Pruebas Bioqumicas

Determinan la actividad metablica de una cepa pura. Son

empleadas principalmente la identificacin y clasificacin
de bacterias y hongos.
Pruebas Bioqumicas
Se pueden resumir en los siguientes puntos:
Sustrato (contenido en el medio de cultivo)
Enzima o va metablica (secretada o en el interior del
microorganismo)
Producto
Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)
E + S ES E + P E + S
E + S

ES
ES

E + P
E + P
Los fundamentos completos de estas pruebas y dems informacin pueden
encontrarlos en el libro: Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias
de importancia clnica de Jean F. MacFaddin, Editorial Mdica Panamericana.
Hidrlisis del Almidn
Agar Almidn
Sustrato: Almidn (polmero de glucosa).
Enzima: Amilasa (exoenzima).
Producto: Glucosa.
Revelador: Lugol.
El lugol con el almidn forman un complejo color caf-prpura
que desaparece cuando el almidn ha sido degradado.
El almidn es producido
principalmente por
plantas superiores, est
compuesto de amilosa y
amilopectina. Diversas
enzimas amilolticas
hidrolizan almidn y sus
productos.
Prueba negativa Prueba positiva
Degradacin de la casena
Prueba negativa Prueba positiva
Agar Leche Descremada
Sustrato: Casena (protena).
Enzima: Caseinasa (Proteasa,
exoenzima).
Producto: Aminocidos.
Revelador: No requiere.
Las proteasas son excretadas al medio para la degradacin de
protenas, la casena es la protena de la leche que le confiere el
color blanco, cuando la casena es hidrolizada desaparece el
color blanco alrededor del crecimiento microbiano.
Hidrlisis de la lecitina y
reduccin del telurito
Algunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la
lecitina (fosfolpido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias
productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor.
El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y
cuantificacin de estafilococos cuagulasa positivos, al que se
adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias
tpicas de S. aureus son oscuras por la reduccin del telurito,
adems presentan el halo de hidrlisis de la lecitina.
Agar yema de huevo/Agar Baird Parker
Sustrato: Lecitina.
Enzima: Lecitinasa.
Producto: Fosforilcolina.
Revelador: No requiere.
Licuefaccin de la gelatina
Gelatina Nutritiva
Sustrato: Gelatina (protena).
Enzima: Gelatinasa (Proteasa,
exoenzima).
Producto: Aminocidos.
Revelador: No requiere o puede
emplearse el carbn activado en
polvo.
La gelatina es una protena que tiene la capacidad de gelificar,
cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminocidos que la
componen pierde su caracterstica de gelificar. Se pueden
emplear varios medios que permiten la visualizacin
macroscpica como la gelatina adherida a carbn activado.
Prueba negativa Prueba positiva
Fermentacin de carbohidratos
Medio base rojo de fenol ms
carbohidrato o polialcohol, con
campana de fermentacin (Durham).
Sustrato: Carbohidrato o polialcohol.
Va: Fermentativa.
Producto: cidos orgnicos.
Indicador: Cualquier indicador de pH.
Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes)
deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados
en monmeros y transportados a la clula para posteriormente
en condiciones anaerobias ser metabolizados por la va
fermentativa. La fermentacin (degradacin) de un compuesto
orgnico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la
formacin de gas capturado en la campana de fermentacin.
Negativo/Positivo(A)/Positivo(AG)
Oxidacin/Fermentacin
Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos
metablicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la
necesidad de oxgeno atmosfrico y una fosforilacin inicial. Por
prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con
aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxgeno.
La fermentacin requiere de una fosforilacin inicial, utiliza las vas
de la Gluclisis (Embden-Meyerhof-Parnas EMP), de las Pentosas
fosfato y Entner-Doudoroff.
Hugh and Leifson
Sustrato: Carbohidratos.
Vas: Fermentativa y/u Oxidativa.
Producto: Acido pirvico.
Indicador: Azul de bromotimol u
otro indicador cido/base.
Oxidacin/Fermentacin
La oxidacin de la glucosa
produce cido pirvico por una
va de derivacin (Shunt), ocurre
en condiciones aerobias y no
requiere de fosforilacin inicial.
Amarillo Amarillo Ambos Fermentacin y
oxidacin
Verde Azul o verde Ninguno Ni fermentacin,
ni oxidacin
Amarillo Verde Sellado Fermentacin
Verde (-) Amarillo (+) Abierto Oxidacin
Tubo sellado Tubo abierto Tubo con reaccin positiva Reaccin
La produccin de cido se observa por el vire del indicador al
amarillo. En los tubos positivos puede haber generacin de gas.
