym
izoelektrin tak frakcijonuoti baltymai vliau gali bti skirstomi kitoje elektroforetinje
sistemoje pagal molekulin svor prapleiant baltym pasiskirstym antros krypties gelyje.



OFarrell pirmasis baltym frakcijonavimui panaudojo 2DE elektroforez, kai
pirmoje kryptyje baltym kompleksai buvo frakcijonuojami pagal j izoelektrin tak, o antroje
pagal j molekulin svor (OFarell, P.H. 1975 High resolution two-dimentional electrophoresis
of proteins. J.Biol.Chem.250, 4007-4021).
Didel na standartizuojant IEF-SDS-PAGE ne eil vairi ali mokslinink
dirbdami kartu su BioRad, Pharmacija, Amersham ir kitomis kompanijomis.


Praktinis darbas

Suspensini NB4 ir adhezini HeLa lsteli tirpios citoplazmos frakcijos - citosolio
baltym, frakcijonavimas naudojat auktos galios 2DE

Darbo tikslas:

I. Citosolio baltym, iskirt i suspensini NB4 ir adhezini HeLa lsteli
frakcijonavimas dikrypts ektroforezs metodu;
II. 2DE frakcijonuot Citosolio baltym emlapi dokumentavimas, atskir frakcij
ikirpimas ir saugojimas tolimesnei masi spektrometrinei analizei.

Darbas bus vykdomas pagal Amersham protokolus, naudosime horizontalios 2DE Multiphor II
rang:

2DE Multiphor II renginys, Pharmacia Biotech;
Immobiline juosteli fokusavimo padklas Padklas;
Anodo ir katodo elektrodai;
Skaidraus plastiko ploktel Immobiline juosteli fokusavimui;
IEF popierins elektrodo juostels;
Pavyzdio uneimo popierliai.
MultitTemp III Pratekantis Termostatas Pharmacia Biotech
Elektroforezs Srovs altinis EPS 3500 XL, Pharmacia Biotech
2
Saus geli juosteli brinkinimo lovelis Rehidratacijos lovelis, Pharmacia Biotech

Mediagas:

PlusOne Reagnts Amersham:
Iodacetamid
Urea
CHAPS
DDT
SDS
Tris-base
Bromphenol Blue
IPG buferis pH 3-10, Amersham
DryStripCover Fluid, Amersham
Tiourea, Fluka
Glicerinas, Sigma
Proteazi inhibitori kokteilis (PIK), Roche
Mol. Sv. Standartas, BioRad

Baltym Izoelektrofokusavimui naudosime Amersham kompanijos 11 cm ilgio
poliakrilamido tinkle imobilizuot pH gradient turinius (IPG) pH 3-10 juosteles-strypelius -
Immobiline DryStrip, pH3-10, 110x3 mm Immobiline juostels, rehidratuotos juostels bna
0,5 mm storio.
Antros krypties elektroforezi naudosime Amersham kompanijos gaminamus Excel 8-
18%Gel
TM
SDS, 245x110x0,5 mm gelius, ExcelGel SDS Buffers strips - GelioBuferiai. Po
elektroforezs 2DE gel daysime su Brilliant Blue G, Sigma.


1 Diena.
Baltym paruoimas izoeloktofokusavimui

I suspensini NB4 ir adhezini HeLa lsteli iskirtos Citoplazmos tirpiosios dalies - Citozolio
frakcija yra maos jonins jgos tirpale, turiniame ma nejonini detergent koncentracij ir
proteazi ihibitori.
Iskyrimo tirpalas netrukdo Citosolio frakcijoje esani tirpi baltym tiesiogiam panaudojimui
IEF, todl viena i baltym pora NB4 ir HeLa Citosolis bus panaudoti tiesioginiam baltymo
mginio ruoimui Izoelektrofokusavimui.
Antr mgini por NB4 ir HeLa Citosolis paruoime isodindami Citosolio frackijoje esani
baltym dal baltym valymo nuo drusk Rinkiniu. Itirpin isdusius baltymus Rehidratacijos
tirpalu tursime antr NB4 ir HeLa Citosolis (valyt citosolio baltym rehidratacijos tirpale)
mgin por.

Tiesioginis Citosolio tirpinimas Rehidratacijos tirpale:

100 g Citosolio baltymo atitinkam baltymo kiek pagal koncentracijos matavim itirpinti
Rehidratacijos tirpale viso iki 200 -220 l ir pilti 2l 100 x PIK.

Citosolio baltym valymas isodinant acetonu.

