Act i vi dad enzi mt i ca de l a ami l asa

Agust n Gar r i do
agugar r i do@hot mai l . com
I nt r oducci n :
La - ami l asa es una enzi ma pr ot ei ca que se encuent r a en l a sal i va
humana y cat al i za l a degr adaci n del al mi dn que es un pol i sac!r i do de
r eser va veget al . "l al mi dn est ! # ormado por dos t i pos de mol $cul as: l a
ami l osa y l a ami l opect i na am%os pol i sac!r i dos de gl ucosa. La ami l osa se
con# orma por cadenas l i neal es de gl ucosas uni das por enl aces - &'- &(
mi ent r as que l a ami l opect i na t i ene adem!s de est os )l t i mos enl aces
uni ones &' con &* # ormando cadenas r ami # i cadas. La - ami l asa r ompe
uni ones &'- &( t ant o en l a ami l asa como en l a ami l opect i na de+ ando
de,t r i nas l i neal es y r ami # i cadas - ol i gosac!r i dos. como product os.
/ar a medi r l a act i vi dad enzi m!t i ca de l a - ami l asa se ut i l i zar ! un t est
col or i m$t r i co que det ect a el al mi dn. /ar a el l o se cont ar ! con una sol uci n
de i odo0 i odur o de pot asi o - I 1 0 I 2. ya que el al mi dn en pr esenci a de est a
sol uci n adqui er e una col or aci n azul ada car act er st i ca. "st o t i ene una
e,pl i caci n # si ca: el i odo se col oca en el i nt er i or de l a h$l i ce que # or ma l a
ami l osa - en l as r egi ones hi dr o# %i cas. # ormando un compl e+ o de col or azul .
&uando l a - ami l asa act )a degr ada l a ami l osa se desi nt egr a l a h$l i ce y por
t ant o en presenci a de I
1
0 I 2 ya no dar ! una col or aci n azul .
/or l o t ant o en est e 3/ medi r emos l a desapar i ci n de sust r at o
- evi denci ada por el t est col or i m$t r i co. para det er mi nar l a act i vi dad de l a
enzi ma. Adem!s anal i zar emos cmo a# ect an l as di st i nt as condi ci ones en
que act )a l a enzi ma - p4 t emper at ur a concent r aci n de 5a&l . as como l os
e# ect os que pueden causar di # erent es pr et r at ami ent os - pr ot ei nasa cal or . .
La di l uci n pt i ma nos i ndi car ! cu!nt o de%emos di l ui r l a sal i va para
que se l ogr e el e# ect o acr om!t i co dent ro del r ango propuest o - 1- 6 mi nut os. .
7et odol og a :
8e par t i de una muest r a de sal i va de un i nt egr ant e del gr upo y se l a
r ecogi en un vaso de preci pi t ado que se col oc en un r eci pi ent e con hi el o
par a r educi r l a ener g a ci n$t i ca - par a di smi nui r el cont act o de l as mol $cul as
r educi endo l as i nt er acci ones qu mi cas que se pudi er an pr oduci r . de
compuest os pr esent es en l a sal i va que puedan a# ect ar el # unci onami ent o de
l a pr ot e na.
A par t i r de l a muest ra se t om una al cuot a para i mpr egnar un papel
i ndi cador de p4 so%r e un papel %l anco. "l p4 o%t eni do # ue ent re 9- 6. :esde
aqu el t r a%a+ o se di vi di en dos part es: una para det er mi nar l a di l uci n
pt i ma y el t i empo de r e# erenci a y l a ot r a modi # i cando una de l as
condi ci ones e,per i ment al es.
Par t e 1:
8e t om ' ml de sal i va de l a muest ra del vaso de pr eci pi t ados y se l o
di l uy con ; ml de agua dest i l ada en un t u%o de ensayo o%t eni endo una
di l uci n '0 '<. Luego se mezcl por i nver si n evi t ando que l a sol uci n
adqui er a ener g a ci n$t i ca y se produzca l a desnat ur al i zaci n de l a enzi ma de
nuest r o i nt er $s= y se l o col oc en hi el o por l a mi sma r azn ant es e,puest a.
8e prepar una gr adi l l a con '> t u%os cont eni endo cada uno una
sol uci n - de col or aci n amar i l l a. de > ml de agua de l a cani l l a y una got a de
I 1 0 I 2 < <'7 que se mezcl por agi t aci n par a o%t ener una sol uci n
homog$nea. Luego se nos ent r eg una sol uci n de al mi dn '? p0 v a %a@o
t $r mi co a A9B & - par a que con# or me una sol uci n homog$nea. . 8e e,t r a+ er on
* got as con pi pet a /ast eur de l a sol uci n de al mi dn y se l a vol c en un
t u%o < de l a gr adi l l a mezcl !ndol o por i nver si n y o%t eni endo un col or azul
car act er st i co del compl e+ o I odo- al mi dn.