Rojo de Metilo/Voges Proskauer
Caldo RM/VP
Sustrato: Glucosa.
Vas: Fermentacin cida o neutra.
Producto: Acido orgnicos o acetona.
Reveladores: Solucin de Rojo de Metilo,
Alfa Naftol y KOH 40%.
Fermentacin cido mixta: Los productos finales son cidos
orgnicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del
medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo
(pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4
molculas de piruvato formadas, reducen dos a cido lctico y dos
las metabolizan para formar cido actico y frmico; parte del
acetato pasa a etanol y parte del frmico a CO
2
y H
2
en
cantidades iguales.
Rojo de Metilo/Voges Proskauer
Fermentacin butilengliclica: en sta,
parte del piruvato se metaboliza
produciendo cantidades menores de
cido lctico, frmico y actico, la
mayor parte del piruvato se condensa
formando acetilmetilcarbinol, que es
reducido a 2,3-butilenglicol, productos
que son neutros.
Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba
de Voges-Proskauer): Se agrega un poco de -naftol al 5% en
etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le aade
(KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita
fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violceo en la parte
superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloracin).
Utilizacin de citrato
Prueba negativa Prueba positiva
Medio de Citrato de Simmons
Sustrato: Citrato de sodio.
Va: Varias dependientes del pH del
medio.
Producto: Acetato/formato en
condiciones alcalinas y Acetato,
CO
2
, lactato/Acetona y CO
2
en
condiciones cidas.
Indicador: Azul de bromotimol.
Un microorganismo que puede utilizar el citrato como nica
fuente de carbono tambin utiliza las sales de amonio del
medio como nica fuente de nitrgeno. La extraccin de
nitrgeno de las sales de amonio producen amoniaco y se
alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
Agar hierro de Kligler
Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y
Tiosulfato o grupos SH de la cistena.
Va: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato
reductasa y cistena desulfurilasa-
Productos: cidos mixtos y H
2
S.
Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe
2+
.
En presencia de tiosulfato en el medio o la degradacin de
protenas liberando aminocidos azufrados, algunos
microorganismos forman H
2
S gaseoso por medio de las enzimas
tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa. El gas incoloro H
2
S se
forma en condiciones cidas y reacciona con el citrato de
amonio frrico para producir un precipitado negro insoluble de
sulfuro ferroso metlico.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
No fermentadores
Pico de flauta
alcalino y fondo
alcalino
No fermentadores de lactosa
Pptidos
Aminas
O
2
Glucosa
cidos Mixtos
Reaccin inicial:
Pico de flauta
cido y fondo
cido
Reaccin final:
Pico de flauta
alcalino y
fondo cido
Pptidos
Aminas
O
2
Glucosa
cidos Mixtos
Fermentadores de lactosa
Pptidos
Aminas
O
2
Glucosa +
Lactosa
cidos Mixtos
Pico de flauta
cido y fondo
cido
Pptidos
Aminas
O
2
No fermenta
pH = 7.4
Las bacterias incapaces de
fermentar utilizan las peptonas y
liberan aminas que alcalinizan todo el
medio.
Las bacterias que solo fermentan la
glucosa, inicialmente tambin utilizan
aerbicamente la glucosa. Debido a
la baja concentracin de glucosa
(0.1%), metabolizan las peptonas
alcalinizando la superficie del medio.
Las bacterias fermentadoras de
glucosa y lactosa, fermentan la
glucosa 0.1% y al trmino de esta,
fermentan la lactosa 1%, permitiendo
la acidificacin completa del medio.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
-
-
-
-
C
-
-
-
-
1
-
-
-
+
2
+
-
+
+
3
-
+
+
+
4
-
+
+
+
4A
+ Produccin de H
2
S
+ Fermentacin de Lactosa
+ Produccin de gas de la
fermentacin
+ Fermentacin de Glucosa
5 Tubo
El medio de Kligler est
diseado para la
identificacin de
enterobacterias y otras
bacterias Gramnegativas.
Interpretacin:
Medio SIM
(Sulfhdrico Indol Movilidad)
Medio SIM (medio semislido)
Sustratos: Tiosulfato o grupos SH de la cistena y triptfano.
Enzimas: Tiosulfato reductasa, cistena desulfurilasa y tiptofanasa.