3
1. Ataldyti acetono tirpal iki -20
o
C.
2. laikom lede skaidr ependorfin mgintuvl, kuriame yra 120 g (pagal imatuot baltymo
koncentracij) Citosolio frakcijos pilti 4 trius ataldyto acetono tirpalo, gerai imaiyti,
ataldyti iki -20
o
C ir, kad isst baltymas laikyti -20
o
C maiausiai 2 val.
3. Susiformavusias nuosdas isodinti centrifuguojant 13000g 10 min 2
o
C.
4. Nusiurbti super.
5. Nuosdas praskalauti 1 ml -20
o
C acetono tirpalu.
6. Praskalautas nuosdas isodinti centrifuguojant 13000g 10 min 2
o
C.
7. Atsargiai nusiurbti super, pilti 220 l Rehidratacijos tirpalo bei 2l 100 x PIK, nuosdas
ipipetuoti ir, kad itirpt, 20 min laikyti kambario temperaturoje - K
o
T.
8. Nucentrifuguoti 13000g 10 min 18
o
C, kad isst neiirp nuosdos, super perpilti nauj
mgintuvl ir naudoti rehidratacijai.

Rehidratacijai paruoti baltym mginiai:

1. Tiesiogiai Rehidratacijos tirpale itirpinti Citosolio baltym Mginiai Nr1. NB4 CitP ir
Nr2. HeLa CitP
2.Valyti Citosolio baltym mginiai itirpinti rehidratacijos tirpale Nr3 NB4CitP ir
Nr4.HeLa CitP

Immobiline DryStrip Imobiline juosteli rehidratacija.

1. Visi rehidratacijai ir elektroforezei naudojami prietaisai ir renginiai turi bti vars,
praskalauti Millipore H
2
O, sausi ir paruoti naudojimui. Darbams atlikti naudoti
lateksines pirtines be pudros.
2. Atidaryti Saus geli juosteli brinkinimo lovelio (Rehidratacijos lovelio) dangt
(Pav.1).



Rehidratacijos takelis
Pav.1

Rehidratacijos lovelis Dangtis

3. 200 l rehidratacijos buferyje itirpinto baltymo (iki 100 g) pilti Rehidratacijos
lovelio takel (Pav.1).
4. Pradedant nuo Immobiline juostels rgiojo (+) galo nulupti apsaugin plvel.
Pincetu paimti juostel ir gelio puse paskeist baltymo-rehidratacijos miin, patalpinti
takelyje taip, kad baltymo tirpalas po juostel vienodai pasklist ir nesusidaryt oro
burbul (Pav. 2).

4
Pav.2

5. Rehidratacijos lovelyje yra 12 takeli, vienu metu galima sudrkinti 12 Immobiline
juosteli, jeigu mgini maiau, kiti lieka tuti.
6. Po 10 min, kad ivengti garavimo ir ureos kristalizacios rehidratacijos tirpale kiekvien
juostel uspilti 2-3 ml DryStripCover Fluid - Silikonins alyvos.
7. Udaryti rehidratacijos lovelio dangt. Immobiline juosteli rehidratacija turi vykti
kambario temperatroje maiausiai 10 val.

2 Diena

A. Pasiruoimas Fokusavimui

1. Immobiline juosteli fokusavimo padklas (Padklas), su tvirtintais elektrod
laikikliais, anodo ir katodo elektrodai, Skaidraus plastiko ploktel turinti 12 1 mm gylio
takeli geliams padti turi bti vars, praskalauti Millipore H
2
O ir sausi.
2. Nustatyti MultitTempIII Pratekaniam Termostate 20
o
C temperatr. sitikinti, ar
aldymo padas horizantalioje padtyje.
3. Upilti 3 ml Silikonins alyvos ant aldymo pado. Ant paskleistos alyvos udti Padkl
taip, kad raudonas elektrodas bt atsuktas aldymo arneles. Stengtis, kad tarp
aldymo pado ir Padklo nesusidaryt dideli oro burbul. Vienodai pasklidusi
Silokonin alyva utikrina gerai termostatuojam kontak tarp aldymo pado ir Padklo.
Sujungti raudon ir juod Padklo elektrodus su Multiphor II renginiu.
4. Padkl pilti 10 ml Silokonins alyvos ir udti Skaidraus plastiko ploktel geliams
padti takeliais vir taip, kad Silikonin alyva nepasklist Plokteks viruje.

B. IEF Elektodo juosteli paruoimas

1. Ikirpti dvejas 110 mm ilgio popierines elektrodo juosteles.
2. Padti ant varios plastikins ploktels, sudrkinti kiekvien elektrodo juostel su 500
l Millipore H
2
O. Prie vartojim vandens pertekl nusausinti filtriniu popieriumi,
elektrodai turi bti tik drgni.