/ront ament e se col oc en el t u%o con al mi dn ' ml de l a di l uci n '0 '<
de l a sal i va - que cont i ene a CD ami l asa. y en ese i nst ant e se comenz a
cr onomet rar . A l os A< segundos se ret i r ar on * got as de est a sol uci n a A9B
& donde de% a ocur r i r l a reacci n y se l as agr eg al t u%o ' de l a gr adi l l a.
"st e pr ocedi mi ent o se de%er a ha%er r epet i do cada A< segundos par a l os
si gui ent es t u%os hast a que l a muest ra adqui r i er a un col or parduzco si n
em%ar go ya en el t u%o ' al mezcl ar l o por i nver si n con un t apn de goma
se o%t uvo una col or aci n par da. &omo el e# ect o acr om!t i co e,pl i cado en l a
i nt r oducci n se ha% a dado ant es de l os 1 mi nut os er a evi dent e que l a
di l uci n '0 '< no era l a pt i ma. /or eso se deci di una nueva di l uci n '0 ><.
/ar a o%t ener est a di l uci n se t om ' ml de l a '0 '< de sal i va y se l a col oc
en un t u%o de ensayos con ( ml de agua dest i l ada mezcl !ndol o por
i nver si n. 8e r epi t i el pr ocedi mi ent o ant er i or de l a medi ci n de l a r eacci n
enzi m!t i ca y de est a maner a se det er mi n el t i empo de re# er enci a par a l a
di l uci n '0 >< que ser ! l a di l uci n pt i ma.
Par t e 2:
A cada gr upo se l e asi gn un t rat ami ent o di st i nt o para anal i zar l a
act i vi dad de l a enzi ma al t er ando l as condi ci ones ant er i or es - modi # i cando una
sol a var i a%l e. .
5uest r o gr upo r eci %i una sol uci n 5a&l < ' 7 para anal i zar l os e# ect os de
l a pr esenci a de 5a&l so%r e l a CD ami l asa.
/ar a r eal i zar est ar par t e se t ra%a+ con una di l uci n de sal i va al
do%l e de l a di l uci n pt i ma - es deci r '0 '<< de sal i va. .
8e pi pet ear on < > ml de l a di l uci n '0 >< de sal i va par a mezcl ar l os por
i nver si n con < > ml de 5a&l .
8e r epi t i el procedi mi ent o r eal i zado en l a par t e ' y se encont r el
t i empo en el que se l ogr el e# ect o acr om!t i co par a l a sal i va di l ui da con
5a&l . 5o o%st ant e est e t i empo no se puede compar ar con l a di l uci n '0 ><
de l a sal i va puest o que se t r at a de di l uci ones de sal i va di st i nt as. /or l o
t ant o se el a%or una medi ci n cont r ol - con el mi smo pr ocedi mi ent o ant er i or
per o par t i endo de una di l uci n '0 '<< de sal i va en agua dest i l ada si n 5a&l . .
/ar a l a medi ci n cont r ol se r eal i zar on '9 t u%os.
Eesul t ados:
Par t e 1
- p4 sal i val : ent r e 9 y 6
- 3i empo de r e# erenci a: desapar eci el col or azul a l os >F A<F F de agr egar l a
enzi ma a l a di l uci n de '0 >< y se o%t uvo un col or par do. &omo est e t i empo
de r e# er enci a se o%t uvo en el r ango pr opuest o por el 3/ de ent r e 1 y 6
mi nut os podemos a# i r mar que l a di l uci n '0 >< es l a pt i ma.
Par t e 2
:i l uci n '0 '<< 5a&l con sal i va: se o%ser v una desapar i ci n del col or
azul en el t u%o 'A a l os *F A<F F de agr egar l a sol uci n al t u%o de al mi dn a
A9B &. "n el t u%o cont r ol l uego de '9 t u%os - pasados 6F A<F F . no se
apr eci ar on cam%i os - el col or azul no desapar eci . es deci r no hu%o e# ect o
acr om!t i co.
"st o qui er e deci r que en presenci a de 5a&l l a act i vi dad enzi m!t i ca de
l a CD ami l asa aument a ya que necesi t a un t i empo menor al del cont r ol par a
l ogr ar el e# ect o acr om!t i co. 8e podr a suponer que 5a
G
o &l
H
o am%os
pueden a# ect ar l a acci n enzi m!t i ca de CD ami l asa.