Producto: H
2
S e Indol.
Revelador: Sales de Fe
2+
y p-Dimetilaminobenzaldehdo (DMABA).
Prueba positiva Prueba negativa
En presencia de tiosulfato en el medio o la
degradacin de protenas liberando
aminocidos azufrados, algunos microorganismos
forman H
2
S gaseoso por medio de las enzimas
tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa. El gas
incoloro H
2
S reacciona con el citrato de amonio
frrico para producir un precipitado negro
insoluble de sulfuro ferroso metlico.
Medio SIM
(Sulfhdrico Indol Movilidad)
El medio de cultivo tiene consistencia semislida
por lo que la movilidad se observa por el
crecimiento del microorganismo en todo el tubo,
ms all de la zona de inoculacin (picadura).
Los microorganismos inmviles solo crecern en
la zona inoculada.
Prueba positiva Prueba negativa
Prueba negativa Prueba positiva
Las enzimas triptofanasas oxidan el triptfano
para formar tres metabolitos: indol, metil indol y
cido indolactico. Los reactivos de Erhlich o
Kovacs contienen DMABA que reacciona con el
indol producido formado un compuesto
quinnico color violeta, que se observa por la
aparicin de un anillo en la superficie del medio.
Ureasa
Caldo urea o agar urea de
Cristensen.
Sustrato: Urea.
Enzima: Ureasa.
Producto: Amonaco.
Indicador: Rojo de fenol.
La hidrlisis de la urea por la enzima
ureasa libera dos molculas de
amoniaco que alcaliniza el medio,
entonces se vira el indicador de pH,
en el caso del rojo de fenol una
prueba positiva es color bugambilia.
Prueba negativa Prueba positiva
Reduccin de Nitratos
Caldo nitratos
Sustrato: Nitrato de sodio.
Enzima: Nitrato reductasa.
Producto: Nitritos.
Revelador: Reactivos de Griess.
N0
3
-
NO
2
-
NO N
2
O N
2
Nitrato reductasa (NAR).
Nitrito reductasa (NIR).
NO reductasa (NOR).
N
2
O reductasa (N
2
OR).
Reduccin de Nitratos
El nitrito reacciona
con dos reactivos:
cido sulfanlico y
dimetil-a-naftilamina
(o a-naftilamina). La
reaccin de color
se debe a la
formacin de un
compuesto
diazonio, p-
sulfobenceno-azo-
-naftilamina.
NH
2
SO
3
H
Acido sulfanlico
(incoloro)
+ HNO
2
Acido nitroso
Acido sulfanlico diazotizado
(sal de diazonio)
N
SO
3
H
N
+ H
2
O +
NH
2
-naftilamina
(incolora)
p-sulfobenceno-azo--naftilamina
(colorante rojo azo hidrosoluble)
NH
2
+ H
2
O
N
SO
3
H
N
Acoplamiento
Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba
del zinc para reducir qumicamente los nitratos presentes a nitritos
y formar con los reactivos de Griess el compuesto colorido.
Descarboxilasas
Los aminacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en
diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador
(prpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas
son tiles en la diferenciacin de enterobacterias.
Medio base de descarboxilasas u otros
medios como LIA o MIO.
Sustrato: Aminocidos (lisina, ornitina o
arginina).
Enzimas: Descarboxilasas.
Producto: Amonaco.
Indicador: Prpura de bromocresol.
Prueba de la coagulasa
Plasma de conejo
Sustrato: Factores de la coagulacin.
Enzima: Coagulasa
(estafilocoagulasa).
Producto: Coagulo.
Revelador: No requiere.
La enzima producida por S. aureus es excretada al medio
extracelular, el mecanismo propuesto es la accin de esta
enzima sobre los factores de la coagulacin presentes en el
plasma y formar un coagulo visible.
Prueba positiva Prueba negativa
Oxidasa
Se basa en la produccin bacteriana de una enzima oxidasa
intracelular. Esta reaccin se debe a un sistema de citocromo
oxidasa que activa la oxidacin del citocromo reducido por el
oxgeno molecular, el que a su vez acta como un aceptor de
electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de
electrones. La prueba positiva se observa por la oxidacin del
reactivo incoloro en pocos segundos formndose un producto
colorido.
Cultivo de medio nutritivo
Sustrato: Compuesto reducido.
Enzima: Oxidasa.
Producto: Compuesto oxidado.
Revelador: Reactivo de Kovacs,
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
(TPD) al 1%, solucin incolora.