C. Rehidratuot Immobiline juosteli paruoimas fokusavimui

1. Pinceto pagalba iraukti Immobiline juostel i Rehidratacijos lovelio takelio.

5
Pav.3

3. Patalpinti rehidratuot Immobiline juostel (gelio puse vir) ant Skaidraus plastiko
ploktels takelio geliams padti taip, kad Juostels rgtusis (pH 3) galas bt
virutinje Padklo dalyje arti raudono elektrodo (anodo), o arminis (pH 10) galas -
Padklo apatinje dalyje alia juodo elektrodo. Vis juosteli anod galai turi bti
vienoje linijoje (Pav.3).
4. Udti drgnas popierines elektrodo juosteles, vien ant anodinio, antrj - katodinio
Immobiline juosteli gal. Elektrod juostels kontaktas su kiekviena Immobiline
juostele neturi bti didesnis kaip 5 mm.
5. Udti elektrodus vir popierini elektrodo juosteli taip, kad raudonas anodo elektrodo
galas bt deinj pusje, o juodas katodo galas kairje (anodinio elektrodo
kontaktin pus yra raudona, katodinio juoda). Spaudiant emyn nuleisti kiekvien
elektrod taip, kad tarp elektrodo ir drgnos popierins elektrodo juostels bt
kontaktas (Pav.4).

Pav.4

Juodas Katodo ymuo Raudonas Anodo ymuo

6. Kad ivengti garavimo ir ureos kristalizacijos fokusavimo metu, upilti Silikonins
alyvos ant Immobiline juosteli, jos turi bti apsemtos.

D. Fokusavimas

1. sitikinti, kad Immobiline juosteli fokusavimo Padklas sujungtas su Multiphor II
renginiu. Udengti rengin Dangiu ir sujungti su srovs altiniu ESP 3500 XL,
pasirikti IEF program, ir pradti IEF.

IEF Programa:
1. ingsnis 300 V 2mA 5W 300 V/h
2. ingsnis 1000V 2mA 5W 1000V/h
3. ingsnis 2000V 2mA 5W 2000V/h
6
4. ingsnis 3500V 2mA 5W 70 kV/h

2. Bromfenolo dao judjimas gelio juostele link anodo rodo, kad per juostel teka srov,
taiau tai nra baltym susifokusavimo gelyje rodiklis - baltym judjimas link pI tak
daug ltesnis u bromfenolo fronto judjim. Paprastai IEF trunka 18-21val.

3 Diena

1. Pasibaigus IEF Immobiline juostel reikia paruoti antros krypties SDS-PAGE arba
patalpinami gerai udaromus mgintuvlius ir saugti -70
o
C vlesnei 2DE analizei.

Immobiline juosteli kalibravimas paruoimas SDS-PAGE:

A. Kalibravimo tirpal ruoimas (Kalibravimo tirpalai ruoiami prie pat darb)

1. 2 mgintuvlius pasverti po 93 mg DTT kiekvien pilti po 10 ml kalibravimo tirpalo
ir itirpinti kambario temperatroje - K
o
T.
2. 2 ml mgintuvlius pasverti po 450 mg Iodacetamido- JAA, pilti kiekvien po 10 ml
kalibravimo tirpalo, berti kelet Bromfenolo mlio kristalli ir tirpinti K
o
T.
Baltym redukcija kalibravimo tirpale:
3. dti Immobiline juostel mgintuvl su kalibravimo tirpalu turiniu 60 mM DTT.
Ukimti mgintuvl ir supuoti Immobiline juostel 15 min K
o
T.
Baltym SH grupi alkilinimas kalibravimo tirpale apsauga nuo reoksidacijos
4. Perdti Immobiline juostel mgintuvl su kalibravimo tirpalu turiniu 200 mM JAA.
Ukimti mgintuvl ir supuoti Immobiline juostel 15 min K
o
T.

B. Kol tirpsta DTT, JAA, ir vyksta baltym redukukcija bei alkilinimas Immobiline
juostelse paruoti Multiphor II rengin antros krypties elektroforezei:

1. Nustatyti MultitTempIII Pratekaniam Termostate 15
o
C. Upilti 3 ml Silikonins alyvos
ant aldymo pado.
2. Iimti Amersham Excel 8-18%Gel
TM
SDS, 245x110 mm - gel i pakuots. Gelis yra
upolimerintas ant plastikinio pagrindo (plastiko pakraiai 0,5cm yra be gelio),
kairijame apatiniame plastikinio pagrindo kampe nukirptas kampelis, virutinje dalyje
yra koncentruojantis gelis, toliau prasideda 8-18% poliakrilamido gelio gradientas. Gelio
pavirius yra padengtas nuimama plvele. Padti gel plastikine puse ant aldymo pado
lygiagreiai pade nubrtoms linijoms, 18% gelio kampelis turi buti apaioje, kairje
pusje. sitikinti, kad tarp gelio ir aldymo pado yra geras kontaktas - nra dideli oro
burbul. 5 min prie elektroforez nuimti plvel nuo gelio paviriaus.
3. Virutinje gelio dalyje udti katodin gelio bufer, apatinje gelsvos spalvos anodin
gelio bufer lygegreiai kratams (Pav.5). Buferiams udti naudoti vinilines pirtines.
Prie iimant bufer i pakuots pirtines sudrkinti Millipore H
2
O. Buferi pozicij
galima reguliuoti sudrkintu Millipore H
2
O pateliu.