:i scusi n:
/ar a empezar se ha de acl ar ar que l as di l uci ones pt i mas par a
sal i vas de di # erent es per sonas son di st i nt as por que l as car act er st i cas y
concent r aci ones de l os compuest os var an de una per sona a ot r a. "st o
mi smo ocur r e con el p4 sal i val y el t i empo de r e# erenci a.
"l r ango de 1 a 6 mi nut os par a el e# ect o acr om!t i co el egi do se de%e a
que l os t i empos sean mane+ a%l es en el t r a%a+ o pr !ct i co. 8i se %uscase un
t i empo de re# er enci a muy peque@o l os cam%i os no hu%i esen si do
apr eci ados.
/or l os e,per i ment os que r eal i zamos en el 3/ no se puede conocer l a
# orma en que el 5a&l aument a l a act i vi dad de l a enzi ma si n em%ar go una
vez # i nal i zado el 3/ nos i n# or mar on que r eci ent es descu%r i mi ent os di er on a
conocer que l a - ami l asa cont i ene en l os r est os ami noac di cos de su si t i o
act i vo &l
- -

y por el l o al agr egar 5a&l l os ani ones cl or ur o se unen al si t i o
act i vo aument ando l a act i vi dad enzi m!t i ca. "s deci r el cl or o act )a como
co# act or de l a enzi ma.
La pr ot ei nasa K es una pr ot easa es deci r t i ene una act i vi dad
espec # i ca l a cual consi st e en degr adar prot e nas. La mi sma act )a r ompi endo
l os enl aces d$%i l es del pol i p$pt i do hast a que adqui er a su est r uct ur a
pr i mar i a y por l o t ant o pi er da su # unci onal i dad.
La prot ei nasa 2 - '<< Il di suel t a en una sol uci n acuosa con %u# # er .
se i ncu%a con l a di l uci n de sal i va - ' ml . dur ant e 'h. a >< gr ados &el si us
- t odo est e pr oceso es el pre- t rat ami ent o de l a di l uci n. . Luego de est e l apso
de t i empo se agr ega l a sal i va t r at ada con prot ei nasa a l os '< ml de al mi dn
y se r epi t e el pr ocedi mi ent o par a l a det er mi naci n de l a act i vi dad enzi m!t i ca
r eal i zado en l a /ar t e '.
Al ser l a CD ami l asa una pr ot e na uno esper ar a que l a pr ot ei nasa l e
haga per der su # unci onal i dad. 8i n em%ar go est o no ocur r i puest o que
l uego de un det er mi nado per odo de t i empo se o%ser v el e# ect o acr om!t i co
es deci r l a CD ami l asa est a%a act uando. "st o se puede e,pl i car de di ver sas
maner as. /or e+ empl o nunca aver i guamos l a concent r aci n de l a enzi ma en
l a sal i va por l o t ant o t al vez era muy super i or a l a de l a pr ot ei nasa y por
eso no l l eg a cumpl i r se # unci n. :e l a mi sma maner a hay que t ener en
cuent a el per odo de i ncu%aci n. 3al vez no # ue su# i ci ent e para que l a
prot ei nasa J degr ade a l a CD ami l asa.
/or )l t i mo ca%e acl ar ar que se e# ect u un cont rol o de r eacci n para
no concl ui r er r neament e. 8e col oc en un t u%o una di l uci n de sal i va per o
son sl o el %u# # er par a asegur ar nos que no haya agent es e,t er nos que
a# ect en l os r esul t ados.
"n el pr e- t r at ami ent o de l a enzi ma a una t emper at ur a de 100 C
durant e '< mi nut os se t r at pr evi ament e a l a di l uci n opt i ma de sal i va '0 ><
dur ant e 9 mi nut os en un %a@o de agua a '<<K & pero al medi r l a act i vi dad
enzi m!t i ca con el mi smo procedi mi ent o descr i t o en l a par t e ' no se
o%ser v ni ng)n cam%i o del col or azul - por l o que se puede deci r que no se
produ+ o el e# ect o acr om!t i co. dur ant e 9 mi nut os - que es el t i empo de
r e# er enci a o%t eni do por el gr upo 1 con p4 sal i val ent r e 9 y 6.. A par t i r de l os
r esul t ados o%t eni dos se podr a deduci r que l a al # a- ami l asa se desnat ur al i za
al ser e,puest a a una t emper at ur a t an el evada ya que se pr oduce un e,ceso
de choques ent r e l as mol $cul as pr esent es en l a sal i va como consecuenci a
del aument o de l a ener g a ci n$t i ca produci endo l a r upt ur a de l as uni ones
d$%i l es - como puent es de hi dr ogeno # uer zas de van der Laal s i nt er acci ones
i ni cas. que a# ect a l a est r uct ura t er ci ar i a de l a enzi ma y a su vez l a
con# ormaci n de su si t i o act i vo per di endo l a capaci dad de r omper l as
uni ones &'- &( de l as gl ucosas. M es por est o que el col or azul no
desapar ece en l os t u%os de ensayo.