7
Pav.5
Anodinis buferis

4. Po kalibravimo tirpale su 200 mM JAA Immobiline juostel pincetu itraukti i
mgintuvlio ir, kad paalinti tirpalo pertekli, juostels krateliu padti ant Millipore
H
2
O sudrkinto filtrinio porieriaus.
5. Po 1-3 min juostel gelio puse apai su pincetu padti ant Excel 8-18%Gel
TM
SDS
alia katodinio buferio (Pav.6). sitikinti, kad tarp Immobiline juostels ir Excel 8-
18%Gel
TM
SDS gelio nra oro burbuliuk, jeigu j yra, paalinti pincetu. Ant vieno
Excel 8-18%Gel
TM
SDS udsime dvejas 11 cm ilgio Immobinie juosteles.

Pav.6 Pav.7
AnodoBuferio IEF Pavyzdio
juosa uneino popierlis

6. Gelio juostels kratuose po plastiku pincetu patalpinti IEF Pavyzdio uneimo
popierlius, kurie adsorbuos itekant i gelio juostels elektroforezs metu H
2
O (Pav.7).
Per vidur padti dar vien Pavyzdio uneimo popierl.
7. 3 l mol. sv. markerio (BioRad) uneti ant viduryje padto Pavyzdio uneimo
popierlio.
8. Elektrod laikikli dangt Multiphore II renginyje udti taip, kad elektrodai eit
centrine buferi dalimi (Pav.8)

8
Pav.8

Elektrod laikikli dangtis Katodo elektrodo laikiklis

9. Multiphore II rengin udengti dangiu ir sujungti su srovs altiniu ESP 3500 XL.

SDS Elektroforezs vykdymo slygos:

1. ingsnis 600 V 25 mA 30 W 25 min
Paalinti IEF juostel
2. ingsnis 600 V 50 mA 30 W 5 min
Katodin bufer pertraukti Immobiline juostels viet
3.ingsnis 600 V 50 mA 30W 1val 10 min
4. Ijungti srov 5 min po to, kai bromfenolo frontas pasieks anodo bufer.

Po elektroforezs gel dayti Brilliant Blue G-Colloidal (Sigma). Ikirpti kelet gelyje
nudayt baltym, saugoti mgintuvliose 4
o
C. Sekani praktik metu juos panaudosime
baltym peptid masi spektrometrinei analizei




9
IEF gelio juosteli rehidratacijos tirpalai

8M Urea 1,2 g
2% CHAPS 50 mg
0.5% IPG buffer 12.5 l
40mM DTT 15.4 mg
0,002%Bromfenolo mlis 5 l i1%tirpalo
Millipore H
2
O iki 2,5 ml

7M Urea 1,05 g
2M Tiourea 381 mg
4%CHAPS 100 mg
0,5% IPG buffer 12,5 l
40 mM DTT 15,4 mg
0,002%Bromfenolo mlis 5 l i1%tirpalo
Millipore H
2
O iki 2,5 ml
Tirpalai laikomi -20
o
C

Kalibravimo tirpalas:

20 mM Tris-HCl, 20 ml i 1M Tris, pH6,8
6 M urea 144 g
Glicerol 120 ml i 100%
2% SDS 8 g
H
2
O 140 ml iki 400 ml

Baltym daymo Brilliant Blue G-Colloidal dau (Sigma) tirpalai

Fiksavimo tirpalas:

7% CH
3
COOH 35ml i 100%
40% MetOH 200 ml i 100%
H
2
O iki 500 ml

Daymo tirpalas:

Prie daym supilti;
Brilliant Blue G-Colloidal koncentrato 20 ml
H
2
O 80 ml, miin pilti
MetOH 25 ml
30 sek gerai imaiyti ir naudoti daymui.

Skalavimo tirpalas:

10% CH
3
COOH 50 ml i 100%
25% MetOH 125 ml i 100%
H
2
O iki 500 ml



10
11
Blukinimo tirpalas:

25% MetOH 125 ml i 100%
H
2
O iki 500 ml

Daymo eiga:

1. Po elektroforezs gel 1 val fiksuoti Fiksavimo tirpale.
2. Ipilti Fiksavimo tirpal.
3. Dayti Brilliant Blue G-Colloidal-MetOH 1-2 val.
4. Nupilti da.
5. 60 sek. skalauti su Skalavimo tirpalu.
6. Iki 24 val. blukinti su Blukinimo tirpalu.