&on r espect o a l a i nf l uenci a del pH del medi o en l a act i vi dad
enzi mt i ca de l a - ami l asa podemos deci r que a p4 e,t r emos - es deci r muy
!ci dos o muy %!si cos. l a enzi ma no # unci ona o al menos di smi nuye
not a%l ement e su act i vi dad. "st o podemos concl ui r a par t i r de l os
e,per i ment os r eal i zados por ot r os gr upos que mant eni endo el r est o de l as
condi ci ones i ni ci al es mi di er on l a act i vi dad de l a - ami l asa en dos medi os
con p4 e,t r emos.
"l gr upo ( ha% a encont r ado un t i empo de r e# er enci a de * mi nut os - apar i ci n
del e# ect o acrom!t i co. para su di l uci n pt i ma y un p4 sal i val de ent r e * y 9.
8i n em%ar go a un p4 1 - m!s !ci do. no encont r cam%i os - es deci r no hu%o
e# ect o acr om!t i co. en '< mi nut os de r eacci n. Al go par eci do ocur r i con el
gr upo '1 que ha% a encont r ado un t i empo de r e# er enci a de 'F A<F F para un
p4 sal i val de ent r e 9 y 6 y cuando r epi t i el e,per i ment o en un medi o con
p4 '1 - m!s %!si co. no hu%o e# ect o acr om!t i co en ( mi nut os de r eacci n.
3odas l as enzi mas t i enen un p4 pt i mo en donde t i enen mayor
act i vi dad y a medi da que se al e+ an de ese p4 - par a am%os l ados.
di smi nuyen su act i vi dad. "st o se de%e a que al gunos r est os ami noac di cos
de l as enzi mas - en el caso de que sean pr ot e nas. t i enen car gas y pueden
ser l os r esponsa%l es t ant o de mant ener l a est r uct ur a t r i di mensi onal de l a
prot e na como de i nt er acci onar con el sust r at o. "l p4 del medi o - es deci r l a
presenci a de i ones 4
G
u N4
-
. puede modi # i car l as car gas de est os
ami no!ci dos y de est e modo i ncl uso desnat ur al i zar a l a enzi ma.
:e%emos acl ar ar que aunque l a enzi ma t enga act i vi dad al p4 sal i val
de cada per sona - si empr e ent r e * y 6 seg)n l a t a%l a. est o no qui ere deci r
que $st e sea su p4 pt i mo. /ar a det ermi nar l o e,per i ment al ment e
de%er amos ha%er medi do l a act i vi dad enzi m!t i ca a di # er ent es p4 par a
r eal i zar una cur va per o no podemos det er mi nar el p4 pt i mo de l a - ami l asa
a part i r de l os r esul t ados de est e 3/.
"n el t r at ami ent o del ef ect o de l a t emper at ur a se mi de l a act i vi dad
enzi m!t i ca como se e# ect u en l a part e ' per o i ncu%ando l a r eacci n a
t emper at ur as di # er ent es de A9B &: a <B & a t emperat ur a am%i ent e y a 9<B &.
A <B & y a 9<B & no se pr esent aron cam%i os de col or en l os t u%os de
l a gr adi l l a es deci r que el col or azul nunca desapar eci . /or l o t ant o se
podr a deci r que l a CD ami l asa no act u. "n cam%i o a t emperat ur a am%i ent e
s se present ar on cam%i os per o en un t i empo mayor al de r e# erenci a del
gr upo que l o r eal i z. "st o era de esperar se ya que cada enzi ma t i ene un
r ango de t emper at ur a pt i ma y en el caso de l a CD ami l asa al encont rar se
$st a en el cuer po humano - que si empr e t i ene una t emper at ur a de A9B &. se
supone que a t emper at ur a am%i ent e no va a per der su act i vi dad per o s
di smi nui r l a ya que l os choques i nt ermol ecul ar es van a ser menor es.
8i n em%ar go al di smi nui r demasi ado l a t emper at ur a l os choques
ent r e l as mol $cul as di smi nuyen t am%i $n por l o que l a act i vi dad enzi m!t i ca
%a+ a hast a el punt o en el que no se puede ver en el e,per i ment o. /or el
cont r ar i o al aument ar l a t emperat ur a de i ncu%aci n a 9<B & l os choques
ent r e l as mol $cul as se van a acr ecent ar de t al # orma que l a enzi ma se va a
desnat ur al i zar . "s por el l o que se pr esume que no se o%ser var on cam%i os en
l os t u%os.